技术领域
本发明涉及复合酶，具体涉及一种含酸性蛋白酶的酒精复合酶及其制备方法。
背景技术
生产酒精的原料主要是玉米、小麦等粮食作物和红薯(干)、木薯(干)、甘蔗糖蜜(桔 水)等非粮食作物。在这些植物的果实或根茎里，除了一定量的淀粉多糖外，还有部分非淀 粉多糖、果胶、蛋白质、灰份、维生素和生物素等。酒精工厂在对原料进行液化、糖化时使 用的高温α–淀粉酶和糖化酶，可以对淀粉多糖进行高效率的转化，但对于非淀粉多糖、果 胶、蛋白质、灰份等物质却无法水解，要靠发酵时酵母自身分泌的内源酶来进行水解利用。 然而，由于作用环境因素和酵母本身的特点，这种分解是缓慢的、低效率的。现代酶工程技 术的发展为充分利用上述物质提供了可行的技术手段，酒精复合酶正是针对酒精生产中存在 的这些特点而设计的一款新型复合酶制剂。
采用浓醪发酵生产酒精，可缩短发酵周期，降低能耗，提高设备利用率，是一种具有巨 大应用价值的酒精发酵技术，随着酶生产技术的成熟，国内外对浓醪发酵生产酒精的研究从未 停止。比如，大量研究表明，在玉米酒精浓醪发酵过程中分别添加适量植酸酶、酸性蛋白酶、 纤维素酶、木聚糖酶，可进一步提高酒精产量，增加原料出酒率。因此，研究开发适于酒精 生产的酒精复合酶是降低酒精生产成本的重要手段之一。在酒精浓醪发酵条件下，为缩短发 酵周期必须加快发酵速度，而玉米原料除含有大量淀粉外，还含有一定量的粗纤维、粗蛋白 和油脂，与淀粉颗粒紧密结合，影响淀粉水解速度。因此，添加适当酒精复合酶，一方面可 以进一步破坏原料结构，充分发挥糖化酶的作用，从而增加可发酵性糖，提高原料出酒率； 另一方面可以为酵母提供充足的氮源、脂肪酸等营养因子，促进酵母生长繁殖，增加主发酵 时酵母浓度，从而加快发酵速度，提高酵母酒精耐性。
在近十年中，酒精生产技术取得了巨大的进步，使得该行业变得更有利可图。但是，利润率 仍然很低。细菌污染是酒精得率和品质下降的主要原因之一。为了能控制成本效率，抑制酒精 发酵中的细菌极其重要。在燃料乙醇的生产中，一般通过在发酵过程中添加抗生素作为工艺助 剂而达到此目的。目前，日益增长的对在农业和技术领域应用抗生素而使病原菌产生抗生素多 种抗性的关注，已产生了采用一种安全天然替代品的强烈要求。发酵共产物为酒精厂的经济效 率作出了重要的贡献。越来越多的酒精生产商因声称他们的发酵共产物中不含有抗生素而得 利。致力于促进可再生能源的生物乙醇生产商尤其受使用可能导致环境危害的工艺助剂的争 执所困扰。某些地区已实施了严格的规定，如2005年底，在欧盟内被用于作为动物饲料的复合 物，其发酵共产物不允许有抗生素残留。
综上，在发酵工艺和方式确定后，提高酒精产量和质量的焦点问题是酒精复合酶的应用 和防止发酵过程杂菌(乳酸菌)的污染。中国专利CN101245339B公开了一种可替代酵母的 营养盐和酒精及燃料乙醇专用糖化营养复合酶，培养的酵母健壮，酵母细胞数多，酶活性强， 同时酵母对数生长期长，抑制杂菌生长，降低酸度；缩短发酵时间；还增加可发酵糖，可以 提高原料的利用率，提高酒精度，给企业带来可观的经济效益。本发明涉及酒精酵母营养复 合酶，它的成分组成按重量份数比为：蛋白酶2－3份；植酸酶1－2份；淀粉酶1－2份；纤维 素酶2－3份；支链淀粉酶1－2份。本发明在使用时，只须在酒精生产中按原料的0.5‰(W/W) 撒入酒母培养罐的醪液中即可，操作工序简单。中国专利CN103571878A公开了一种用于菊 芋粉发酵生产燃料乙醇的复合剂，它包含有：耐高温α－淀粉酶8－10份；复合酶：糖化酶 80－100份、普鲁兰酶30－40份、纤维素酶酶15－20份、酸性蛋白酶8－15份、果胶酶15－25 份、菊粉酶20－30份、β－葡聚糖酶5－10份、β－甘露聚糖酶3－6份、木聚糖酶5－15份、 植酸酶3－5份；耐高温酿酒干酵母80－90份。本发明的有益效果是：采用本复合剂进行发 酵菊粉生产燃料酒精，操作简单、稳定性好、发酵周期短、转化效率高、生产成本低等优点， 对进一步实现利用菊芋发酵，大规模化生产燃料乙醇具有一定的指导意义。上述公开专利的 缺陷是：1)用于酒精生产的复合酶只是简单的商品酶制剂的组合，酶系不全；2)没有解决 复合酶制剂的酶活力及其存储稳定性的问题，复合酶应用受限；3)没有从根本上解决防止杂 菌污染导致酒精产量和质量下降的问题。
因此，制备一种酶系全、酶活力高、存储稳定、有效防止发酵全程杂菌污染的可显著提 高酒精产量和质量的酒精复合酶迫在眉睫。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有酒精复合酶中蛋白酶活力低、复合酶酶系不全、抗 氧化能力低、酶活损失大、无抑菌作用或抑菌作用弱的缺陷，以高活力酸性蛋白酶等食品级 酶制剂为主要原料，科学复配植物提取物、抗氧化剂、啤酒花提取物、脱霉素、保护剂、激 活剂、耐酒精活性干酵母等，制备一种酶系全面、酶活力稳定、酶效力高的含酸性蛋白酶的 酒精复合酶，该复合酶可有效提高酒精产率和质量，适合各种原料制备酒精或燃料乙醇。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种含酸性蛋白酶的酒精复合酶，由以下重量份数的原料组成：
淀粉酶20－30份，蛋白酶15－25份，植物提取物10－15份，半纤维素酶10－12份，啤酒 花提取物10－12份，果胶酶8－10份，酯酶8－10份，耐高温酿酒干酵母7－10份，脱霉素5－10 份，植酸酶5－7份，保护剂4－6份，激活剂4－6份，抗氧化剂0.6－1.2份；
所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：70％糖化酶，10％普鲁兰酶， 10％真菌α－淀粉酶，5％β－淀粉酶，5％中温α－淀粉酶；
所述植物提取物中含有蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、酯酶、氧化还原酶等多种植物酶；
