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用于数字多重PCR测定的方法和装置使用微流控芯片在芯片的微通道中进行实时、连续流式PCR。将样品材料流导入各微通道并且将测定特异性试剂团(boluses)和缓冲液交替地导入流内以形成顺序配置的受试团。对所述受试团进行PCR方法，然后进行热解链方法(thermal melt procedure)。在热解链方法期间，检测荧光输出和收集荧光对温度的数据并且将其与预期的正常相关性(normalcorrelation)相比较。将阳性或阴性的结果转换成数字格式，其中阳性结果指定为“1”，阴性结果指定为“0”，或反之亦然。

1.  一种方法，该方法用于在微流控芯片的多个通道内进行数字多重PCR测定以鉴定多个患者样品的每一个中的DNA序列变异，从而诊断疾病状态、疾病风险或预测各患者的治疗性药物的反应，所述方法包括：
A.对于各患者样品，在通道之一中提供基因组DNA样品流；
B.将测定特异性试剂溶液导入基因组DNA样品流以形成受试混合物；
C.在通道内对受试混合物进行PCR方法；
D.在进行PCR方法后对受试样品进行热解链方法；
E.收集关于热解链方法的数据；
F.分析收集的热解链数据以确定目的DNA序列变异在受试混合物中的存在或不存在；和
G.通过指定表明目的DNA序列变异存在的结果为1和指定表明目的DNA序列变异不存在的结果为0或反之亦然，来将分析步骤的结果转换成数字信号。

2.  权利要求1的方法，其还包括：
H.使用相同的测定特异性试剂溶液重复步骤B至G至少一次以提高目的DNA序列变异的存在或不存在的测定的可靠性。

3.  权利要求2的方法，其还包括：
I.使用适合于鉴定与诊断或预测相关的不同的DNA序列变异的不同的测定特异性试剂溶液重复步骤B至H至少一次；和
J.对步骤B至I的结果进行统计分析以推断出诊断或预测以及诊断或预测的可靠性水平。

4.  权利要求1的方法，其中收集关于热解链方法的数据的步骤包括当进行热解链方法时收集来自受试混合物的荧光特征数据。

5.  权利要求4的方法，其中步骤D包括坡升受试混合物团的温度以及步骤E包括产生信号强度对温度的相关性。

6.  权利要求5的方法，其中步骤F包括将所述相关性与预先确定的预期的相关性相比较并且根据所述相关性与预期的相关性的偏差评估结果。

7.  权利要求4的方法，其中荧光特征包括由受试混合物团发射的荧光。

8.  权利要求6的方法，其中产生信号强度对温度的相关性包括绘制各受试混合物团的荧光对温度曲线，并且比较步骤包括将各荧光对温度曲线的形状与预期的荧光对温度曲线的形状进行比较。

9.  权利要求6的方法，其中产生信号强度对温度的相关性包括绘制各受试混合物团的荧光对温度曲线，并且比较步骤包括将荧光下降至预先确定的水平时所处的温度与预期的荧光下降至所述预先确定的水平时所处的温度相比较。

10.  权利要求1的方法，其中流体芯片是微流控芯片，其包含：
各反应通道的相对末端上的样品池和废液池；
吸浆管；和
从吸浆管散发并且将吸浆管与所述多个反应通道的每一个连接并且经设计将通过吸浆管汲取的物质分配至反应通道的每一个中的通道网络。

11.  权利要求1的方法，其中步骤B包括将一定量的试剂材料和缓冲材料交替地导入每一个通道，从而沿着各通道的长度形成包含与载体液顺序交替的受试溶液团的连续流，其中受试溶液包含样品和试剂材料的混合物，而载体液包含样品和缓冲材料的混合物。

