技术领域
本发明涉及川芎嗪衍生物，特别涉及川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物及其制备方法和应用，属于抗心脑血管疾病药物技术领域。
背景技术
心脑血管疾病是严重危害人类健康的一种疾病，具有“高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率，多并发症”即“四高一多”的特点。据统计，全世界由各种心脑血管疾病导致的死亡人数高居各种死亡病因的首位。在我国，心脑血管疾病发病率不断升高，每年由心脑血管疾病导致的死亡数近300万，在严重威胁人类健康的同时，也给社会带来沉重的经济负担。因此，研究开发心脑血管药物仍是药物研究的重要内容之一。
中药川芎是伞形科植物川芎的干燥根茎，具有开郁燥湿、祛风止痛等功效。川芎嗪是从川芎中分离出的生物碱，为其主要有效成分，化学结构为2,3,5,6-四甲基吡嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)，结构式如下所示：
川芎嗪具有扩张血管、抗血小板聚集、清除自由基等多种多样的药理作用，因此在临床上广泛用于缺血性脑血管疾病和冠状动脉粥样硬化等疾病的治疗。然而川芎嗪在体内药代动力学研究显示，其生物利用度低、代谢快、半衰期短等特点使其应用受到限制（参见程先超等，川芎嗪的结构改造及修饰，药学进展，2005，6(29)，241-246）。因此以川芎嗪为先导化合物，对其进行结构修饰和改造，对研发新一代川芎嗪类心脑血管药物具有重要的意义。
根据药物设计中的拼合原理，本课题组曾将川芎嗪与带有酚羟基的肉桂酸类取代基结合，得到一系列川芎嗪肉桂酸酚醚类衍生物，并对其进行了ADP诱导的血小板聚集的抑制活性实验和保护血管内皮细胞过氧化损伤的活性实验，发现了部分有较高抗血小板聚集活性和对血管内皮细胞具有较好的保护活性的化合物。（参见HongfeiChen,GuoningLi,PengZhan,XinyongLiu,Ligustrazinederivatives.Part5:Design,synthesisandbiologicalevaluationofnovelligustrazinyloxy-cinnamicacidderivativesaspotentcardiovascularagents,EuropeanJournalofMedicinalChemistry，2011,46,5609-5615）在此基础上，对川芎嗪进行进一步结构修饰，设计合成了川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物，以期发现新一代川芎嗪类心脑血管药物。
发明内容
本发明是提供一种川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物及其制备方法和应用，该类衍生物具有更好的抗血小板聚集、保护血管内皮细胞的功能。
本发明采取的技术方案为：
川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物，具有如下结构通式：
其中R为氢、羟基、卤素原子取代基或甲氧基中的一种或多种组合，R′为-H、-CH3或-C2H5。
所述的川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物，优选：
(E)-3-(4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸乙酯，(E)-3-(3-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸，(E)-3-(2-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸，(E)-3-(4-甲氧基-3-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸，(E)-3-(3-羟基-4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸，(E)-3-(3-羟基-4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸乙酯。
上述川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物的制备方法，包括步骤如下：
（1）取川芎嗪溶于水中，30-40°C条件下搅拌缓慢加入KMnO4的水溶液，反应10-30h，TLC监测反应完全后，向反应液中加入亚硫酸氢钠饱和水溶液至高锰酸钾紫红色完全褪去，过滤混合液，滤渣用热水（30-40°C）清洗，合并滤液，浓盐酸调解pH=2-3，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂得3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酸；
（2）取3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酸溶于无水二氯甲烷，冰浴条件下加入草酰氯，搅拌反应0.5-1h，TLC监测至反应完全后，减压蒸除剩余溶剂和草酰氯，得到3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰氯；
