一种用特异性PCR引物检测花椒的方法.pdf

《一种用特异性PCR引物检测花椒的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种用特异性PCR引物检测花椒的方法.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610067833.9 (22)申请日 2016.01.30 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 山西大学 地址 030006 山西省太原市小店区坞城路 92 号 (72)发明人 张福生 王丹丹 许晓双 秦雪梅 张丽增 (74)专利代理机构 山西五维专利事务所 ( 有限 公司 ) 14105 代理人 张福增 (54) 发明名称 一种用特异性 PCR 引物检测花椒的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种用特异性 PCR 引物检测花 椒的方法， 其是基于花椒的 ITS 序列， 设。

2、计出 6 对 可快速检测花椒的特异性引物， 并在此基础上建 立了 PCR 检测体系， 可扩增出 520bp 左右的单一 DNA 条带， 为花椒的药材鉴别提供了分子鉴定依 据。根据该特异性引物建立的检测方法， 操作简 便， 特异性好， 灵敏度高， 可实现对花椒的检测， 适 于广泛的推广使用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 105506159 A 2016.04.20 CN 105506159 A 1.一种检测花椒的特异性PCR引物， 其是如下6对引物中的任意一对： (1)上游引物F1： 5 GCAA。

3、TGCGAGCACTGCTT3 下游引物R1： 5 TCGTTCCCCGTGGGGGCGA3 (2)上游引物F2： 5 GCAATGCGAGCACTGCTT3 下游引物R2： 5 CGGGTGCGGGACTAGTCT3 (3)上游引物F3： 5 CACTGCTTGCGCAGAGCT3 下游引物R3： 5 TCGTTCCCCGTGGGGGCGA3 (4)上游引物F4： 5 CACTGCTTGCGCAGAGCT3 下游引物R4： 5 CGGGTGCGGGACTAGTCT3 (5)上游引物F5： 5 TATGAGTCCCGAAACAGGGG3 下游引物R5： 5 TCGTTCCCCGTGGGGGCG。

4、A3 (6)上游引物F6： 5 TATGAGTCCCGAAACAGGGG3 下游引物R6： 5 CGGGTGCGGGACTAGTCT3 。 2.一种用特异性PCR引物检测花椒的方法， 包括以下步骤： 1)提取样品中的DNA； 2)以步骤1)中提取的DNA为模板， 使用上述引物中的任意一对进行PCR扩增反应； 其中， PCR扩增反应体系以25 l计为： PCR反应条件为： 935min； 9330s， 6930s； 7230s， 共30个循环； 725min， 10 10min； 3)分析PCR产物， 即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 根据电泳检测结果判定 样品是否为花椒： PCR扩增反。

5、应结束后， 若电泳检测结果在520bp左右处有单一DNA条带， 则 该样品为花椒。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105506159 A 2 一种用特异性PCR引物检测花椒的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物的分子生物学检测技术， 具体涉及一种采用特异性引物PCR检测 花椒的方法。 背景技术 0002 花椒， 为芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum)植物， 是我国常用的温里药， 味 辛， 性温， 归脾、 胃、 肾经， 具有 “温中止痛， 杀虫止痒” 的功效。 花椒不论作为药物还是食品都 有悠久的历史， 在中国已有2000多年的种植和使用历史。 在 中华人民共和国药。

6、典 (2015 版)中收载的花椒为芸香科植物青椒ZanthoxylumschinifoliumSieb.etZucc.或花椒 ZanthoxylumbungeanumMaxim.的干燥成熟果皮， 用于治疗脘腹冷痛， 呕吐泄泻， 虫积腹 痛； 外治湿疹， 阴痒。 花椒是一种具有较高的食用和药用价值的植物资源， 含有多种对人体 有益的活性成分， 其主要活性成分为挥发油、 生物碱、 脂肪酸、 香豆素等， 现代药理研究表 明， 花椒具有调整胃肠运动、 抗菌、 杀虫、 抑制血小板凝集、 抗菌、 抗肿瘤、 抗氧化等作用， 有 较好的临床应用价值和研发潜力。 花椒种类繁多， 全国有秦椒、 川椒、 岩椒等几十。

7、种品种， 并 且全国各地有很多的习用品以及混伪品， 严重影响了花椒的质量。 0003 花椒的常见混淆品有芸香科植物竹叶椒(ZanthexylumarmatumDC.)、 巴氏吴茱 萸(EvodiababeriRehdetWils.)、 胡椒科植物胡椒(PipernigrumLinn.)还有樟科植物 山胡椒(LinderaglaucaB1)的成熟果实等。 花椒、 竹叶椒、 巴氏吴茱萸、 胡椒、 山胡椒为五 种不同的香料植物， 如混合或混淆入药， 均将改变其传统的用药习惯， 影响疗效， 甚至出现 不良反应。 有学者曾针对花椒进行过真伪鉴别， 传统的鉴别方法包括： 基源鉴定、 性状鉴定、 显微鉴定等。