所述植物提取物中还含有植物多糖和单糖、植物淀粉、植物蛋白等营养物质，不仅可为 白酒酿造复合酶提供全面、丰富的植物酶，还可作为制备酸性蛋白酶的发酵培养基成分，提 高蛋白酶活力和微生物产酶能力；
所述植物提取物采用超声清洗、微波辅助超声提取和高压脉冲电场提取、超滤浓缩等低 温提取技术，有效提高了原料利用率、植物酶活性和产率；有效保证了植物提取物的食品安 全性；
所述植物提取物的制备方法为：将大麦芽和小麦芽按质量比5－7：3－5均匀混合，粉碎至 粒度0.5－1mm，得粉碎麦芽；然后将木瓜、菠萝、无花果分别于超声波清洗机中在功率200W、 频率30KHz条件下超声清洗5－10min，沥干，室温下破碎至粒度0.5－1mm，并按质量比 5－7：2－4：1－3均匀混合，加入混合物质量1.5－3倍的粉碎麦芽得原料混合物，加入原料混合 物质量1－3倍的水，用柠檬酸调节pH值为3－4，在功率150－300W、频率2000Hz条件下进行 微波提取，其中，每次微波辐照总时间60－80s，进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制 温度20－35℃，如此辐照10次，同时在功率200－300W，频率30－40KHz条件下进行超声波辅 助提取；保温1－3h，然后，在功率200－400W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次 微波辐照总时间90－105s，进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制温度40－60℃，如此辐 照10次，同时在功率300－500W，频率40－50KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温 至室温，于电场强度25－35kV/cm，脉冲时间400－600μs，脉冲频率200－300Hz条件下进行高压 脉冲电场(PEF)提取15－20min；提取液过滤得第一滤液，加滤渣2倍的水漂洗、过滤得第 二滤液，将第一滤液和第二滤液按质量比1：1－2均匀混合，混合液超滤浓缩、冷冻干燥、低 温粉碎即得植物提取物；
优选地，所述超声波清洗机中清洗液为0.3－0.5％的碳酸氢钠溶液。
所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：酸性蛋白酶80％，中性蛋白 酶10％，10％脯氨酸蛋白酶；
优选地，所述酸性蛋白酶是以高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉(Aspergillususamil) CCTCCNO：M2013601为出发菌株，经特定发酵条件下的液体深层发酵而制得，并且发酵培 养基中科学复配了上述制备的植物提取物；
优选地，所述酸性蛋白酶的制备方法包括以下步骤：保存完好的宇佐美曲霉CCTCCNO： M2013601的菌种经斜面菌种活化、一级、二级、三级液体种子扩大培养至种子罐，将种子 罐液体种子以5％接种量接入发酵罐培养基，培养温度31－32℃，搅拌速度200-400r/m，通风 量1:1-2，培养时间10-12h；然后以1－2℃/h降温速率缓慢降温至26－30℃，搅拌速度 400-600r/m，通风量1:1-3，恒温培养8-10h；继续以1－2℃/h降温速率缓慢降温至23－25℃， 搅拌速度500-700r/m，通风量1:2-4，培养时间22-31h，然后，将种子罐液体种子以3％接种量 追加接入发酵罐，最后以1－2℃/h升温速率缓慢升温至31－32℃，搅拌速度200-400r/m，通 风量1:1-2，恒温培养10-12h；接着以1－2℃/h降温速率缓慢降温至23－25℃，搅拌速度 500-700r/m，通风量1:2-4，恒温培养22-31h；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固 体酸性蛋白酶；
所述斜面培养基组成为：葡萄糖20g，琼脂20g，中草药提取物5－10g，干酪素4g，磷 酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：麸皮60－80g，玉米粉50-60g，豆饼粉35-40g， 海藻糖10－15g，鱼粉6-10g，氯化铵10－12g，氯化钙5-10g，干酪素5-10g，中草药提取物5－10g， 硫酸镁2-4g，磷酸氢二钾1－3g，纯净水l000mL，pH值5－7，121℃灭菌20min；
所述种子罐培养基组成为：麸皮60－80g，玉米粉50-60g，豆饼粉35-40g，海藻糖10－15g， 中草药提取物10－15g，鱼粉6-10g，氯化铵10－12g，氯化钙5-10g，干酪素5-10g，硫酸镁2-4g， 磷酸氢二钾1－3g，纯净水l000mL，pH值5－7，121℃灭菌20min；
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108－8.0x108个/ml；
所述发酵罐培养基组成为：麸皮60－80g，玉米粉50-60g，植物提取物40-60g，豆饼粉 35-40g，中草药提取物20－30g，海藻糖10－30g，鱼粉6-10g，氯化铵10－12g，氯化钙5-10g， 干酪素3-5g，硫酸镁2-4g，磷酸氢二钾1－3g，硝酸钾1－2g，硫酸锌0.1－0.2g，纯净水l000mL， pH值5－7，121℃灭菌20min；
所述中草药提取物的制备方法如下：