（3）将取代苯甲醛溶于吡啶，加入丙二酸和哌啶，于120°C下反应1-2h，TLC监测反应完毕后，蒸除吡啶，残余物加水溶解，以HCl调pH为2-3，乙酸乙酯萃取，有机层干燥，过滤，蒸除溶剂，得取代肉桂酸；
（4）取步骤（2）的3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰氯溶于无水二氯甲烷中，室温搅拌下加入取代肉桂酸、三乙胺，20-30°C反应0.5-1h，TLC监测反应完全后，蒸除剩余溶剂，残留物溶于乙酸乙酯，分别用水、饱和NaCl水溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩得粗品，经快速柱分离，乙醇重结晶得纯品川芎嗪甲酰氧基肉桂酸；
（5）取川芎嗪甲酰氧基肉桂酸溶于乙醇溶液中，冰浴条件下逐滴加入氯化亚砜，反应液加热回流24h，TLC监测至反应完全，蒸除剩余溶剂，残余物溶于乙酸乙酯，分别用水、饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层由无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，快速柱分离，正己烷重结晶得产品。
上述制备方法中：
步骤（1）所述的川芎嗪与KMnO4的摩尔比为1:1~4，优选1:4，川芎嗪与水的质量/体积比为1：25，g/mL。
步骤（2）中3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酸与草酰氯的摩尔比为1:1~2，优选1:1，3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酸与无水二氯甲烷的质量/体积比为1:25，g/mL。
步骤（3）中取代苯甲醛、丙二酸和哌啶的摩尔比为1:1:0.1，取代苯甲醛与吡啶的质量/体积比为1:25，g/mL。取代苯甲醛是：4-羟基苯甲醛、3-羟基苯甲醛、2-羟基苯甲醛、3-甲氧基-4-羟基苯甲醛、3-羟基-4-甲氧基苯甲醛、2-羟基-3-甲氧基苯甲醛、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、2-羟基-5-甲氧基苯甲醛、4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛、3,4-二羟基苯甲醛、2-羟基-5-氯苯甲醛、或3,4,5-三羟基苯甲醛。
步骤（4）中3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰氯、取代肉桂酸、三乙胺的摩尔比为1:1:3，3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰氯与无水二氯甲烷的质量/体积比为1:25-30，g/mL。
步骤（5）中川芎嗪甲酰氧基肉桂酸与氯化亚砜的摩尔比为1:1.2，川芎嗪甲酰氧基肉桂酸与乙醇的质量/体积比为1:30，g/mL。
川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物的合成路线如下：
上述反应式中，其中R为H、OH、卤原子或甲氧基或这些取代基的自由组合，R′为H或C2H5。试剂：(i)丙二酸，吡啶，哌啶，120°C，(ii)KMnO4，H2O，35°C，(iii)草酰氯，二氯甲烷，冰浴，(iv)Et3N，二氯甲烷，rt，(v)EtOH，SOCl2，回流。
表1.合成的川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物
本发明的川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物可作为抗血小板聚集药物或血管内皮细胞保护药物应用。具体地说，作为抗血小板聚集药物或血管内皮细胞保护药物用于制备抗心脑血管疾病药物。在活性试验中表现出了良好的活性，证明该类化合物具有进一步研发的价值，可作为抗心脑血管疾病的先导化合物加以利用。
一种抗心脑血管疾病药物组合物，由本发明的川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物和药学上可接受的辅料组成。
与现有技术比本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明的川芎嗪酸是从川芎嗪由KMnO4进行直接氧化得到。而现有技术路线则是将川芎嗪经单氮氧化，Boekelheide重排，水解，氧化的过程而制得川芎嗪酸。其中单氮氧化，水解反应两步反应耗时较长，而Boekelheide重排需要高温无水，反应条件苛刻，总反应收率低。本发明将川芎嗪直接以KMnO4氧化，通过控制反应温度及反应时间，一步得到川芎嗪酸，收率较高，可达60%以上。