8、， 现代的鉴别方法包括： 红外光谱法、 核磁共振氢谱法、 电子鼻技术等， 分子生物 学手段包括： rDNAITS区序列比对分析、 cpDNAtrnL-F间隔区序列比对分析等。 核糖体基因 内部转录间隔区(ITS)序列存在于高度重复的核糖体中， 进化速度快且长度不大， 加上协同 进化使该片段在基因组不同单元间十分一致， 因而适合进行各种分子操作。 由于该区域受 外界环境因素的影响较小， 进化速度快， 因而具有种内变异小而种间变异大的特点， 是种类 鉴定和系统发育分析的重要分子标记， 可用于生物的分类、 系统发育和遗传多样性的研究。 0004 本发明结合以上方法和技术的优点， 依据分子标记技术的原。

9、理和原则， 设计出6对 花椒特异性PCR鉴别引物， 目的是提供一种特异性区分花椒的分子鉴别方法， 并希望得到广 泛的实际应用推广。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种检测花椒的特异性PCR引物， 以及用该特异性PCR引物快 速、 准确地检测花椒的方法。 0006 为实现上述目的， 本发明提供的技术方案为： 0007 一种检测花椒的特异性PCR引物， 其是如下6对引物中的任意一对： 0008 (1)上游引物F1： 5 GCAATGCGAGCACTGCTT3 说明书 1/4 页 3 CN 105506159 A 3 0009 下游引物R1： 5 TCGTTCCCCGTGGGGGCGA3 0。

10、010 (2)上游引物F2： 5 GCAATGCGAGCACTGCTT3 0011 下游引物R2： 5 CGGGTGCGGGACTAGTCT3 0012 (3)上游引物F3： 5 CACTGCTTGCGCAGAGCT3 0013 下游引物R3： 5 TCGTTCCCCGTGGGGGCGA3 0014 (4)上游引物F4： 5 CACTGCTTGCGCAGAGCT3 0015 下游引物R4： 5 CGGGTGCGGGACTAGTCT3 0016 (5)上游引物F5： 5 TATGAGTCCCGAAACAGGGG3 0017 下游引物R5： 5 TCGTTCCCCGTGGGGGCGA3 0018 。

11、(6)上游引物F6： 5 TATGAGTCCCGAAACAGGGG3 0019 下游引物R6： 5 CGGGTGCGGGACTAGTCT3 0020 一种用特异性PCR引物检测花椒的方法， 包括以下步骤： 0021 1)提取样品中的DNA； 0022 2)以步骤1)中提取的DNA为模板， 使用上述引物中的任意一对进行PCR扩增反应； 0023 3)分析PCR产物， 即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 根据电泳检测结果 判定样品是否为花椒。 0024 其中， PCR扩增反应体系以25 l计为： 0025 0026 PCR反应条件为： 935min； 9330s， 6930s； 7230s，。

12、 共30个循环； 725min， 10 10min。 0027 PCR扩增反应结束后， 若电泳检测结果出现约520bp左右的单一DNA条带， 则该样品 中含有花椒。 0028 本发明基于花椒的ITS序列， 设计出可快速检测花椒的特异性引物， 并在此基础上 建立PCR检测体系， 为花椒的鉴别提供了分子鉴定依据。 根据该特异性引物建立的检测方 法， 操作简便， 特异性好， 灵敏度高， 可实现对花椒的检测， 适于广泛的推广使用。 附图说明 0029 图1是利用6对花椒特异性引物分别对嘉华花椒和青椒PCR扩增后产物的琼脂糖凝 胶电泳图， 其中1-1、 2-1、 3-1、 4-1、 5-1、 6-1的D。

13、NA模板为嘉华花椒， 1-2、 2-2、 3-2、 4-2、 5-2、 6-2的DNA模板为青椒， 产物条带分别为515bp、 532bp、 505bp、 522bp、 478bp、 485bp； M为DL 2000DNAMarker。 0030 图2是利用第6对花椒特异性引物扩增不同浓度的嘉华花椒的琼脂糖凝胶电泳图， 其中1-6号DNA浓度分别为4.143ng/l、 2.0715ng/l、 1 .381ng/l、 1 .03575ng/l、 说明书 2/4 页 4 CN 105506159 A 4 0.8286ng/ l、 0.4143ng/ l时的嘉华花椒PCR产物条带， 产物485bp；。