12.  权利要求1的方法，其中可靠性水平是所进行的不同测定的数目的函数。

13.  权利要求1的方法，其中可靠性水平是重复各测定的次数的函数。

14.  权利要求1的方法，其中确定DNA序列变异的存在或不存在包括确定单核苷酸多态性的存在或不存在。

15.  使用包含多个反应通道的流体芯片对多个样品进行多重测定的方法，所述方法包括：
在多个反应通道的每一个中提供连续的样品流；
交替地将一定量的试剂材料和缓冲材料导入每一个通道，从而沿着各通道的长度形成包含与载体液顺序交替的受试溶液团的连续流，其中受试溶液包含样品和试剂材料的混合物，而载体液包含样品和缓冲材料的混合物；
在各通道中的连续流内对受试溶液进行扩增方法；
对各通道内的扩增的受试溶液进行热解链方法；
检测在热解链方法期间由各受试溶液团发射的信号；
分析检测的信号以确定目的核苷酸在受试溶液团中的存在或不存在；和
通过指定结果为1或0来将分析步骤的结果转换成数字格式，其中表明目的核苷酸的存在的结果被指定为1，以及表明目的核苷酸的不存在的结果被指定为0，或反之亦然。

16.  权利要求15的方法，其中检测步骤包括产生信号强度对温度的相关性。

17.  权利要求16的方法，其中检测步骤还包括将产生的相关性与预先确定的预期的相关性相比较并且根据产生的相关性与预期的相关性的偏差评估结果。

18.  权利要求17的方法，其中检测的信号是由受试溶液团发射的荧光。

19.  权利要求18的方法，其中产生信号强度对温度的相关性包括绘制各受试溶液团的荧光对温度曲线，以及比较步骤包括将各荧光对温度曲线的形状与预期的荧光对温度曲线的形状进行比较。

20.  权利要求18的方法，其中产生信号强度对温度的相关性包括绘制各受试溶液团的荧光对温度曲线，并且比较步骤包括将荧光下降至预先确定的水平时所处的温度与预期的荧光下降至所述预先确定的水平时所处的温度相比较。

21.  权利要求15的方法，其中目的核苷酸是单核苷酸多态性。

22.  权利要求15的方法，其中流体芯片是微流控芯片，其包含：
各反应通道的相对末端上的样品池和废液池；
吸浆管；和
从吸浆管散发并且将吸浆管与所述多个反应通道的每一个连接并且经设计将通过吸浆管汲取的物质分配至每一个反应通道的通道网络。

23.  权利要求15的方法，其中通过吸浆管将试剂材料和缓冲材料导入每一个通道。

24.  用于进行数字多重PCR测定的系统，其包括：
微流控芯片，其包括：
多个反应通道；
各反应通道的相对末端上的样品池和废液池；
吸浆管；和
从吸浆管散发并且将吸浆管与所述多个反应通道的每一个连接并且经设计将通过吸浆管汲取的物质分配到每一个反应通道的通道网络；
与微流控芯片整合在一起或与之相邻的并且经设计使内容物沿各通道的界定的区段发生热循环和进行内容物的热解链的温度控制系统；
与微流控芯片整合在一起或与之相邻的并且经设计照明各通道和在沿着各通道的多个位置检测由各通道的内容物发射的荧光信号的光学成像系统；和
控制器，该控制器经编程使系统：
在各反应通道内产生样品材料的连续流；
通过吸浆管将一定量的试剂材料和缓冲材料交替地导入每一个通道，从而沿着各通道的长度形成包含与载体液顺序交替的受试溶液团的连续流，其中受试溶液包含样品和试剂材料的混合物，而载体液包含样品和缓冲材料的混合物；
用温度控制系统使各反应通道的内容物发生热循环以在各通道中的连续流内对受试溶液进行扩增方法；
用温度控制系统对受试溶液进行热解链；
在进行热解链方法后，使用光学成像系统检测由各受试溶液团发射的信号；
分析检测的信号以确定目的核苷酸在受试溶液团内的存在或不存在；和
通过将结果指定为1或0来将分析步骤的结果转换成数字格式，其中表明目的核苷酸存在的结果被指定为1，以及表明目的核苷酸不存在的结果被指定为0，或反之亦然。

