一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法.pdf

本发明公开了一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法。该方法包括以下步骤：(1)无菌苗的获得及培养，(2)甘薯茎段的预培养，(3)菌株的活化剂菌液的制备，(4)农杆菌侵染和共培养，(5)农杆菌脱菌及不定芽再生，(6)甘薯小芽的分割及生根，(7)转基因植株的筛选，(8)检测及移栽。本发明提出了一个甘薯遗传转化的新方法，以甘薯茎段为外植体，通过对其侵染及诱导不定芽获得转基因植株，适用于多种基因型，且再生速度快，是一个能够用于甘薯转基因育种的可靠体系。

1、  一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法，步骤包括无菌苗快繁，以甘薯茎段为受体的遗传转化，不定芽再生及小苗生根，抗生素筛选和小苗移栽，其特征在于：
所述以甘薯茎段为受体的遗传转化方法是：将培养20-30天的甘薯无菌小苗剪去叶片及根，将茎切成0.5-1厘米的小段，每段含1-2个节，将茎段沿侧芽所在的轴线纵向切成两半，并切去可见的侧芽；再将经过上述处理的甘薯茎段切面向下置于固体培养基上，22℃-25℃下暗培养3天；然后将上述暗培养的甘薯茎段在OD600为0.6-1.0的农杆菌悬液中侵染10-15分钟，而后用无菌滤纸吸去菌液，切面朝下置于继代培养基上，23℃-25℃下暗培养5天；
所述不定芽再生及小苗生根的方法是：将上述暗培养5天的甘薯茎段用无菌水清洗3-4次，再用无菌滤纸吸干，转接至不定芽诱导培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14小时条件下，连续培养20±2天，分化出不定芽；当甘薯茎段上的不定芽长至1厘米时，将小芽单独剪下，转移到生根培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14小时条件下，培养14±1天，进行生根；
所述抗生素筛选的方法是：将已生出1-2cm根的甘薯小苗不伤及根部取出，转接到含相应抗生素的筛选培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14小时条件下，培养14±1天；其中所述筛选培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，并添加200mg/L头孢噻肟钠和25mg/L卡那霉素，pH5.8。

2、  根据权利要求1所述农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法，其特征在于：所述固体培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

3、  根据权利要求1所述农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法，其特征在于：所述继代培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

4、  根据权利要求1所述的农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法，其特征在于：所述不定芽诱导培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L KT(激动素)+0.01-0.1mg/L NAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，并添加200mg/L头孢噻肟钠，pH5.8。

5、  根据权利要求1所述农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法，其特征在于：所述生根培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，并添加200mg/L头孢噻肟钠，pH5.8。

一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法
技术领域
本发明涉及一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法，属于植物基因工程领域。
背景技术
甘薯是旋花科甘薯属的蔓生性草本植物，产量高，其块根营养丰富，淀粉含量高达12％-20％，是重要的粮食作物及工业原料。但甘薯种间、种内杂交存在不亲和性，限制了亲本的组配，而诱变育种往往效率不高且嵌合现象较为严重，因此通过遗传工程技术改良甘薯种质具有重大意义。
农杆菌是一类革兰氏阴性菌，包括根癌农杆菌(含有致瘤Ti质粒)和发根农杆菌(含致根Ri质粒)，甘薯的遗传转化主要使用根癌农杆菌。根癌农杆菌的Ti质粒含有T-DNA区，T-DNA可将携带的任何基因整合到植物基因组中，实现外源基因的导入。