按重量份数计，称取黄芪60－70份，当归50－60份，党参40－45份，甘草40－45份，鱼 腥草35－45份，神曲35－45份，柴胡10－15份，黄芩10－15份；将上述中草药粉碎至粒径为 2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3－6倍重量的水，控制温度70℃－90℃保持2－4h， 然后降温至45－60℃，加入混合物料总重量5－10％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值 为5.5－6.8，酶解2－4h，最后添加混合物料0.5－3倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇 混合的质量比为1：1.5，控制温度至60℃－78℃保持3－4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣1－3 倍重量的水，控制温度85℃－95℃保持1－3h，然后降温至25－35℃，过滤，得第二滤液；将 第一滤液和第二滤液按照质量比2－4：1－3合并，滤液真空浓缩后冷冻干燥、粉碎即得中草药提 取物；
所述混合酶为葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果胶酶按质量比5：3：1：0.5均匀混合。
所述半纤维素酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：35％耐温β－葡聚糖复 合酶，35％β－葡聚糖复合酶，10％甘露聚糖酶，10％的木聚糖酶，10％的戊聚糖酶。
所述啤酒花提取物可有效抑制革兰氏阳性菌的生长和繁殖而不影响酒精酵母的正常发 酵，对酒精发酵过程中的细菌群如乳酸菌具有非常有效的抗性。在抑制浓度下将抑制乳酸和 乙酸的形成，因而有助于避免酒精产量损失并增加回流量。
所述啤酒花提取物的制备方法为：将啤酒花置超声波清洗机中于200W、40KHz清洗 10－15min，沥干，于－18—－22℃冷冻20－40min后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3－5cm，粉碎 粒度0.5－3mm，加入粉碎啤酒花重量1－3倍的乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比 为2－4：1－3，用乳酸调节pH值为3.0－3.5，在功率150－300W、频率2000Hz、温度20－35℃条 件下进行微波提取20－30min，同时在功率200－300W，频率30－40KHz条件下进行超声波辅助提 取；保温1－3h，然后，在功率200－400W、频率2000Hz条件下进行微波提取15－20min，同时 在功率300－500W，频率40－50KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电 场强度35－45kV/cm，脉冲时间400－600μs，脉冲频率200－300Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF) 提取20－30min，提取液减压浓缩、真空冷冻干燥、低温粉碎即得啤酒花提取物；
所述啤酒花为新鲜成熟啤酒花、压缩片花或压缩颗粒酒花，优选新鲜成熟啤酒花；在采用 颗粒酒花时，无须清洗；
优选地，所述超声波清洗采用质量百分比浓度为0.6－0.8％的碳酸氢钠溶液为清洗剂；
优选地，所述乙醇和丙醇混合的质量比为3：2；
优选地，所述微波提取采用间歇式提取，即微波辐照20s，停止10s，如此循环；
所述乙醇浓度≥75％。
所述酯酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：80％脂肪酶，15％酸性磷酸酶， 5％磷酸酯酶。
所述脱霉素是由美国杜邦公司生产的一种不同于普通硅铝酸盐的硅铝酸盐衍生物，系化 学合成物，具有网格状多层或链状结构，二价或三价阳离子与氧或羟基形成八面体的共价结 构；二氧化硅则与氧或羟基形成四面体的共价结构。具有强选择性吸附作用，能有效吸附原 料(玉米、小麦等淀粉质原料)中黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T－2毒素等多种 毒素，而且不会吸附氨基酸、维生素、微量元素等营养成份，可有效防止原料毒素对酒精生 产过程中糖化、发酵菌种的危害，促进其健康增殖和发酵，提高产酶、产酒精能力。
所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：氯化锌15－25份，氯化钙10－15份， 硫酸钠10－15份，氯化镁5－10份。
所述保护剂由以下重量份数的原料组成：灵芝多糖20－30份，海藻糖20－30份，NaCl10－20 份，(NH4)2SO410－15份，半胱氨酸10－15份。
所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物中的任一一种或几种组合；
优选地，所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比 2－4：1－3：1－2均匀混合；
所述葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物均为市购商品。
上述含酸性蛋白酶的酒精复合酶的制备方法，包括如下步骤：
首先将所述保护剂、激活剂超微粉碎，随后立即依次加入脱霉素、啤酒花提取物、植物 提取物均匀混合20－30min，然后依次加入淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、果胶酶、酯酶、植 酸酶均匀混合，最后依次加入耐高温酿酒干酵母及抗氧化剂，混合均匀后密封包装即得酒精 复合酶。
本发明另一个目的是含酸性蛋白酶的酒精复合酶在酒精生产中的应用。
使用方法：