25.  权利要求24的系统，其中控制器经设计使温度控制系统坡升受试溶液团的温度。

26.  权利要求25的系统，其中控制器经编程将相关性与预先确定的预期的相关性相比较并且根据所述相关性与预期的相关性的偏差评估结果。

用于数字多重PCR测定的装置和方法
本申请要求2006年11月29日提交的临时专利申请系列号60/867,459的优先权，其通过引用合并入本文。
发明背景
发明领域
本发明涉及使用连续流式多重测定的方法，更具体地，使用其中将结果转换成数字格式的连续流式多重测定的方法。可对多个患者样品中的每一个样品进行多重测定，从而允许高水平的复用性(multiplexing)和灵活性。
相关技术的论述
目前，多重聚合酶链式反应(“PCR”)以静态形式进行，其中各反应在分开的试管、毛细管或多孔板的孔中完成。在所有情况下，可进行的PCR反应的数目受到固定形式中的位置的数目限制。最常见地，使用可允许例如一个待测试患者DNA样品进行达到96个不同PCR测定的96孔格式。在该格式中，可增加被检测的患者DNA样品的数目，但以减少可进行的不同PCR测定的数目为代价。例如，在96孔格式中，可检测24个不同的患者DNA样品，但只能进行4个PCR测定。更近以来，已引入384孔板格式，其增加了可进行的患者-测定组合的数目，但是如果需要进行100个不同的PCR测定，即使该格式也不能容纳超过3个患者的DNA样品。
允许询问(interrogation)数千个基因座的DNA微阵列是对基于板的测定的限制的另一选择，但至关重要的不利方面是对输出数据的可靠性的限制、进行此类测定所需的高昂的费用和长时间以及微阵列是不允许最终用户按需要改变测定的固定格式。
许多诊断患者的疾病状态、诊断发生疾病的风险或预测患者对不同治疗性药物的反应的新型诊断PCR测定关注于鉴定单核苷酸多态性(SNP)。在大多数情况下，多个SNP的确定是精确诊断或预测治疗反应所必需的。绘制人基因组中的所有SNP图谱的努力不断地增加与特定疾病状态或治疗结果关联的SNP的数目。同时进行数十个测定的多重分析是许多诊断和治疗预测应用所必需的。目前存在对允许高复用性和灵活性格式以容纳新靶(当需要时)的PCR测定格式的未满足的需要。
热解链分析(thermal melting analysis)目前在本领域中用于在基于PCR的测定中区分SNP。Wittwer已公开了利用荧光分子测定核酸的热解链特征和基于热解链特征区分SNP的方法和装置。(参见美国专利6,174,670、6,140,054、6,472,156、6,753,141、6,569,627和美国专利申请公开号2003-0224434A1和2005-0233335A1)。然而，这些方法和装置遭受上述相同的限制。
发明概述
本文中描述的发明使得热解链分析能够用于在连续流式PCR微流控芯片(microfluidic chip)中进行的SNP检测，从而产生多重检测的数字输出。
连续流动格式允许单独地和分别地监控多重PCR+热解链测定(Thermal Melt assay)的单个PCR反应和热解链，而不影响多重测定中的其他PCR反应和热解链。连续流动格式允许比96和384孔格式程度更高的复用性，其是复杂的遗传药理学测定(pharmocogeneticassay)所必需的。连续流动格式比静态的、固定的格式更灵活。此外，用户可规定使用的测定数目和进行它们的顺序。数字输出(例如，指定阳性结果为“1”和阴性结果为“0”或反之亦然)简化了结果的解释并且允许容易地将数据传递至数字媒介。
本发明的方面体现在使用包含多个反应通道的微流控芯片对多个样品进行多重测定的方法。该方法包括步骤：在多个反应通道的每一个中提供连续的样品流并且交替地向每一个通道导入一定量的试剂材料和缓冲材料，从而沿着各通道的一部分长度形成包含与载体液(carrier fluid)顺序交替的受试溶液团的连续流。受试溶液包含样品与试剂材料的混合物，而载体液包含样品和缓冲材料的混合物。对各通道内的连续流进行扩增方法，然后在进行扩增方法后检测由各受试材料团发出的信号。分析被检测的信号以确定目的核苷酸在样品材料团内的存在或不存在。通过将结果指定为1或0将分析步骤的结果转换成数字格式，其中表明目的核苷酸存在的结果被指定为1，表明目的核苷酸不存在的结果被指定为0或反之亦然。