根癌农杆菌介导转化的过程包括：细菌在敏感细胞上吸附，植物伤口处产生酚类物质或外源添加酚类物质激活vir基因表达，vir基因表达产物作用于T-DNA使其产生T-DNA链，进一步形成T-DNA复合体进入细胞，此复合体在胞内蛋白与细菌蛋白的共同作用下进入细胞核，而后整合入植物基因组。
自1993年Otani等人首次获得用毛状根再生的转基因甘薯植株，至今已有一些以各种甘薯外植体为受体的转基因报道，如Newell等以甘薯块根为受体获得转基因植株，Gama等以愈伤组织为受体获得转基因植株，Cipriani等以甘薯叶片为受体获得转基因植株。但与其他作物相比，甘薯的基因转化进展还比较慢，缺乏高效的遗传转化及再生体系，获得的转基因植株比较少(基本只局限在几个品种)。因此，甘薯的转基因体系有待改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法，建立了一个适合多个甘薯品种的不定芽发生体系，从而有效地克服了基因型对甘薯遗传转化的限制，使绝大多数基因型的甘薯都能够发生不定芽。此法取材不受季节限制，转化频率较高，且再生植株无性系变异较小。
本发明所述农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法包括无菌苗快繁，以甘薯茎段为受体的遗传转化，不定芽再生及小苗生根，抗生素筛选和小苗移栽等步骤，具体是：
(1)无菌苗的获得及培养
将甘薯植株距地面10厘米以上部分剪下，用自来水冲洗30分钟，剪去叶片将茎切成2cm左右小段，用70％乙醇消毒1分钟，去净乙醇后用0.1％HgCl₂消毒10分钟，无菌水冲洗4遍，无菌滤纸吸去水分后将茎段放入固体培养基上，在22℃-25℃下光照培养。其中所述固体培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。
(2)甘薯茎段的预培养
将培养20-30天的甘薯无菌小苗剪去叶片及根，将茎切成0.5-1厘米的小段(每段含1-2个节)，将茎段沿侧芽所在的轴线纵向切成两半，并切去可见的侧芽。经过上述处理的甘薯茎段切面向下置于固体培养基上，22℃-25℃下暗培养3天。其中所述固体培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。
(3)菌株的活化及菌液的制备
将4℃保存的带有植物表达载体的农杆菌在添加了50mg/L利福平的YEP固体培养基上划线，28℃黑暗培养3天后挑取单菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液体培养基，黑暗下28℃、200r/min振荡培养24小时后再次转接，相同条件下培养16小时。将菌液置于灭菌的离心管中，8000rpm离心5分钟收集菌体，用5％蔗糖溶液重悬菌体，调整至OD600值为0.6-1.0，备用。
(4)农杆菌侵染和共培养
将预培养过的甘薯茎段浸入步骤(3)的农杆菌菌液中，侵染10-15分钟。将茎段取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，切面朝下置于继代培养基上，23℃-25℃下暗培养5天。其中所述继代培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。
(5)农杆菌脱菌及不定芽再生
将共培养后的组织块用无菌水清洗3-4次，再用无菌滤纸吸干，转接至不定芽诱导培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14小时条件下，连续培养20±2天，分化出不定芽。其中所述不定芽诱导培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L KT(激动素)+0.01-0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，并添加200mg/L头孢噻肟钠抑制农杆菌生长。
(6)甘薯小芽的分割及生根
当甘薯茎段上的不定芽长至1厘米左右时，将小芽单独剪下，转移到生根培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14±1小时条件下，连续培养14天。其中所述生根培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，添加200mg/L头孢噻肟钠。
(7)转基因植株的筛选
将已生根的甘薯小苗不伤及根部取出，转接到筛选培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14小时条件下，连续培养14天。其中所述筛选培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，添加200mg/L头孢噻肟钠和25mg/L卡那霉素。
(8)检测及移栽
当小苗经筛选存活、且根系生长良好后，将其不伤及根部取出，除去残存培养基移入土壤，用薄膜覆盖花盆以提高湿度(移栽成活率大于90％)。
当小苗在土壤中长出4-7片新叶，剪取2-3片新叶用CTAB法提取DNA检测。