1.复合酶作用条件：适应pH值2－6，最适pH值3.5－5.5；适应温度30－55℃，最适反应 温度30－45℃。
2.使用方法：1)在糖化过程与糖化粉剂(商品糖化酶或糖化曲)均匀混合，一起加入； 2)将复合酶与40℃水按质量比1：10均匀混合，调整pH值为3.5－5.5，活化30－50min，使用 效果最佳。
3.使用量：为原粮干重的0.01－0.15％。
本发明提供的宇佐美曲霉801－2是由实验室保藏的一株产酸性蛋白酶的宇佐美曲霉801 依次经紫外线复合氯化锂诱变、亚硝基胍诱变、硫酸二乙酯诱变，并对突变株分离、筛选， 最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力酸性蛋白酶的宇佐美曲霉801－2。
本发明提供的产高活力酸性蛋白酶的菌株具体为宇佐美曲霉(Aspergillususami)l801－2。 该菌株已于2013年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国. 武汉.武汉大学邮编：430072)，保藏号为CCTCCNO：M2013601，分类命名为宇佐美曲霉 801－2Aspergillususamil801－2。
本发明宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801－2(CCTCCNO：M2013601)具有以下微生物 学特征：
1、形态学特征：
宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801－2，生物学形态为包括分生孢子、胞梗、顶囊、产 胞结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150－450μm，分生孢子梗发生于基质。胞 梗茎1000－3000(长度)×12－20(直径)μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形， 直径35－50μm，表面全面可育；产胞结构双层，梗基15－20(长度)×3－4.0(直径)μm，瓶梗 6－8(长度)×2－4(直径)μm，分生孢子球形或近球形，较小，直径3.5－5.0μm，褐色，壁粗 糙。
2、培养学特征：
宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801－2菌株在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，32℃4天 菌落直径82mm；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，有少量渗出液；菌 落反面略带黄色。
3、生理生化特征：
宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801－2可在马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉，糖蜜等上生 长，最适PH值5－6，最适生长温度31－32℃，最适产酶温度23－25℃。
本发明菌株宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801－2的筛选技术路线为：出发菌株→斜面 培养→孢子悬液的制备→诱变处理→平板分离→初筛→复筛→再复筛→扩大实验(发酵性能 测定)。
按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一 株高产酶性能菌株宇佐美曲霉801－2，发酵72－96小时后酸性蛋白酶酶活可达14000U/mL， 对酶的热稳定性进行了分析，将粗酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70 ℃下，每隔10分钟取样测定酶活。40℃、45℃、50℃下，60分钟酶活没有下降。55℃与60 ℃下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到90％。65℃下，30分钟降到原有酶活的 85％，60分钟降到80％。70℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到原有酶活的 75％。酸性蛋白酶适应反应温度30－55℃，最适反应温度40－50℃，同样条件下达到同样酶活 耐受温度比出发菌平均提高了8－12℃，适应pH值范围2－6，最适pH值2.5－3.5。
有益效果：
本发明酒精复合酶在科学复配食品级酶制剂的基础上，特别复配了高活力酸性蛋白酶、含 丰富植物酶及营养物质的植物提取物使复合酶酶系更全；同时又添加了使酶活力完全释放的 激活剂和使酶活性更稳定的保护剂及抗氧化剂，并且还科学复配了抑制杂菌、促进糖化曲和 酿酒酵母快速增殖和发酵的啤酒花提取物、脱霉素；可充分、有效水解原粮中的淀粉、蛋白 质、脂肪、纤维素、半纤维素、果胶等，崩解原粮间质细胞壁，释放内容物，获取更多的发 酵糖和氨基酸、脂肪酸、维生素、矿物质等营养物质，增加发酵碳源，促进酒类生产菌旺盛 发酵，提高原料利用率和出酒率，可显著提高酒精产量，与市售玉米酒精专用复合酶、木薯 酒精专用复合酶及马铃薯酒精专用复合酶相比，本发明酒精复合酶可有效提高原料出酒率和 酒精浓度，与对照组相比，酒精度分别提高13.63％、36.25％和17.44％；原料出酒率分别提高 17.41％、38.81％和20.04％。具体表现在：