本发明的方面体现在用于进行上述方法的系统，所述系统包括微流控芯片，所述微流控芯片包含多个反应通道、各反应通道的相对末端上的样品池(sample well)和废液池(waste well)、吸浆管(sipper)以及从吸浆管散发并且将吸浆管与所述多个反应通道的每一个连接并且经设计将由吸浆管汲取的物质分配至每一个反应通道的通道网络。系统还包括温度控制系统和光学成像系统，所述温度控制系统经设计使受试溶液沿着每一个通道的界定的区段进行热循环以在受试溶液中进行实时PCR，所述光学成像系统与微流控芯片整合在一起或与之相邻并且经设计用来照明各通道和在沿着各通道的许多位置上检测荧光信号。系统还包括经编程使系统进行数字多重PCR测定的控制器。
本发明的其他方面，包括操作方法以及结构元件和功能元件的功能和相互关系，将在考虑下列描述和所附的权利要求，参考附图后变得更明了，其全都形成本公开内容的部分，其中相同的参考数字指示不同图中的相应部分。
附图概述
图1是可用于执行本发明的实时PCR结构的方框图(blockdiagram)；
图2(A)是可用于实施本发明的微流控芯片的侧视图；
图2(B)是图2(A)的微流控芯片的顶视图；
图2(C)是图2(B)的微流控芯片的微流控通道的放大图；
图3是显示多个测定的曲线和显示杂合型和野生型曲线的荧光对温度图；
图4是显示对30个患者DNA样品和2个对照进行的8个多重测定(每一个进行2次)的测定结果的阵列的表；和
图5是举例说明体现本发明的使用连续多重数字测定进行诊断或预测的方面的方法的流程图。
发明详述
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域内的技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实施，但优选的材料和方法描述于本文中。
图1举例说明可用于实施本发明的实时PCR结构的方框图。系统包括受试溶液贮器(reservoir)101，其可以是包含多种受试溶液例如受试样品的贮器。系统还包括载体液贮器102。受试溶液贮器和/或载体液贮器可在与微流控装置连接的药液筒(cartridge)例如在共同转让的美国专利申请系列号11/850,229(其公开内容通过引用合并入本文)中描述的药液筒内包含小室。受试溶液可以基本上与载体液相同，除了受试溶液包含所有必需的实时PCR试剂。实时PCR试剂混合物可包含PCR引物、dNTP、聚合酶、盐、缓冲液、表面钝化剂(surface-passivating agent)等。此外，实时PCR混合物可包含非特异性荧光DNA检测分子、序列特异性荧光DNA探针或标志物。载体液可以是不相混溶的液体(例如油、氟化液体或任何其他非水性或疏水性溶剂)。载体液的目的是阻止材料从一个受试团至另一个受试团的转移。载体液的另一个目的是在液团之间提供可用于在通道中追踪液流的可辨别的过渡物。载体液可包含标志物。
受式溶液和载体液通过例如开关104被导入微通道103。微通道的尺寸小至足以允许进行最初存在于受试溶液中的单个DNA分子的扩增和检测。在本发明中，微通道103是作为微流控装置(例如图2中所示的)的一部分的几个微通道中的一个。开关104在主控制和处理计算机105的控制之下，以使载体液和受试溶液被顺序交替地导入微通道103。选择导入微通道103的受试溶液和载体液的体积以使它们在移动通过微通道103的过程中发生混合的程度最低。
备选地，可以在微通道103中以连续流的形式提供样品材料，可通过吸浆管将测定特异性试剂和缓冲材料交替地导入样品材料的连续流，如下面更详细地描述的。
因此，作为不同受试溶液(所述每一种不同受试溶液被载体液分隔开)通过微通道103的连续移动的结果，可在相同的微通道103中进行许多串联的反应(或顺序的反应)。其中，如在本发明中，微通道103是微流控装置中的几个微通道中的一个，因而也可在微流控装置的微通道中平行进行许多反应。载体液和受试溶液通过微通道103的流速受泵机械装置106的控制。泵机械装置106在主控制和处理计算机105的控制之下以调节受试溶液和载体液在微通道103中的流速。调节流速以便当受试溶液通过微通道103时进行期望数目的PCR循环。