甘薯叶片经液氮研磨后迅速转移至1.5ml离心管中，加入600μl 65℃预热的2xCTAB提取缓冲液，颠倒离心管混匀，65℃水浴30分钟。混合物冷却至室温后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)，混匀后12000rpm离心10分钟，上清液转移至新管，加入等体积氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，混匀后12000rpm离心10分钟，上清液转移至新管，加入三分之二体积预冷的异丙醇，混匀，12000rpm离心10分钟，弃去上清液。70％乙醇不打散沉淀洗涤3次，弃去乙醇将沉淀晾干。用30μl双蒸水溶解后PCR检测。
本发明所述农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法的特点和有益效果是：(1)不定芽再生速度快，转化周期短，从茎段预处理开始60-80天即可获得转基因植株；(2)以茎段为外植体诱导不定芽可以避免愈伤组织培养中引起的不良变异；(3)本发明的茎段不定芽再生体系再生率高且适用于多种甘薯品种(例如：济薯21，济薯22，美国红心，徐薯18等)，适用性广，克服了基因型对甘薯遗传转化的限制；(4)操作比较简单，易于掌握，重复性好。
本发明提出了一个甘薯遗传转化的新方法，以甘薯茎段为外植体，通过对其侵染及诱导不定芽获得转基因植株，适用于多种基因型，且再生速度快，是一个能够用于甘薯转基因育种的可靠体系。
附图说明
图1示pKGWS7载体图(含gus基因)。
图2示pDONR载体图(含snac1基因)。
图3示p2K7GW7载体图(含snac1基因)。
图4示预培养3天的甘薯茎段。
图5示农杆菌侵染后共培养5天的甘薯茎段。
图6示再生出的不定芽。
图7示小芽再生的植株。
图8示转gus基因PCR检测电泳图，其中M为Marker(DNA/HindIII-EcoRI)，泳道1为质粒对照，泳道2-16为待检测植株，泳道17为野生型对照。
图9示转gus基因PCR阳性植株的GUS染色结果(A图为带叶幼芽，B图为根)。
图10示转snac1基因PCR检测电泳图，其中M为Marker(DNA/HindIII-EcoRI)，泳道1为质粒对照，泳道2-19为待检测植株，泳道20为野生型对照。
具体实施方式
实施例1：
以济薯22为受体材料，转化菌株为携带pKGWFS7载体的农杆菌菌株AGL104(载体购买自Invitrogen公司)。
(1)无菌苗的获得及培养
将甘薯植株距地面10厘米以上部分剪下，用自来水冲洗30分钟，剪去叶片将茎切成2cm左右小段，用70％乙醇消毒1分钟，去净乙醇后用0.1％HgCl₂消毒10分钟，无菌水冲洗4遍，无菌滤纸吸去水分后将茎段放入固体培养基上，在25℃下光照培养。其中所述固体培养基配方为：MS+1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。
(2)甘薯茎段的预培养
将生长30天的甘薯无菌小苗剪去叶片及根，将茎切成0.5-1厘米的小段(每段含1-2个节)，将茎段沿侧芽所在的轴线纵向切成两半，并切去可见的侧芽。经过上述处理的甘薯茎段切面向下置于固体培养基上，25℃暗培养3天。所用固体培养基配方为MS+0.5mg/L NAA+2.0％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8。
(3)菌株的活化及菌液的制备
将4℃保存的农杆菌在添加了50mg/L利福平的YEP固体培养基上划线，28℃黑暗培养3天后挑取单菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液体培养基，黑暗下28℃、200rpm振荡培养24小时后再次转接，相同条件下培养16小时。将菌液置于灭菌的离心管中，8000rpm离心5分钟收集菌体，用5％蔗糖溶液重悬菌体，调整至OD600值为0.8。
(4)农杆菌侵染和共培养
将预培养过的甘薯茎段浸入农杆菌菌液，侵染15分钟。将茎段取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，切面朝下置于继代培养基上，25℃暗培养5天。所用继代培养基配方为MS+0.5mg/L NAA+2.0％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8。
(5)农杆菌脱菌及不定芽再生
将共培养后的组织块用无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干，转接至不定芽诱导培养基上。所用培养基为MS+0.5mg/L KT+0.05mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8，并添加200mg/L头孢噻肟钠抑制农杆菌生长。25℃、每日14小时光照培养20天。不定芽再生频率为80％。
(6)甘薯小芽的分割及生根