与川芎嗪酰基哌嗪和川芎嗪酰胺相比，川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物是将川芎嗪甲酰基与各种肉桂酸结合而得到的化合物。川芎嗪酰基哌嗪是用哌嗪环将川芎嗪与乙酰水杨酰基，烟酰基等拼合而成，而川芎嗪酰胺则是将川芎胺与水杨酰基，2-吡啶酰基等拼合而成。与这两类化合物中的基团相比，川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物中的肉桂酸基团具有确切的抗血小板聚集活性和抗氧化活性，且在体内能以相对较快的速度水解产生酚羟基，以发挥抗氧化作用。另外川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物不具有钙通道阻滞剂的副作用，且不会产生胺类物质。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明。
实施例1.3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰氯的制备
取川芎嗪（13.6g，0.1mol）溶于水，缓慢加入KMnO4（63.2g，0.4mol）的水溶液，于35°C搅拌反应24h。TLC监测至反应完全，向反应液中加入亚硫酸氢钠饱和水溶液至高锰酸钾紫红色完全褪去，过滤混合液，滤渣用热水（30-40°C）清洗，合并滤液，浓盐酸调解pH=2-3，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂。固体以乙酸乙酯重结晶，得3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酸，产率67%。取0.1mol3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酸溶于无水二氯甲烷，冰浴条件下加入0.1mol草酰氯，搅拌反应0.5h，TLC监测至反应完全后，减压蒸除剩余溶剂和草酰氯，得到3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰氯。
实施例2.(E)-3-(4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸(F1)的制备
取反式4-羟基肉桂酸(0.33g,2mmol)，溶于10mL二氯甲烷，加入三乙胺(0.51g,6mmol)，搅拌5min，加入3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰氯(0.37g,2mmol)，室温下搅拌反应2h。TLC监测反应完毕后，减压蒸除溶剂，残余物加入50mL乙酸乙酯，水洗，有机层以无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，将得到的粗品快速柱分离(乙酸乙酯：环己烷=1：5)，乙醇重结晶得产物，产率63%，mp:212-214°C。1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):12.46(s,1H,COOH)，7.82(d，2H，Ar-H，J=8.4Hz)，7.65(d，1H，Ar-CH=C，J=15.6Hz)，7.35(d，2H，Ar-H，J=7.8Hz),6.57(d,1H,C=CH-C=O,J=15.6Hz),2.72(s,3H,CH3),2.57(s,3H,CH3),2.55(s,3H,CH3).IR(KBr，cm-1):3400(OH),2925(CH3),1743,1693(C=O),1628(C=C),1599,1583,1506(C=N,C=C),1164(C-O).ESI-MS:313.3(M+H)+,calcd.forC17H16N2O4312.32.
实施例3.(E)-3-(3-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸(F2)的制备
取3-羟基肉桂酸(0.33g,2mmol)，溶于10mL二氯甲烷，加入三乙胺(0.51g,6mmol)，搅拌5min，加入3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰氯(0.37g,2mmol)，室温下搅拌反应2h。TLC监测反应完毕后，减压蒸除溶剂，残余物加入50mL乙酸乙酯，水洗，有机层以无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，将得到的粗品快速柱分离(乙酸乙酯：环己烷=1：5)，乙醇重结晶得产物，产率54%,mp:208-210°C.1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):12.50(s,1H,COOH),7.68-7.61(m，3H，Ar-H，Ar-CH=C)，7.54(t，1H，Ar-H)，7.36(dd，1H，Ar-H，J1=1.2Hz，J2=7.8Hz)，6.63(d，1H,C=CH-C=O,J=16.2Hz),2.73(s,3H,CH3),2.57(s,3H,CH3),2.55(s,3H,CH3).IR(KBr，cm-1):3450(OH),2966,2852(CH3),1736,1692(C=O),1631(C=C),1580,1539(C=N,C=C),1172(C-O).ESI-MS:313.4(M+H)+,calcd.forC17H16N2O4312.32.