泵机械装置106可通过微通道103的上游侧或入口处的正压或通过微通道103的下游侧或出口处的负压调节受试溶液和载体液的流速。在一个实施方案中，压力差是大约1psi，尽管可使用其他压力差。微通道103的长度适合于当受试溶液移动通过微通道103的反应区时，完成期望数目的PCR循环，例如10至50个PCR循环，或其间的任何数目的循环。微通道103的反应区是其中使温度发生循环以进行PCR循环的微通道的区域。通常，对于标准扩增反应进行25-30、25-35、25-40、30-35、30-40或35-40个PCR循环。完成期望数目的PCR循环的微通道103的长度也取决于顺序交替移动通过微通道103的受试溶液和载体液的体积。例如，如果反应区是40mm，那么受试溶液的最小体积将在微通道103的反应区中占据1mm，并且受试溶液的最大体积在微通道103的反应区中占据20mm。因此，在该非限定性实例中，当受试溶液移动通过微通道103的反应区时可扩增最少1个样品和最多20个样品。当然，可选择微通道长度和样品体积来扩增任何数目的样品。
在系统中包含温度控制系统107来控制和循环温度以在受试溶液移动通过微通道103时产生适合进行PCR循环的温度。适合进行PCR循环的温度对于本领域技术人员来说是熟知的并且可包括大约85℃至大约100℃的范围内的第一温度、大约20℃至大约70℃的范围内的第二温度和大约55℃至大约80℃的范围内的第三温度。温度控制系统107与微通道103或微流控装置的微通道整合在一起或与之相邻。温度控制系统107包括加热器108、冷却器109、温度传感器110和温度控制器111。温度控制器111从温度传感器110收集温度信息并且基于温度信息产生控制信号。控制信号被传送至加热器108或冷却器109以在微通道103中使温度发生循环来进行期望的PCR循环。温度控制器111在主控制和处理计算机105的控制之下，以使温度发生循环以便当受试溶液移动通过微通道103时进行期望数目的PCR循环。不同受试溶液中的不同PCR反应，由于在微通道103中的连续流动，以串联的方式在微通道103中连续地进行。
可通过吹入适当温度的空气来进行微通道103的加热和冷却。备选地，可通过循环水浴或流体浴(fluid bath)或通过对于本领域技术人员来说是熟知的帕尔帖效应元件(Peltier-effect element)来进行加热和冷却。电流通过的不同金属的接头使得可能冷却或加热小表面。帕尔帖元件上的温度探针使得可能调节与电强度(electricalintensity)成正比的功率，从而使得可能调节温度。金属块可用作热转移元件并且包括与金属块接触的热电冷却器。该金属块可由任何具有适当的热转移性质的金属(或合金)例如铝制造。为了减少光从金属块的背散射，优选将金属块涂成黑色或作阳极化处理。对于该热转移单位，PCR循环的温度可以以适当的时间间隔平衡。例如，PCR循环的温度可在大约1-2秒内或甚至更快平衡。
温度控制系统107优选使温度在微通道103的整个界定的区段内(即其中进行PCR循环的微通道103的区段)循环。微通道103的该界定的区段也称为反应区。因此，恒温区用于提供热循环。适当编程的计算机控制热转移元件的温度循环。此外，对通道的长度(反应区)进行加热和冷却，以使其温度及时遵循PCR特征。将受试液团以这样的流速(速度)泵入通过该反应区，所述流速使得在液团从反应区的上游端流至下游端的时间内完成所需的PCR循环次数。
备选地，温度控制系统107沿着微通道103应用空间温度区(spatial temperature zone)来实现聚合酶链式反应。在一个方面，使用热转移元件沿着微通道103或微流控装置的微通道的部分来使温度循环。在另一个方面，热转移元件在微通道103的部分中使温度循环。适当地编程的计算机控制热转移元件的温度循环。根据本发明，对通道的部分进行加热和冷却以使满足PCR温度特征。将受试液团以一定的流速(速度)泵入通过该反应区以使在液团从反应区的上游端流至下游端的时间内完成所需的PCR循环的次数。