1.本发明植物提取物以含植物酶丰富、酶系全面的啤酒大麦芽、小麦芽、木瓜、菠萝、 无花果为原料，采用超声清洗、微波辅助超声提取和高压脉冲电场提取、超滤浓缩等低温提 取技术，有效提高了原料利用率、植物酶活性和产率；有效保证了植物提取物的食品安全性； 制备的植物提取物中含有蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、酯酶、氧化还原酶等多种植物酶系； 所述植物提取物中还含有植物多糖和单糖、植物淀粉、植物蛋白等营养物质，不仅可为白酒 酿造复合酶提供全面、丰富的植物酶，还可作为制备酸性蛋白酶的发酵培养基成分，提高蛋 白酶活力和微生物产酶能力。
2.本发明的酸性蛋白酶以高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉CCTCCNO：M2013601为出 发菌株，根据其最适生长温度和最适产酶温度，细化了孢子增殖和发酵产酶阶段的工艺参数， 采用梯度降温和梯度升温的发酵工艺，同时予以追加接种，尤其是梯度降温和梯度升温的发 酵工艺显著提高了出发菌株的抗应激能力，致使菌种的产酶能力最大限度地显现。并且本发 明对培养基组成实施全程优化，添加了具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，添加了具有调整 和修复机体功能、增强机体的免疫功能、具有微生态调节功能的黄芪、党参等，进一步增强 了微生物在同一发酵环境下的机体功能性、传代适应性和共同协作性，进而增强了微生物的 代谢功能，使得本发明所产酸性蛋白酶活力高、耐受温度较高、稳定性强、适于工业化生产。
3.本发明酸性蛋白酶制备过程中发酵培养基植物提取物的添加，使得发酵液酸性蛋白酶 酶活力大幅度提高，由13000－14000U/mL提高至19000－22000U/mL，增幅57.14％；发酵液粗 酶液可耐受较高温度，40℃、45℃、50℃下，60分钟酶活没有下降。55℃与60℃下，30分 钟降到原有酶活的95％，60分钟降到90％。65℃下，30分钟降到原有酶活的85％，60分 钟降到80％。70℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到原有酶活的75％。酸性蛋 白酶适应反应温度30－55℃，最适反应温度40－50℃，适应pH值范围2－6，最适pH值2.5－3.5。 更加适合传统糖化曲酒精制备工艺，能够彻底分解原料中的大分子蛋白，提高酒精产量。
4.本发明酒精复合酶中啤酒花提取物采用低温提取技术，最大限度地保留了啤酒花中酒 花酸的含量，可有效抑制革兰氏阳性菌的生长和繁殖而不影响酒精酵母的正常发酵，对酒精 发酵过程中的细菌群如乳酸菌具有非常有效的抗性。在抑制浓度下将抑制乳酸和乙酸的形成， 因而有助于避免酒精产量损失并增加回流量。
5.本发明酒精复合酶中耐高温酿酒干酵母的科学复配，可使酒精生产糖化阶段酶解产物 浓度缓慢降低，减少了酶解产物浓度升高对酶解反应的抑制作用，加快了酶解速度。
6.本发明酒精复合酶中脱霉素为具有强选择性吸附作用的硅铝酸盐衍生物，能有效吸附 原料(玉米、小麦等淀粉质原料)中黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T－2毒素等多 种毒素，而且不会吸附氨基酸、维生素、微量元素等营养成份，可有效防止原料毒素对酒精 生产过程中糖化、发酵菌种的危害，促进其健康增殖和发酵，提高产酶、产酒精能力。
7.本发明酒精复合酶抗氧化剂的科学复配，可有效防止复合酶酶分子结构氧化而造成酶 活性损失，提高酶活力稳定性。在0℃和40℃条件下储存12个月，复合酶中单酶酶活损失 分别为0.46％和0.56％，比对比例分别降低8.0％和65％，有效防止在包装、储存、运输、使 用等环节因环境改变、操作方法不当而造成酶的失活，尤其可防止高温造成的酶失活。同时 抗氧化剂可消耗酒精生产过程发酵液中的溶解氧，减缓和防止醋酸菌等杂菌将乙醇氧化而造 成酒精损失。
8.本发明酒精复合酶中保护剂科学复配，有效减缓了复合酶制剂的回潮；同时可增强复 合酶的耐冻、耐热性能，保持相同的酶活力，其耐热温度可提高20－30℃，耐冷冻温度可降 低10－15摄氏度，有效防止了复合酶在运输、保存和使用过程中酶活力的损失，延长了复合 酶的保质期，达到同样的酶活力，比同类产品保质期可延长2－3年。
9.本发明酒精复合酶添加无机盐作为激活剂，创造了酶催化作用的最佳条件，充分发挥 了麦芽中自带酶和外加酶的活力，彻底有效的分解了酿造原料中淀粉、蛋白质、半纤维素、 脂肪等大分子物质，不仅提高了原料利用率，而且增加了酒曲和酒母的营养物质，同时提供 了白酒必须的香味物质及其前体物。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本 领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围， 本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实 质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发 明的保护范围。
实施例1原料制备
1.植物提取物的制备：将大麦芽、小麦芽按质量比6：4均匀混合，粉碎至粒度0.8mm，得 粉碎麦芽；然后将木瓜、菠萝、无花果分别于盛有0.4％的碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中在 功率200W、频率30KHz条件下超声清洗8min，沥干，室温下破碎至粒度0.8mm，并按质量比 6：3：2均匀混合，加入混合物质量3倍的粉碎麦芽得原料混合物，加入原料混合物质量2倍 的水，用柠檬酸调节pH值为3.5，在功率200W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中， 每次微波辐照总时间70s，进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制温度30℃，如此辐照 