14、 M为DL2000DNA Marker。 0031 图3是利用6对花椒特异性引物分别对同仁堂花椒和万民花椒PCR扩增后产物的琼 脂糖凝胶电泳图， 其中1-3、 2-3、 3-3、 4-3、 5-3、 6-3的DNA模板为同仁堂花椒， 1-4、 2-4、 3-4、 4-4、 5-4、 6-4的DNA模板为万民花椒； 1-3、 1-4的引物为第1对引物对， 2-3、 2-4的引物为第2 对引物对， 3-3、 3-4的引物为第3对引物对， 4-3、 4-4的引物为第4对引物对， 5-3、 5-4的引物 为第5对引物对， 6-3、 6-4的引物为第6对引物对； 产物的条带分别为515bp、 532bp。

15、、 505bp、 522bp、 478bp、 485bp； M为DL2000DNAMarker。 具体实施方式 0032 以下实施例用于说明本方法， 但不用来限制本发明的范围。 0033 若未特别指明， 以下实施例均按照常规实验条件， 如Sambrook等分子克隆实验手 册(NewYork： GoldSpringHarborLaboratoryPress， 1989)中所述的操作技术规程， 或 按照制造厂商所建议的实验条件； 所用原料均为市售商品。 0034 实施例1用于检测花椒的PCR引物的合成 0035 从GenBank中共获得花椒ITS序列4条， 同时对所有花椒和青椒样品进行测序， 利用。

16、 生物学软件DNAStar比对上述序列， 找出花椒所区别于其他种的变异位点。 根据变异位点的 位置， 在ITS序列的上下游设计约20个碱基的引物； 利用生物学软件Primer5.0对设计的引 物进行分析， 最终确定花椒合适的引物对。 0036 花椒特异性引物对： 0037 (1)上游引物F1： 5 GCAATGCGAGCACTGCTT3 0038 下游引物R1： 5 TCGTTCCCCGTGGGGGCGA3 0039 (2)上游引物F2： 5 GCAATGCGAGCACTGCTT3 0040 下游引物R2： 5 CGGGTGCGGGACTAGTCT3 0041 (3)上游引物F3： 5 CAC。

17、TGCTTGCGCAGAGCT3 0042 下游引物R3： 5 TCGTTCCCCGTGGGGGCGA3 0043 (4)上游引物F4： 5 CACTGCTTGCGCAGAGCT3 0044 下游引物R4： 5 CGGGTGCGGGACTAGTCT3 0045 (5)上游引物F5： 5 TATGAGTCCCGAAACAGGGG3 0046 下游引物R5： 5 TCGTTCCCCGTGGGGGCGA3 0047 (6)上游引物F6： 5 TATGAGTCCCGAAACAGGGG3 0048 下游引物R6： 5 CGGGTGCGGGACTAGTCT3 0049 引物合成由上海桑尼生物科技有限公司完。

18、成。 0050 实施例2利用PCR引物检测花椒的特异性和灵敏度分析 0051 1.1样品来源 0052 本实施例中采用的药材样品(见表1)分别购自于山西省太原市不同的药房或者来 自于山西省中医药研究院。 0053 表1花椒(青椒)样品表 说明书 3/4 页 5 CN 105506159 A 5 0054 0055 1.2DNA提取 0056 将上述样品， 每个样品取约60mg， 用液氮研磨成粉末， 利用试剂盒法提取DNA。 试剂 盒购自北京艾德莱生物科技有限公司， 型号为： CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(货号： DN14)， 50次。 0057 1.3样品DNA的梯度稀释 0058 。

19、检测上述提取的嘉华花椒DNA的浓度， 为41.43ng/ l。 将DNA样品进行梯度稀释， 稀 释后的浓度分别为4.143ng/ l、 2.0715ng/ l、 1.381ng/ l、 1.03575ng/ l、 0.8286ng/ l、 0.4143ng/ l， 于-20保存备用。 0059 1.4PCR反应 0060 反应体系(25 l) 0061 0062 PCR反应条件为： 935min； 9330s， 6930s； 7230s， 共30个循环； 725min， 10 10min。 0063 1.5结果 0064 取扩增产物5 l， 在1.2琼脂糖凝胶上进行电泳， 电压为138V， 2。

20、3min后在ZF-258 全自动凝胶成像分析系统检测电泳结果， 特异性引物在520bp左右扩增出单一的DNA条带， 证明所检样品为花椒， 电泳检测结果如图1所示。 上述结果表明实施例1中设计的引物特异 性强。 0065 分别以上述稀释的DNA样品为模板进行PCR扩增反应。 PCR扩增程序和扩增产物检 测方法同上(点样量为5 l)。 结果如图2所示， 当花椒DNA模板稀释至时0.8286ng/ l， PCR扩 增的条带不是特别明显。 因此， 上述引物对对花椒的检测灵敏度可达0.8286ng/ l， 即可检 出样品中约4.4143ng的花椒。 0066 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之做一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 4/4 页 6 CN 105506159 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 105506159 A 7 图3 说明书附图 2/2 页 8 CN 105506159 A 8 。