光学成像系统112检测表明SNP或其他目的核酸(即，扩增产物)的存在和可能地其数量的发射物(例如，荧光或化学发光)以及监控微通道103中的受试溶液的流速。在一个实施方案中，光学成像系统112是优选包括一个或多个激发源113、一个或多个光学器件/滤光片114和一个或多个检测器115的荧光成像系统。激发源113产生具有期望的波长的光来激发标记，所述标记用于在实时PCR中检测扩增产物，和/或来检测可存在以监控微通道103中的受试溶液的流速的标志物。光学器件/滤光片114用于形成光束和/或将来自激发源113的光导向微通道103上的适当位置。光学器件/滤光片114也用于过滤光以消除具有不期望的波长的光或减少到达检测器115的光的背散射。激发用于实时PCR的标记的期望的波长将取决于所使用的精确标记和/或标志物例如嵌入染料、分子信标、量子点(quantum dot)或探针，所述波长对于本领域技术人员来说是熟知的。类似地，精确标记和/或标志物的发射波长对于本领域技术人员来说是熟知的。检测器115检测被激发的标记和/或标志物的发射波长和测量发射的光的强度。光学成像系统112优选能够区分微流控装置中的多个微通道。
光学成像系统112在主控制和处理计算机105的控制之下，所述计算机指导光学/荧光成像系统112以期望的时间间隔(例如在每一个PCR循环过程中至少一次)在微通道103中的或微流控装置的微通道中的多个位置上测量发射光的强度。检测器115产生发射光的强度的信号或图像以及将其导向主控制和处理计算机105以进行扩增产物的分析和监控受试溶液的流速。检测器115可包括多像素阵列检测器(例如CCD检测器)和/或不连续的单一像素或非成像检测器。检测器115可以与微通道103或与微流控装置的微通道整合在一起或与之相邻。检测器115可以是固止的或可以进行扫描。检测器115应当具有适当的分辨率以获得有意义的结果和用于监控微通道103中液体流动，特别地因为流体在微通道103中连续地移动。
如上所述，实时PCR混合物可包含非特异性荧光DNA检测分子(例如嵌入染料)、序列特异性荧光DNA探针(例如分子信标、探针或量子点探针)或流动标志物(例如量子点)，并且载体液可包含流动标志物。在一个实施方案中，光学成像系统112用于检测来自DNA检测分子或探针的荧光强度(即荧光信号的强度)和/或检测标志物的荧光。标志物的荧光可用于区分载体液与受试溶液，也可用于测定和监控受试溶液或载体液的流速。荧光信号的强度可用于检测扩增的产物，用于测定扩增产物的量，用于测定存在于受试溶液中的初始分子的数目等，这对于进行实时PCR的技术人员来说是熟知的。荧光信号的强度还可用于测定和监控受试溶液的流速。
可在PCR温度循环中的特定的时间和/或温度下测量荧光信号的强度(例如，拍摄荧光信号的图像)。备选地，可在每一个PCR循环中测量荧光信号的强度一次。根据本发明的一个方面，可在PCR步骤后在热解链过程中测量发射。
捕捉图像的最佳时间取决于所使用的化学药品。例如，如果使用嵌入染料检测扩增产物，那么应当在PCR循环的延伸期结束时捕捉图像。如果使用探针检测扩增产物，那么可在PCR循环的任何时间的捕捉图像。主控制和处理计算机105可经编程以在期望的时间和温度下拍摄图像。光学成像系统112可经设计用于在多个位置测量荧光信号的强度。在其上测量荧光信号强度的多个位置可以是微通道的不同区段。在其上测量荧光信号强度的多个位置可以是微通道的整个界定的区段(即，反应区)。备选地，可产生至少一个沿着通道的长度的荧光信号的图像。在另外的实施方案中，重复地在连续的温度循环期进行图像捕捉。可使用多像素阵列检测器(例如CCD或CMOS成像传感器)或单像素检测器产生图像或测量荧光信号的强度。可使用大视场成像光学器件和/或小视场光学器件例如光纤/透镜组合来收集荧光。固定机制或扫描机制或两者可用于捕捉图像。用适当编程的计算机处理关于荧光信号强度的数据。
在受试溶液已移动通过微通道103和完成期望的PCR循环次数后，其可任选地被送至PCR后分析仪116。PCR后分析仪116可包括可对PCR扩增产物使用的任何分析技术。此类技术包括但不限于测序、电泳、探测、解链曲线分析(melt curve analysis)等。