10次，同时在功率250W，频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；保温2h，然后，在功率300W、 频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间105s，进行间隔式辐照：辐照 15s，间隔10s，控制温度50℃，如此辐照10次，同时在功率400W，频率45KHz条件下进行 超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度30kV/cm，脉冲时间500μs，脉冲频率250Hz 条件下进行高压脉冲电场提取18min；提取液过滤得第一滤液，加滤渣2倍的水漂洗、过滤 得第二滤液，将第一滤液和第二滤液按质量比1：1.5均匀混合，混合液超滤浓缩、冷冻干燥、 低温粉碎即得植物提取物；
2.酸性蛋白酶的制备
所述酸性蛋白酶的制备方法包括如下步骤：
(1)菌种活化
将保存完好的宇佐美曲霉CCTCCNO：M2013601的斜面菌种接种于斜面培养基，32℃培 养40h进行菌种活化，如此活化3次；
(2)液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤(1)活化后斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶 中，液体种子培养基装量100毫升，32℃、100rpm摇床培养40h；
②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养 条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以8％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养 基装量1000毫升，32℃、100rpm摇床培养40h；
④种子罐培养：将三级种子以8％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，种子罐培 养基装量100L，控制pH值为6，培养温度31℃，搅拌速度300rpm，通风量(V/V)1：1，培养 时间40h；
所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0x108个/ml；
(3)发酵罐发酵
将步骤(2)中种子罐液体种子以5％接种量接入发酵罐培养基，培养温度32℃，搅拌速 度300r/m，通风量(V/V)1:1.5，培养时间11h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至28℃，搅 拌速度500r/m，通风量(V/V)1:2，恒温培养9h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至24℃， 搅拌速度600r/m，通风量(V/V)1:3，培养时间27h，然后，将步骤(2)中种子罐液体种子 以3％接种量追加接入发酵罐，最后以2℃/h升温速率缓慢升温至32℃，搅拌速度300r/m，通 风量(V/V)1:1.5，恒温培养11h；接着以2℃/h降温速率缓慢降温至24℃，搅拌速度600r/m， 通风量(V/V)1:3，恒温培养27h；
(4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体酸性蛋白酶。
经上述方法制备的酸性蛋白酶在室温下保存12个月后酶活损失为1.8％，发酵液酸性蛋 白酶酶活力可达22000U/mL。
所述斜面培养基组成为：葡萄糖20g，琼脂20g，中草药提取物7g，干酪素4g，磷酸氢 二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：麸皮70g，玉米粉55g，豆饼粉38g，海藻 糖12g，鱼粉8g，氯化铵11g，氯化钙8g，干酪素8g，中草药提取物8g，硫酸镁3g，磷酸 氢二钾2g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；
所述种子罐培养基组成为：麸皮70g，玉米粉55g，豆饼粉38g，海藻糖12g，中草药 提取物12g，鱼粉8g，氯化铵11g，氯化钙8g，干酪素8g，硫酸镁3g，磷酸氢二钾2g，纯 净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；
所述发酵罐培养基组成为：麸皮70g，玉米粉55g，植物提取物50g，豆饼粉38g，中草 药提取物25g，海藻糖20g，鱼粉8g，氯化铵11g，氯化钙8g，干酪素4g，硫酸镁3g，磷酸 氢二钾2g，硝酸钾2g，硫酸锌0.2g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；
所述中草药提取物的制备方法如下：按重量份数计，称取黄芪65份，当归55份，党参 42份，甘草42份，鱼腥草40份，神曲40份，柴胡12份，黄芩12份；将上述中草药粉碎至 粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然 后降温至52℃，加入混合物料总重量8％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.2， 酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1：1.5， 控制温度至70℃保持4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣2倍重量的水，控制温度90℃保持 2h，然后降温至30℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比3：2合并，滤 液真空浓缩后冷冻干燥、粉碎即得中草药提取物；
