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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610057509.9 (22)申请日 2016.01.27 C12P 19/14(2006.01) C12P 19/04(2006.01) (71)申请人 江苏康维生物有限公司 地址 224200 江苏省盐城市东台市高新技术 园区 (72)发明人 朱汉静 朱汉生 刘镏 陈冬劲 (74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理 有限公司 11340 代理人 韩洪 (54) 发明名称 一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方 法 (57) 摘要 本发明适用于纤维寡糖制备的技术领域， 公 开了一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方 法， 包。
2、括如下步骤 ： 制备反应原液、 设定温度及 pH 值、 底物原位吸附、 固液分离处理、 第一次水解处 理、 第二次水解处理、 第三次水解处理和提纯纤维 寡糖。本发明一种纤维素定向三段水解制备纤维 寡糖的方法， 通过低 - 葡萄糖苷酶的纤维素酶 水解低聚木糖生产废渣， 得到含有纤维寡糖的液 相， 通过固液分离方法并提纯得到纤维寡糖， 采用 三段水解模式， 能高效地解除水解过程中产物对 酶的反馈抑制作用， 纤维寡糖的得率大大高于不 分段水解模式下的纤维寡糖得率， 较二段水解模 式也明显提升， 提高了纤维寡糖的生产产量， 成本 较低， 资源利用率高， 可工业化进行纤维寡糖的生 产。 (51)Int.。
3、Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 CN 105524958 A 2016.04.27 CN 105524958 A 1.一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 其特征在于： 包括如下步骤： 步骤一、 制备反应原液： 按1： 20的比例称取底物纤维素和无菌水， 将底物纤维素和无菌 水倒入温度可设定的无菌容器中， 得到底物纤维素浓度为5的反应原液； 步骤二、 设定温度及pH值： 调节无菌容器中的反应原液的pH值为7.0， 设定无菌容器的 温度恒为10； 步骤三、 底物原位吸附： 称取一定量的里氏木霉纤维素酶， 投入经步骤二。
4、处理后的反应 原液中， 搅拌均匀后得到吸附体系， 吸附时间为30min； 步骤四、 固液分离处理： 当吸附时间到达30min时， 将无菌容器中的吸附体系快速倒入 离心机中离心处理， 分离除去吸附体系中的液相， 得到含有适合于纤维寡糖制备的低 -葡 萄糖苷酶纤维素酶的离心沉渣； 步骤五、 第一次水解处理： 将步骤四得到的含有低 -葡萄糖苷酶纤维素酶的离心沉渣 投至无菌容器中， 在无菌容器中补加无菌水至原反应原液的体积， 并调节无菌容器中的反 应体系的pH值为4.80， 无菌容器的温度设定为50， 水解反应一段时间后， 采用固液分离方 法将液相移除； 步骤六、 第二次水解处理： 在经过步骤五第一次。
5、水解处理得到的固体渣中补加一定无 菌水至原反应原液的体积， 调节无菌容器中的反应体系的pH值为4.80， 无菌容器的温度设 定为50， 继续反应一段时间后， 采用固液分离方法将液相移除； 步骤七、 第三次水解处理： 在经过步骤六第二次水解处理后得到的固体渣中继续补加 一定无菌水至原反应原液的体积， 调节无菌容器中的反应体系的pH值为4.80， 无菌容器的 温度设定为50， 继续反应一段时间后， 采用固液分离方法再次将液相移除； 步骤八、 提纯纤维寡糖： 收集经步骤五、 步骤六和步骤七固液分离后的液相， 并提取液 相中的纤维寡糖反应产物， 提纯得到纤维寡糖， 可直接用于饲料添加剂。 2.如权利要。
6、求1所述的一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 其特征在于： 所 述的步骤一中的底物纤维素为低聚木糖生产废渣。 3.如权利要求1所述的一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 其特征在于： 所 述的步骤三中里氏木霉纤维素酶的用量为15FPIU/g底物纤维素。 4.如权利要求1所述的一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 其特征在于： 所 述的步骤五、 步骤六和步骤七中的固液分离方法包括离心法和过滤法。 5.如权利要求1所述的一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 其特征在于： 所 述的步骤五第一次水解处理、 步骤六第二次水解处理和步骤七第三次水解处理的总水解时 间为24h。 6。