实施例4.(E)-3-(2-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸(F3)的制备
取2-羟基肉桂酸(0.33g,2mmol)，溶于10mL二氯甲烷，加入三乙胺(0.51g,6mmol)，搅拌5min，加入3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰氯(0.37g,2mmol)，室温下搅拌反应2h。TLC监测反应完毕后，减压蒸除溶剂，残余物加入50mL乙酸乙酯，水洗，有机层以无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，将得到的粗品快速柱分离(乙酸乙酯：环己烷=1：5)，乙醇重结晶得产物，产率57%,mp:204-206°C.1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):12.48(s,1H,COOH),7.94(d,1H,Ar-H,J=7.8Hz),7.67(d,1H,Ar-CH=C,J=15.6Hz),7.56-7.53(t,1H,Ar-H),7.42-7.38(m,2H,Ar-H),6.75(d,1H,C=CH-C=O,J=15.6Hz),2.71(s,3H,CH3),2.58(s,3H,CH3),2.50(s,3H,CH3).IR(KBr,cm-1):3450(OH),2980,2929(CH3),1733,1692(C=O),1627(C=C),1577,1543(C=N,C=C),1166(C-O).ESI-MS:313.4(M+H)+,calcd.forC17H16N2O4312.32.
实施例5.(E)-3-(3-甲氧基-4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸(F4)的制备
取3-甲氧基-4-羟基肉桂酸(0.38g,2mmol)，溶于11.4mL二氯甲烷，加入三乙胺(0.51g,6mmol)，搅拌5min，加入3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰氯(0.37g,2mmol)，室温下搅拌反应2h。TLC监测反应完毕后，减压蒸除溶剂，残余物加入50mL乙酸乙酯，水洗，有机层以无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，将得到的粗品快速柱分离(乙酸乙酯：环己烷=1：5)，乙醇重结晶得产物，产率61%,mp:214-218°C.1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):12.44(s,1H,COOH)，7.63(d，1H，Ar-CH=C，J=15.6Hz)，7.56(s，1H，Ar-H)，7.34(d，1H，Ar-H，J=7.8Hz)，7.30(d,1H,Ar-H,J=7.8Hz),6.65(d,1H,C=CH-C=O,J=16.2Hz),3.85(s,3H,OCH3),2.70(s,3H,CH3),2.56(s,3H,CH3),2.51(s,3H,CH3).IR(KBr,cm-1):3422(OH),2924,2852(CH3),1745,1696(C=O),1630(C=C),1591(C=N,C=C),1152(C-O).ESI-MS:343.4(M+H)+,calcd.forC18H18N2O5342.35.
实施例6.(E)-3-(4-甲氧基-3-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸(F5)的制备
取3-羟基-4-甲氧基肉桂酸(0.38g,2mmol)，溶于11.4mL二氯甲烷，加入三乙胺(0.51g,6mmol)，搅拌5min，加入3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰氯(0.37g,2mmol)，室温下搅拌反应2h。TLC监测反应完毕后，减压蒸除溶剂，残余物加入50mL乙酸乙酯，水洗，有机层以无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，将得到的粗品快速柱分离(乙酸乙酯：环己烷=1：5)，乙醇重结晶得产物，产率64%,mp:202-204°C.1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):12.36(s,1H,COOH),7.68-7.61(m,3H,Ar-H,Ar-CH=C),7.24(d,1H,Ar-H,J=8.4Hz),6.48(d,1H,C=CH-C=O,J=16.2Hz),3.84(s,3H,OCH3),2.71(s,3H,CH3),2.57-2.49(m,6H,CH3×2).IR(KBr,cm-1):3488(OH),2957,2927,2848(CH3),1753,1720(C=O),1636(C=C),1610(C=N,C=C),1161(C-O).ESI-MS:343.5(M+H)+,calcd.forC18H18N2O5342.35.