连续流式PCR芯片装置的一个实例描述于共同转让的美国专利申请系列号11/850,229，“Chip and Cartridge Design Configurationfor Performing Micro-Fluidic Assays”(其公开内容通过引用合并入本文)中。在‘229申请中描述的芯片中，通过与芯片顶部连接的具有样品贮藏小室(sample-holding chamber)的药液筒将DNA样品导入芯片的顶部。各药液筒与样品池(sample well)相通，从而使各通道成为单个患者DNA样品的连续流。通过将试剂从外部的容器吸取至微流控芯片的吸浆管将试剂导入该连续流。本发明的方面包括微流控芯片结构例如11/850,229申请中描述的微流控芯片结构的应用，所述微流控芯片结构允许以连续流动的格式进行多重PCR测定，例如需要多达100个PCR反应的遗传药理学测定，对于每一个PCR反应都有分别的数字输出。连续流式PCR芯片装置的另一个实例描述于共同转让的美国专利申请系列号11/606,006，″Systems and Methods forMonitoring the Amplification and Dissociation Behavior of DNAMolecules″(其公开内容以其全文通过引用合并入本文)中。
图2(A)-(C)显示了多通道微流控芯片120，其在通常具有图1中显示的和上述的结构的系统内进行处理并且经设计用于执行本发明的方面。图2(A)显示微流控芯片120的侧视图，图2(B)显示微流控芯片120的顶视图。图2(C)以放大的方式显示流过微流控芯片120的单个通道103的连续流式多重测定。
如图2(B)中所示，微流控芯片120包括患者样品池122(在该处处，患者的样品材料被导入从各池122延伸的通道103内)。在图2显示的举例说明性实施方案中，存在用于患者样品的32个池122和32个相连接的通道103。图2(B)中显示的实施方案是非限定性实例；芯片可具有多于或少于32个的样品池和连接的通道。
在举例说明的实施方案中，如图2(A)中所示，微流控芯片120包括用于汲取用于各测定的试剂混合物(溶液)(对于特定SNP是特异性的PCR引物、双链结合染料、任选的探针、缓冲剂等)的单个吸浆管126。
微流控芯片120还包括在完成测定后在该处贮存材料的废液池124。备选地，可在完成测定后将材料从废液池124导向外部废液室(未显示)。
参考图2(C)，各通道103内的流动是从左至右，并且流动终止于废液池124。将每一个患者DNA样品预先装载入32个池122中的一个，然后通过例如对通道103的相对末端施用真空来从池122吸取样品材料的连续流使之通过通道103。通过在盛装期望的试剂混合物的容器和盛装缓冲液的容器之间移动吸浆管126来交替地汲取测定特异性试剂材料(即，“试剂混合物”)和缓冲汲取液通过吸浆管126。将各试剂混合物和缓冲液汲取液在通道128的网络中分开数次以将相同试剂混合物和缓冲液分配入每一个含有患者DNA的通道103中。因此，各通道包含患者DNA的连续流，和沿着通道103散布的特异性成套试剂或“小滴”或“团”132以及缓冲液130。各成套试剂132可包含用于进行不同PCR测定和鉴定不同SNP的不同测定特异性试剂，或两个或更多个成套试剂132可包含相同的测定特异性试剂。
作为对吸浆管的备选，可通过其他工具例如热加热式(thermalheating)(气泡喷射式(bubble jet))或压电式打印机械装置将试剂和染料导入通道。
通过在主控制和处理计算机105的控制下的温度控制系统107沿着通道103的长度进行热循环，当液流沿着通道103移动时，PCR反应在成套试剂132中进行。在通道103的末端，在进入废液池124之前，并且当仍然在移动时，坡升(ramp up)各试剂小滴132的温度以在小滴132内进行DNA的热解链，同时使用在主控制和处理计算机105控制下的光学成像系统112监控适当的荧光特征。各小滴的数据输出是作为温度的函数的荧光特征，如下所述将其转换成数字信号。
沿着每一个通道103连续进行PCR测定，并且以平行的方式在不同的通道103间进行患者DNA样品的测定。
表1