所述混合酶为葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果胶酶按质量比5：3：1：0.5均匀混合。
酶活力单位定义：1mL粗酶液，于40℃、pH3.0条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨 酸的酶量为1个酶活力单位，以U/mL表示。
3.啤酒花提取物的制备
所述啤酒花提取物的制备方法为：将新鲜成熟啤酒花置盛有0.7％碳酸氢钠溶液的超声波 清洗机中于200W、40KHz清洗12min，沥干，于－20℃冷冻30min后立即进行粉碎，冷冻料层 厚度4cm，粉碎粒度2mm，加入粉碎啤酒花重量2倍的乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合 的质量比为3：2，用乳酸调节pH值为3.2，在功率200W、频率2000Hz、温度30℃条件下进行 微波提取25min，同时在功率250W，频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；保温2h，然后， 在功率300W、频率2000Hz条件下进行微波提取18min，同时在功率400W，频率45KHz条件 下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度40kV/cm，脉冲时间500μs，脉冲 频率250Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)提取25min，提取液减压浓缩、真空冷冻干燥、 低温粉碎即得啤酒花提取物；
所述微波提取采用间歇式提取，即微波辐照20s，停止10s，如此循环；
所述乙醇浓度为80％。
实施例2
一种含酸性蛋白酶的酒精复合酶，由以下重量份数的原料组成：
淀粉酶25份，蛋白酶20份，植物提取物12份，半纤维素酶11份，啤酒花提取物11份， 果胶酶9份，酯酶9份，耐高温酿酒干酵母9份，脱霉素8份，植酸酶6份，保护剂5份， 激活剂5份，抗氧化剂0.9份；
所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：70％糖化酶，10％普鲁兰酶， 10％真菌α－淀粉酶，5％β－淀粉酶，5％中温α－淀粉酶；
所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：酸性蛋白酶80％，中性蛋白 酶10％，10％脯氨酸蛋白酶；
所述半纤维素酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：35％耐温β－葡聚糖复 合酶，35％β－葡聚糖复合酶，10％甘露聚糖酶，10％的木聚糖酶，10％的戊聚糖酶；
所述酯酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：80％脂肪酶，15％酸性磷酸酶， 5％磷酸酯酶；
所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：氯化锌20份，氯化钙12份，硫酸 钠12份，氯化镁8份；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成：灵芝多糖25份，海藻糖25份，NaCl15份， (NH4)2SO412份，半胱氨酸12份；
所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比3：2：1.5均匀混 合；
所述植物提取物、酸性蛋白酶、啤酒花提取物均为实施例1制备。
上述含酸性蛋白酶的酒精复合酶的制备方法，包括如下步骤：
首先将所述保护剂、激活剂超微粉碎，随后立即依次加入脱霉素、啤酒花提取物、植物 提取物均匀混合20－30min，然后依次加入淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、果胶酶、酯酶、植 酸酶均匀混合，最后依次加入耐高温酿酒干酵母及抗氧化剂，混合均匀后密封包装即得酒精 复合酶。
实施例3
一种含酸性蛋白酶的酒精复合酶，由以下重量份数的原料组成：
淀粉酶20份，蛋白酶15份，植物提取物10份，半纤维素酶10份，啤酒花提取物10份， 果胶酶8份，酯酶8份，耐高温酿酒干酵母7份，脱霉素5份，植酸酶5份，保护剂4份， 激活剂4份，抗氧化剂0.6份；
所述淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、酯酶质量组成同实施例2；
所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：氯化锌15份，氯化钙10份，硫酸 钠10份，氯化镁5份；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成：灵芝多糖20份，海藻糖20份，NaCl10份， (NH4)2SO410份，半胱氨酸10份；
所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比2：1：1均匀混合；
所述植物提取物、酸性蛋白酶、啤酒花提取物均为实施例1制备。
上述含酸性蛋白酶的酒精复合酶的制备方法制备方法同实施例2。
实施例4
一种含酸性蛋白酶的酒精复合酶，由以下重量份数的原料组成：
淀粉酶30份，蛋白酶25份，植物提取物15份，半纤维素酶12份，啤酒花提取物12份， 果胶酶10份，酯酶10份，耐高温酿酒干酵母10份，脱霉素10份，植酸酶7份，保护剂6 份，激活剂6份，抗氧化剂1.2份；