7、.如权利要求5所述的一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 其特征在于： 所 述的步骤五第一次水解处理中的水解时间为6h， 步骤六第二次水解处理中的水解时间为 6h。 7.如权利要求5所述的一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 其特征在于： 所 述的步骤五第一次水解处理中的水解时间为6h， 步骤六第二次水解处理中的水解时间为 8h。 8.如权利要求5所述的一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 其特征在于： 所 述的步骤五第一次水解处理中的水解时间为8h， 步骤六第二次水解处理中的水解时间为 权利要求书 1/2 页 2 CN 105524958 A 2 8h。 9.如权利要求5所。
8、述的一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 其特征在于： 所 述的步骤五第一次水解处理中的水解时间为6h， 步骤六第二次水解处理中的水解时间为 12h。 10.如权利要求6所述的一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 其特征在于： 所述的步骤五第一次水解处理中的水解时间为24h。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105524958 A 3 一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法 【技术领域】 0001 本发明涉及纤维寡糖制备的技术领域， 特别涉及一种纤维素定向三段水解制备纤 维寡糖的方法。 【背景技术】 0002 纤维素水解可得纤维寡糖， 纤维寡糖在水中有一定的溶解度， 在有机溶剂。
9、中微溶 或者不容， 纤维寡糖又称纤维低聚糖， 是功能性低聚糖， 可促进矿物质吸收、 为双歧杆菌增 殖因子、 降低血清胆固醇、 增强机体免疫力、 抵抗肿瘤等独特的生理功能， 是人、 动物、 植物 等具有特殊生理作用的低聚糖， 可广泛应用于食品和饲料工业。 0003 纤维素酶是一类能够水解纤维素的 -1， 4-葡萄糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的 总称， 传统上传统上将其分为3类： 内切葡聚糖酶、 外切葡聚糖酶和 -葡萄糖苷酶。 研究表 明， 内切葡聚糖酶的最适底物是聚合度大的长链纤维素， 而 -葡萄糖苷酶的最适底物是聚 合度低的纤维寡糖。 纤维素酶在降解纤维素的过程中， 纤维素酶组分中的 -葡萄糖苷。
10、酶主 要在液相中发生作用， 而水解得到的纤维寡糖也主要溶解在液相中， -葡萄糖苷酶会进一 步水解纤维寡糖， 释放出葡萄糖作为产物。 0004 纤维素酶经过纤维底物吸附后固液分离， 拆分纤维素酶系中大部分的 -葡萄糖苷 酶后获得的低 -葡萄糖苷酶纤维素酶用于水解低聚木糖生产废渣， 可大幅度提高产物中纤 维寡糖的比例， 纤维素酶系中 -葡萄糖苷酶的拆分有利于纤维寡糖得率的提高和水解产物 中纤维寡糖占总糖比例的提高， 但是存在问题是， 纤维寡糖的得率不高， 仅为35左右， 解 决这一问题的关键是在水解过程中将反馈抑制因子纤维寡糖及时从水解反应体系中移走， 解决产物对纤维素酶的抑制作用， 采用二段水解。
11、制备技术较不采用分段式的水解模式的纤 维寡糖的得率明显提升， 但是得率仍然较低， 为了提高纤维寡糖的生产产量， 有必要提出一 种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法。 【发明内容】 0005 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足， 提供一种纤维素定向三段水解制备 纤维寡糖的方法， 其旨在解决现有技术中纤维素酶经纤维底物吸附、 固液分离拆分纤维素 酶系中的 -葡萄糖苷酶后， 纤维寡糖得率较低， 采用二段水解模式纤维寡糖的得率依然不 高的技术问题。 0006 为实现上述目的， 本发明提出了一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 包括如下步骤： 0007 步骤一、 制备反应原液： 按1： 20。