实施例7.(E)-3-(4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸乙酯(F′1)的制备
取(E)-3-(4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸(0.62g,2mmol)溶于乙醇中，冰浴条件下缓慢滴加2.4mmol氯化亚砜，滴毕加热回流24h。TLC监测至反应完全，蒸除剩余溶剂，残余物溶于乙酸乙酯，分别用水、饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层由无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品。快速柱分离，正己烷重结晶，产率81%,mp:77-80°C.1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):7.82(d,2H,Ar-H,J=8.4Hz),7.65(d,1H,Ar-CH=C,J=15.6Hz),7.35(d,2H,Ar-H,J=7.8Hz),6.57(d,1H,C=CH-C=O,J=15.6Hz),4.23(q,2H,OCH2),2.72(s,3H,CH3),2.57(s,3H,CH3),2.55(s,3H,CH3),1.30(t,3H,CH3).IR(KBr,cm-1):3063(C=C-H),2988,2929(CH3),1747,1712(C=O),1642(C=C),1601,1541,1509(C=N,C=C),1169(C-O).ESI-MS:341.4(M+H)+,calcd.forC19H20N2O4340.37.
实施例8.(E)-3-(3-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸乙酯(F′2)的制备
取(E)-3-(3-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸(0.62g,2mmol)溶于乙醇中，冰浴条件下缓慢滴加2.4mmol氯化亚砜，滴毕加热回流24h。TLC监测至反应完全，蒸除剩余溶剂，残余物溶于乙酸乙酯，分别用水、饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层由无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品。快速柱分离，正己烷重结晶，产率81%,mp:87-91°C.1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):7.68-7.61(m，3H，Ar-H，Ar-CH=C)，7.54(t，1H，Ar-H)，7.36(dd，1H，Ar-H，J1=1.2Hz，J2=7.8Hz),6.63(d,1H,C=CH-C=O,J=16.2Hz),2.73(s,3H,CH3),4.23(q,2H,OCH2),2.57(s,3H,CH3),2.55(s,3H,CH3),1.30(t,3H,CH3).IR(KBr,cm-1):3061(C=C-H),2977,2927(CH3),1731,1716(C=O),1637(C=C),1604,1583,1541(C=N,C=C),1169(C-O).ESI-MS:341.4(M+H)+,calcd.forC19H20N2O4340.37.
实施例9.(E)-3-(2-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸乙酯(F′3)的制备
取(E)-3-(2-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸(0.62g,2mmol)溶于乙醇中，冰浴条件下缓慢滴加2.4mmol氯化亚砜，滴毕加热回流24h。TLC监测至反应完全，蒸除剩余溶剂，残余物溶于乙酸乙酯，分别用水、饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层由无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品。快速柱分离，正己烷重结晶，产率81%,mp:77-79°C.1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):12.48(s，1H，COOH)，7.94(d，1H，Ar-H，J=7.8Hz)，7.67(d，1H，Ar-CH=C，J=15.6Hz)，7.56-7.53(t,1H,Ar-H),7.42-7.38(m,2H,Ar-H),6.75(d,1H,C=CH-C=O,J=15.6Hz),4.23(q,2H,OCH2),2.71(s,3H,CH3),2.58(s,3H,CH3),2.50(s,3H,CH3),1.30(t,3H,CH3).IR(KBr,cm-1):3080(C=C-H),2988,2957(CH3),1745,1705(C=O),1629(C=C),1601,1577,1541(C=N,C=C),1151(C-O).ESI-MS:341.4(M+H)+,calcd.forC19H20N2O4340.37.
实施例10.(E)-3-(3-甲氧基-4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸乙酯(F′4)的制备
取(E)-3-(3-甲氧基-4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-羰基)氧)苯基)丙烯酸(0.68g,2mmol)溶于乙醇中，冰浴条件下缓慢滴加2.4mmol氯化亚砜，滴毕加热回流24h。TLC监测至反应完全，蒸除剩余溶剂，残余物溶于乙酸乙酯，分别用水、饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层由无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品。快速柱分离，正己烷重结晶，产率81%,mp:107-110°C.1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):7.70(d,1H,Ar-CH=C,J=16.2Hz),7.61(s,1H,Ar-H),7.38(d,1H,Ar-H,J=7.8Hz),7.31(d,1H,Ar-H,J=8.4Hz),6.77(d,1H,C=CH-C=O,J=15.6Hz),4.23(q,2H,OCH2),3.86(s,3H,OCH3),2.70(s,3H,CH3),2.56(s,3H,CH3),2.51(s,3H,CH3),1.30(t,3H,CH3).IR(KBr,cm-1):3064(C=C-H),2983,2928(CH3),1737,1703(C=O),1676(C=C),1601,1510(C=N,C=C),1158(C-O).ESI-MS:371.4(M+H)+,calcd.forC20H22N2O5370.40.