当甘薯茎段上的不定芽长至1厘米左右时，将小芽单独剪下，转移到生根培养基上。所用培养基为MS+0.5mg/L NAA+2.0％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8，添加200mg/L头孢噻肟钠。25℃、每日14小时光照培养14天。小芽的生根频率为79.1％。
(7)转基因植株的筛选
将已生根的甘薯小苗不伤及根部取出，转接到筛选培养基上。所用筛选培养基配方为：MS+0.5mg/L NAA+2.0％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8，添加200mg/L头孢噻肟钠和25mg/L卡那霉素。23℃-25℃、每日14小时光照培养14天，抗性小苗约占小苗总数的6.9％。
(8)检测及移栽
当小苗经筛选存活、根系生长良好后，将其不伤及根部取出，除去残存培养基移入土壤，用薄膜覆盖花盆以提高湿度。移栽成活率大于90％。当小苗在土壤中长出4-7片新叶，剪取2-3片新叶用CTAB法提取DNA检测。甘薯叶片经液氮研磨后迅速转移至1.5ml离心管中，加入600μl 65℃预热的2xCTAB提取缓冲液，颠倒离心管混匀，65℃水浴30分钟。混合物冷却至室温后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)，混匀后12000rpm离心10分钟，上清液转移至新管，加入等体积氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，混匀后12000rpm离心10分钟，上清液转移至新管，加入三分之二体积预冷的异丙醇，混匀，12000rpm离心10分钟，弃去上清液。70％乙醇不打散沉淀洗涤3次，弃去乙醇将沉淀晾干。用30μl双蒸水溶解。
PCR检测：向20μl体系中加入以下成分：引物(10μM)P1、P2各1μl，Buffer2μl，MgCl₂ 1.4μl，dNTP(2.5mmol each)0.4μl，DNA模板100ng，Taq酶0.1μl，用水补足20μl。PCR反应条件为：94℃变性5分钟；94℃30秒，52℃40秒，72℃60秒，35个循环；72℃10分钟。1％琼脂糖凝胶电泳检测。(检测gus基因引物：P15’AACCACAAACCGTTCTACTT3’P2 5’CTGATACTCTTCACTCCACA3’)。
结果：利用农杆菌介导的甘薯不定芽转化系统，对济薯22进行了农杆菌转化。三次生物学重复(共200茎段)，通过不定芽再生获得510棵植株，经潮霉素筛选具有抗性植株35株。转基因阳性植株经PCR检测，证明21株为阳性植株。对转基因阳性植株进行GUS染色发现，GUS活性出现在根、茎、叶中，进一步证明了GUS基因转入到甘薯基因组中，并实现了GUS基因的表达。
实施例2：
以济薯21为受体材料，转化菌株为携带有snac1基因(p2K7GW7载体)的农杆菌AGL104。pDONR及p2K7GW7载体购买自Invitrogen公司。
(1)无菌苗的获得及培养
将甘薯植株距地面10厘米以上部分剪下，用自来水冲洗30分钟，剪去叶片将茎切成2cm左右小段，用70％乙醇消毒1分钟，去净乙醇后用0.1％HgCl₂消毒10分钟，无菌水冲洗4遍，无菌滤纸吸去水分后将茎段放入固体培养基上，在25℃下光照培养。其中所述固体培养基配方为：MS+0.5mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。
(2)甘薯茎段的预培养
将生长30天的甘薯无菌小苗剪去叶片及根，将茎切成0.5-1厘米的小段(每段含1-2个节)，将茎段沿侧芽所在的轴线纵向切成两半，并切去可见的侧芽。经过上述处理的甘薯茎段切面向下置于固体培养基上，22℃-25℃暗培养3天。所用培养基为MS+0.5mg/L NAA+2.0％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8。
(3)载体构建
利用gateway方法构建snac1基因的植物表达载体。以水稻的cDNA为模板，通过一次PCR和二次PCR反应获得平末端二次PCR产物。一次PCR体系为：5xPhusion HFBuffer10μl，10mM dNTP 1μl，正向引物(10μM)2.5μl，反向引物(10μM)2.5μl，模板(水稻cDNA)2μl，DMSO 1.5μl，Phusion 0.3μl，H₂O补足至50μl(正向引物N1 5’AAAAAGCAGGCTGGATGGGGATGAGGAGGGAGAG 3’，反向引物N2 5’AGAAAGCTGGGTTTCAGAACGGGACCATGCC3’)。二次PCR体系为：5xPhusion HF Buffer10μl，10mM dNTP1μl，正向引物(10μM)2.5μl，反向引物(10μM)2.5μl，模板(一次PCR产物)2μl，DMSO 1.5μl，Phusion 0.3μl，H₂O补足至50μl(引物attB1-F 5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT 3’，attB1-R 5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT3’)。