12、的比例称取底物纤维素和无菌水， 将底物纤维素和 无菌水倒入温度可设定的无菌容器中， 得到底物纤维素浓度为5的反应原液； 0008 步骤二、 设定温度及pH值： 调节无菌容器中的反应原液的pH值为7.0， 设定无菌容 器的温度恒为10； 0009 步骤三、 底物原位吸附： 称取一定量的里氏木霉纤维素酶， 投入经步骤二处理后的 说明书 1/4 页 4 CN 105524958 A 4 反应原液中， 搅拌均匀后得到吸附体系， 吸附时间为30min； 0010 步骤四、 固液分离处理： 当吸附时间到达30min时， 将无菌容器中的吸附体系快速 倒入离心机中离心处理， 分离除去吸附体系中的液相， 得到含。
13、有适合于纤维寡糖制备的低 -葡萄糖苷酶纤维素酶的离心沉渣； 0011 步骤五、 第一次水解处理： 将步骤四得到的含有低 -葡萄糖苷酶纤维素酶的离心 沉渣投至无菌容器中， 在无菌容器中补加无菌水至原反应原液的体积， 并调节无菌容器中 的反应体系的pH值为4.80， 无菌容器的温度设定为50， 水解反应一段时间后， 采用固液分 离方法将液相移除； 0012 步骤六、 第二次水解处理： 在经过步骤五第一次水解处理得到的固体渣中补加一 定无菌水至原反应原液的体积， 调节无菌容器中的反应体系的pH值为4.80， 无菌容器的温 度设定为50， 继续反应一段时间后， 采用固液分离方法将液相移除； 0013 。
14、步骤七、 第三次水解处理： 在经过步骤六第二次水解处理后得到的固体渣中继续 补加一定无菌水至原反应原液的体积， 调节无菌容器中的反应体系的pH值为4.80， 无菌容 器的温度设定为50， 继续反应一段时间后， 采用固液分离方法再次将液相移除； 0014 步骤八、 提纯纤维寡糖： 收集经步骤五、 步骤六和步骤七固液分离后的液相， 并提 取液相中的纤维寡糖反应产物， 提纯得到纤维寡糖， 可直接用于饲料添加剂。 0015 作为优选， 所述的步骤一中的底物纤维素为低聚木糖生产废渣。 0016 作为优选， 所述的步骤三中里氏木霉纤维素酶的用量为15FPIU/g底物纤维素。 0017 作为优选， 所述的步。
15、骤五、 步骤六和步骤七中的固液分离方法包括离心法和过滤 法。 0018 作为优选， 所述的步骤五第一次水解处理、 步骤六第二次水解处理和步骤七第三 次水解处理的总水解时间为24h。 0019 作为优选， 所述的步骤五第一次水解处理中的水解时间为6h， 步骤六第二次水解 处理中的水解时间为6h。 0020 作为优选， 所述的步骤五第一次水解处理中的水解时间为6h， 步骤六第二次水解 处理中的水解时间为8h。 0021 作为优选， 所述的步骤五第一次水解处理中的水解时间为8h， 步骤六第二次水解 处理中的水解时间为8h。 0022 作为优选， 所述的步骤五第一次水解处理中的水解时间为6h， 步骤六。
16、第二次水解 处理中的水解时间为12h。 0023 作为优选， 所述的步骤五第一次水解处理中的水解时间为24h。 0024 本发明的有益效果： 与现有技术相比， 本发明提供的一种纤维素定向三段水解制 备纤维寡糖的方法， 步骤简单合理， 拆分去除纤维素酶系中大部分的 -葡萄糖苷酶得到低 -葡萄糖苷酶的纤维素酶， 通过低 -葡萄糖苷酶的纤维素酶水解低聚木糖生产废渣， 得到 含有纤维寡糖的液相， 通过固液分离方法并提纯得到纤维寡糖， 水解采用三段水解方式， 可 以高效的解除水解过程中产物对酶的反馈抑制作用， 且纤维寡糖的得率高于不分段水解模 式下的纤维寡糖得率， 较二段水解模式的纤维寡糖的得率也有明显。
17、的提升， 相同的生产时 间， 三段水解制备纤维寡糖的得率较二段水解提升近16， 大大提高了纤维寡糖的生产产 量， 且方法简单， 成本较低， 资源利用率高， 可工业化进行纤维寡糖的生产。 说明书 2/4 页 5 CN 105524958 A 5 0025 本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。 【附图说明】 0026 图1是本发明实施例三段水解分段时间节点对纤维寡糖得率影响的柱状图。 【具体实施方式】 0027 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚明了， 下面通过附图中及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 但是应该理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发 明， 并。