所述淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、酯酶质量组成同实施例2；
所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：氯化锌25份，氯化钙15份，硫酸 钠15份，氯化镁10份；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成：灵芝多糖30份，海藻糖30份，NaCl20份， (NH4)2SO415份，半胱氨酸15份；
所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比4：3：2均匀混合；
所述植物提取物、酸性蛋白酶、啤酒花提取物均为实施例1制备。
上述含酸性蛋白酶的酒精复合酶的制备方法制备方法同实施例2。
实施例5
一种含酸性蛋白酶的酒精复合酶，由以下重量份数的原料组成：
淀粉酶25份，蛋白酶20份，植物提取物12份，半纤维素酶11份，啤酒花提取物11份， 果胶酶9份，酯酶9份，耐高温酿酒干酵母9份，脱霉素8份，植酸酶6份，保护剂5份， 激活剂5份，葡萄籽原花青素0.9份；
所述淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、酯酶质量组成同实施例2；
所述激活剂、保护剂质量组成同实施例4；
所述植物提取物、酸性蛋白酶、啤酒花提取物均为实施例1制备。
上述含酸性蛋白酶的酒精复合酶的制备方法制备方法同实施例2。
实施例6酸性蛋白酶的热稳定性分析
将实施例1酸性蛋白酶发酵粗酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70 ℃下，每隔10分钟取样测定酶活。40℃、45℃、50℃下，60分钟酶活没有下降。55℃与60 ℃下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到90％。65℃下，30分钟降到原有酶活的 85％，60分钟降到80％。70℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到原有酶活的 75％。说明酸性蛋白酶热稳定性较强。
实施例7酸性蛋白酶的pH稳定性分析
将实施例1酸性蛋白酶发酵粗酶液分别置于pH值2.0、2.5、3.5、4.5、5.5、6.0下，每 隔10分钟取样测定酶活。粗酶液pH值2.0、2.5、3.5下，60分钟酶活没有下降。pH值4.5 下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到90％。pH值5.5下，30分钟降到原有酶活 的90％，60分钟降到85％。pH值6.0下，30分钟降到原有酶活的85％，60分钟降到80％， 说明酸性蛋白酶耐pH范围较宽泛。
实施例8植物提取物对酸性蛋白酶酶活力的影响
采用本发明实施例1中酸性蛋白酶的制备方法，其它工艺条件、工艺参数、培养基等发酵 条件完全相同，唯一区别是发酵培养基不加植物提取物，形成对比例，发酵完毕，采用同一 检测方法测定发酵液酸性蛋白酶活力，检测结果如表1：
表1发酵液酸性蛋白酶活力
项目 实施例1 对比例 差异 增幅 发酵液酸性蛋白酶活力 22000U/mL 14000U/mL 8000U/mL 57.14％
以上结果表明：本发明制备的植物提取物含有较高的酸性蛋白酶活力，发酵培养基中添 加植物提取物，发酵液酸性蛋白酶活力可从14000U/mL提高至22000U/mL，酸性蛋白酶酶活力 提高57.14％，同时也表明：本发明酒精复合酶中科学复配植物提取物，可提供丰富、全面的 植物酶系。
实施例9抗氧化剂对酒精复合酶酶活力的影响
采用本发明实施例2制备的含酸性蛋白酶的酒精复合酶，其它原料、原料组份、制备方 法完全相同，唯一区别是原料组分不含抗氧化剂，形成对比例，分别于0℃和40℃条件下储 存12个月，采用《GB8726－2006食品添加剂糖化酶制剂》中检测方法测定糖化酶的酶活力， 计算酶活损失率，酶活损失率是指实际检测的酶活力与产品标注酶活力的差值占标注酶活力 的百分率，结果如表2
表2储存期复合酶中糖化酶酶活力损失率
以上结果表明，在0℃和40℃条件下储存12个月，实施例2中的糖化酶比对比例中的 糖化酶酶活损失分别降低8.0％和65％，说明抗氧化剂的科学复配，显著提高了复合酶中各组 分酶的活力，酶活损失大幅降低，尤其在高温条件下效果更加显著。
实施例10本发明酒精复合酶对不同原料浓醪发酵的影响
一、试验地点：湖南某一酒精厂酿造车间。
二、试验时间：2013年11月18日－2014年5月18日，历时180天。
三、试验方案设计：1.试验为单因子设计，设置试验组和对照组，对照组和试验组的原 料、工艺、设备、操作人员、环境及管理方式均相同，区别是：试验组在糖化过程添加本发 明实施例2制备的酒精复合酶，对照组添加市售相应原料(玉米、木薯和马铃薯)的酒精专 用复合酶。2.试验组和对照组均按原料干重0.01－0.15％添加酒精复合酶。3.同一种原料试 验组和对照组各投料10批次，计算平均值。4.对不同原料浓醪发酵过程原料利用率、酒精产 率相关指标进行检测结果如表3
表3酒精复合酶对不同原料浓醪发酵的影响
以上结果表明：与市售玉米酒精专用复合酶、木薯酒精专用复合酶及马铃薯酒精专用复合 酶相比，本发明酒精复合酶可有效提高原料出酒率和酒精浓度，与对照组相比，酒精度分别 提高13.63％(2.23％)、36.25％(4.76％)和17.44％(2.72％)；原料出酒率分别提高17.41％(5.91％)、 38.81％(14.33％)和20.04％(7.59％)，显著降低了酒精生产成本。同时也表明本发明酒精复 合酶适合以各种酒精生产原料采用浓醪发酵工艺生产酒精。