川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物的活性筛选试验：
对川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物进行了抗血小板聚集试验，实验步骤如下：
家兔心脏取血，以3.8%的枸椽酸钠抗凝(v/v血：抗凝剂=9：1)，静置30min后，将其1000rpmin离心5min后取上清液即得富含血小板血浆(PRP)，将剩余部分以3000rpmin离心15min后取上清液即得贫血小板血浆(PPP)。用PPP将PRP调数为3×1011/L备用(显微镜下用计数板计数)。制备好的PRP应在2h内用完。
取90μLPRP，加入96孔板中，加入5μL待测药品(终浓度400,200,100,50μM)，37℃温育振摇5min。将96孔板置于酶标仪上，快速震摇10S，570nm下测定吸光度，每30S测定一次，连续测3次，记各孔三次吸光度均值为A0。之后加入5μLADP(工作浓度5μM)，继续每30S测定一次吸光度直至吸光度不再变化，记平行孔的吸光度均值为A。
结果OD570nm以表示，t检验分析试验组与对照组之间是否有显著性差异，按以下公式计算血小板聚集率(aggregationrate,AR)：AR=(AbsPRP-Abssample)/(AbsPRP-AbsPPP)。同时计算药物对血小板聚集的抑制率(aggregationinhibitionrate,AIR)：AIR=[1-(给药管聚集百分率/对照管聚集百分率)]×100%。用直线回归法求出药物的半数抑制浓度IC50。
以奥扎格雷（ozagrel），氯吡格雷（clopidogrel）为阳性对照，其活性列于表2中。由表2可以看出，化合物F′1,F2,F3显示出了明显的抗血小板聚集活性，IC50分别达到了24.4,26.4和9.59μM，活性强于对照药奥扎格雷（IC50=144μM），其中化合物F3活性最强，接近对照药氯吡格雷（IC50=7.57μM）。
表2.川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物的血小板聚集抑制率
IC50：化合物对血小板聚集的半数抑制浓度
对川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类衍生物还进行了血管内皮细胞损伤保护试验，实验步骤如下：
Ea.hy926细胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中培养24h后，在正常组中加入不含H2O2和药物的正常培养液，在模型组中加入浓度为0.15mmol.L-1H2O2的培养液，在保护组中加入含不同浓度药物且含终浓度为0.15mmol.L-1H2O2的培养液，继续培养12h，然后每孔加入0.01mLMTT溶液(5mg.mL-1)，37℃培养4h，倾去上清液，每孔加入二甲基亚砜0.lmL，放置10min。30min内在全自动酶标仪上于570nm处测定吸光度值(A570nm)，计算Ea.hy926细胞增殖百分率。
结果OD570nm以表示，t检验分析试验组与对照组之间是否有显著性差异，按下式计算细胞增殖率P(%)。
P ( % ) = OD - ODa OD b - ODa × 100 % ]]>
(OD-保护组OD值，ODa-模型组OD值，ODb-正常组OD值)
以硫辛酸（lipoicacid）和丁基羟基茴香醚（BHA）为对照，其活性列于表3中，并。由表3可以看出，化合物F5，F10和F′10显示出了明显的血管内皮细胞损伤保护活性，EC50分别达到了8.84,2.23和1.71μM，活性强于对照药硫辛酸和BHA（EC50分别为68.0μM和111μM），其中化合物F′10活性最强，达到了硫辛酸的40倍。
表3.川芎嗪甲酰氧基肉桂酸类化合物对EA.hy926细胞增殖率及其EC50