将二次PCR产物电泳检测，切胶回收目的片段，用回收产物进行BP反应(BP反应体系：二次PCR产物(40-100fmol)3.5μl，pDONR^TMvector(150ng/μl)0.5μl，BPClonase^TMenzyme mixture 1μl)，25℃温育连接2-3小时后取BP反应产物1μl转化大肠杆菌DH5a的感受态细胞。37℃培养12-16小时后挑取单菌落检验。取BP反应后验证为阳性且测序正确的菌扩大培养并提取质粒，进行LR反应，反应体系为：BP产物(40-100fmol)3.5μl，Destination vector(150ng/μl)，BP Clonase^TM enzyme misture1μl，25℃温育连接3-24小时。取LR反应产物2μl转化到大肠杆菌，37℃培养12-16小时后挑取单克隆验证。阳性菌扩大培养后提取质粒，转化到农杆菌AGL104中。
(4)菌株的活化及菌液的制备
将携带有snac1基因的农杆菌接入含有50mg/L利福平的YEP液体培养基，黑暗下28℃、200rpm振荡培养24小时后再次转接，相同条件下培养16小时。将菌液置于灭菌的离心管中，8000rpm离心5分钟收集菌体，用5％蔗糖溶液重悬菌体，调整至OD600值为0.8。
(5)农杆菌侵染和共培养
将预培养过的甘薯茎段浸入农杆菌菌液，侵染15分钟。将茎段取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，切面朝下置于固体培养基上，23℃-25℃暗培养5天。所用培养基为MS+0.5mg/L NAA+2.0％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8。
(6)农杆菌脱菌及不定芽再生
将共培养后的组织块用无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干，转接至不定芽诱导培养基上。所用培养基为MS+0.5mg/L KT+0.05mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8，并添加200mg/L头孢噻肟钠抑制农杆菌生长。23℃-25℃、每日14小时光照培养20天。不定芽再生频率为75％。
(7)甘薯小芽的分割及生根
当甘薯茎段上的不定芽长至1厘米左右时，将小芽单独剪下，转移到生根培养基上。所用培养基为MS+0.5mg/L NAA+2.0％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8，添加200mg/L头孢噻肟钠。23℃-25℃、每日14小时光照培养14天。小芽生根频率为80％。
(8)转基因植株的筛选
将已生根的甘薯小苗不伤及根部取出，转接到筛选培养基上。所用培养基为：MS+0.5mg/L NAA+2.0％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8，添加200mg/L头孢噻肟钠和25mg/L卡那霉素。23℃-25℃、每日14小时光照培养14天。转基因抗性植株约占植株总数的6.2％。
(9)检测及移栽
当小苗经筛选存活、根系生长良好后，将其不伤及根部取出，除去残存培养基移入土壤，用薄膜覆盖花盆以提高湿度。移栽成活率大于90％。当小苗在土壤中长出4-7片新叶，剪取2-3片新叶用CTAB法提取DNA检测。甘薯叶片经液氮研磨后迅速转移至1.5ml离心管中，加入600μl 65℃预热的2xCTAB提取缓冲液，颠倒离心管混匀，65℃水浴30分钟。混合物冷却至室温后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)，混匀后12000rpm离心10分钟，上清液转移至新管，加入等体积氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，混匀后12000rpm离心10分钟，上清液转移至新管，加入三分之二体积预冷的异丙醇，混匀，12000rpm离心10分钟，弃去上清液。70％乙醇不打散沉淀洗涤3次，弃去乙醇将沉淀晾干。用30μl双蒸水溶解。
PCR检测：向20μl体系中加入以下成分：引物(10μM)P1、P2各1μl，Buffer2μl，MgCl₂ 1.4μl，dNTP(2.5mmol each)0.4μl，DNA模板100ng，Taq酶0.1μl，用水补足20μl。PCR反应条件为：94℃变性5分钟；94℃30秒，55℃40秒，72℃60秒，35个循环；72℃10分钟。1％琼脂糖凝胶电泳检测。(检测35S引物：P1 5’GAGATCAAATACCTTCCC3’P2 5’ATTGTGCGTCATCCCTTA 3’)
结果：利用农杆菌介导的甘薯不定芽转化系统，对济薯21进行了农杆菌转化。三次生物学重复(共190茎段)，通过不定芽再生获得513棵植株，经卡那霉素筛选获得抗性植株32株。转基因阳性植株经PCR检测，证明19株为阳性植株。以100、150mmol/LNaCl处理转基因植株与野生型对照，snac1转基因植株鲜重/干重均高于野生型，Na⁺/K⁺比值低于野生型对照，说明耐盐性较野生型有一定的提高。