18、不用于限制本发明的范围。 此外， 在以下说明中， 省略了对公知结构和技术的描述， 以 避免不必要地混淆本发明的概念。 0028 本发明提供一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 包括如下步骤： 0029 步骤一、 制备反应原液： 按1： 20的比例称取底物纤维素和无菌水， 将底物纤维素和 无菌水倒入温度可设定的无菌容器中， 得到底物纤维素浓度为5的反应原液。 0030 其中， 底物纤维素为低聚木糖生产废渣。 采用低聚木糖生产废渣为底物纤维素， 提 高了资源利用率， 同时节约了生产成本。 0031 步骤二、 设定温度及pH值： 调节无菌容器中的反应原液的pH值为7.0， 设定无菌容 器的温度。
19、恒为10。 0032 步骤三、 底物原位吸附： 称取一定量的里氏木霉纤维素酶， 投入经步骤二处理后的 反应原液中， 搅拌均匀后得到吸附体系， 吸附时间为30min。 0033 其中， 里氏木霉纤维素酶的用量为15FPIU/g底物纤维素。 0034 步骤四、 固液分离处理： 当吸附时间到达30min时， 将无菌容器中的吸附体系快速 倒入离心机中离心处理， 分离除去吸附体系中的液相， 得到含有适合于纤维寡糖制备的低 -葡萄糖苷酶纤维素酶的离心沉渣。 0035 步骤五、 第一次水解处理： 将步骤四得到的含有低 -葡萄糖苷酶纤维素酶的离心 沉渣投至无菌容器中， 在无菌容器中补加无菌水至原反应原液的体积。
20、， 并调节无菌容器中 的反应体系的pH值为4.80， 无菌容器的温度设定为50， 水解反应一段时间后， 采用固液分 离方法将液相移除。 0036 步骤六、 第二次水解处理： 在经过步骤五第一次水解处理得到的固体渣中补加一 定无菌水至原反应原液的体积， 调节无菌容器中的反应体系的pH值为4.80， 无菌容器的温 度设定为50， 继续反应一段时间后， 采用固液分离方法将液相移除。 0037 步骤七、 第三次水解处理： 在经过步骤六第二次水解处理后得到的固体渣中继续 补加一定无菌水至原反应原液的体积， 调节无菌容器中的反应体系的pH值为4.80， 无菌容 器的温度设定为50， 继续反应一段时间后， 。
21、采用固液分离方法再次将液相移除。 0038 其中， 步骤五和步骤六中的固液分离方法包括离心法和过滤法。 离心法较过滤法 的分离速度较快， 能节省大量的固液分离时间。 在本发明实施例中， 固液分离方法采用离心 法。 0039 进一步地， 步骤五第一次水解处理、 步骤六第二次水解处理和步骤七第三次水解 处理的总水解时间为24h。 0040 实施例一、 说明书 3/4 页 6 CN 105524958 A 6 0041 第一次水解处理中的水解时间为6h， 第二次水解处理中的水解时间为6h。 0042 实施例二、 0043 第一次水解处理中的水解时间为6h， 第二次水解处理中的水解时间为8h。 004。
22、4 实施例三、 0045 第一次水解处理中的水解时间为8h， 第二次水解处理中的水解时间为8h。 0046 实施例四、 0047 第一次水解处理中的水解时间为6h， 第二次水解处理中的水解时间为12h。 0048 实施例五、 0049 第一次水解处理中的水解时间为24h。 0050 试验： 0051 实施例一至实施例四代表不同分段时间节点的三段水解制备技术， 实施例五代表 不分段水解制备技术。 0052 将实施例一至实施例五分别按照本发明提供的一种纤维素定向三段水解制备纤 维寡糖的方法制备纤维寡糖， 分别测定实施例一至实施例五的纤维寡糖的得率， 记录数据， 绘制成柱状图如图1所示。 0053 。
23、参阅图1， 从图中可发现， 实施例一至实施例四的纤维寡糖的得率均明显高于实施 例五的纤维寡糖得率。 且在三段水解模式中， 实施例一的纤维寡糖的得率最高， 为72.27， 较实施例五的纤维寡糖得率高出37.06， 整整翻了一倍， 较二段水解模式下的最高得率提 升了15.98， 大大提高了纤维寡糖的生产产量。 0054 本发明提供的一种纤维素定向三段水解制备纤维寡糖的方法， 能够高效解除水解 过程中产物对酶的反馈抑制作用， 提高低 -葡萄糖苷酶纤维素酶定向水解低聚木糖生产废 渣制备纤维寡糖的得率， 提升了纤维寡糖的生产产量。 0055 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换或改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 7 CN 105524958 A 7 图1 说明书附图 1/1 页 8 CN 105524958 A 8 。