表1举例说明了基于患者和需要分析的SNP的不同数目的不同的可能的测定复用方案(multiplexing scenario)。对于10个患者样品，每一个样品需要鉴定10个SNP，必须进行总共100个检测(PCR测定)，对于10个患者样品，每个样品需要鉴定25个SNP，必须进行250个检测等。
图2(B)中显示的示例性芯片120可容纳表1中所列的任何检测要求。即，芯片120可容纳达到32个不同患者样品，并且可在沿着通道103的长度顺序排列的成套试剂132中进行的检测的次数只受到可获得的样品材料的量的限制，其可以是10至100或更多个顺序排列的检测。
图3显示8个不同样品的单个热解链SNP测定结果的示例性荧光对温度曲线。实际的荧光对温度曲线与预先确定的预期的曲线的比较可表明结果是“野生型”(即，正常的)还是杂合的(即，异常的)。存在许多可用于比较的荧光对温度曲线的特征。在举例说明的实例中，使用荧光下降至预先确定的水平时所处的温度。例如，在举例说明性实施方案中，可比较荧光下降至70％时所处的温度。4个上方的曲线展示预先确定为正常的特征，即荧光在大约84.7℃下降至70％，从而表明为野生型，4个下方的曲线展示与预先确定的正常特征不同的特征，即荧光在大约83.6℃下降至70％，从而表明为杂合子。曲线的其他特征性质可用于比较，例如曲线的斜率、形状或平滑度(smoothness)、曲线下的面积等。然后通过例如指定杂合子基因型为“1”以及野生型为“0”来将SNP检测结果转换成数字信号。备选地，可将杂合子指定为“0”，野生型指定为“1”。
在其他应用中，本发明的方法可用于检测除了SNP外的目的DNA序列变异。DNA序列变异的实例包括但不限于插入、缺失、点突变和重排。此外，可选择适当的解链曲线来区分野生型和DNA序列变异的纯合性以及区分野生型、DNA序列变异的杂合性和DNA序列变异的纯合性。
图4显示来自对30个患者DNA样品和2个对照DNA样品进行的8个SNP多重测定(A-H)的示例性数字输出。8个PCR反应和热解链中的每一个进行两次。各列表示对30个患者样品和2个对照的每一个进行的单个SNP测定的结果，各行表示对单个患者或对照进行的所有SNP测定(A-H)的结果，每个测定进行2次。
为了增加特定患者样品的任何给定的SNP测定的观察到的结果的可靠性，相同的SNP测定可进行两次或更多次，测定的每一次额外的执行增加观察到的结果的可靠性。为了增加诊断或治疗反应预测的可靠性，其中多个SNP可与特定的诊断或预测相关，可对患者样品进行2个或更多个相关SNP的检测。然而，如果可用少于所有SNP的SNP获得充分可靠的诊断或预测，则可以不必分析所有可能的与特定诊断或预测相关的SNP。
在一个实施方案中，本发明任选地包括进行测定结果(从一个或多个检测获得的)的一个或多个统计或概率分析以推算诊断或预测的可靠性水平的统计或概率系统软件。例如，统计或概率分析可包括Poisson分析、Monte Carlo分析、遗传算法的应用、神经网络训练(neural network training)、马尔可夫建模(Markov modeling)、隐马尔可夫建模、多维尺度分析(multidimensional scaling)、偏最小二乘(PLS)分析和/或主成分分析(PCA)。统计或概率分析任选包括定量地测定诊断或预测的可靠性水平。
用于理解产生和分析数据的方法以及其他相关概念的一般参考资料包括：Weiss(Introductory Statistics，第7版，Addison-Wesley，Reading，Mass.，2004)；Weiss(ElementaryStatistics，第5版，Addison-Wesley，Reading，Mass.，2001)；Berinstein(Finding Statistics Online：How to Locate theElusive Numbers You Need，Information Today，Medford，N.J.，1998)；Everitt，(The Cambridge Dictionary of Statistics，Cambridge University Press，New York，1998)；Kotz(Encyclopediaof Statistical Sciences，第1-9卷和补充材料，Wiley，New York，1988)；Dillon和Goldstein(Multivariate Analysis：Methods andApplications，Wiley，New York，1984)；Tabachnick和Fidell(Using Multivariate Statistics，HarperCollins CollegePublishers，New York，1996)；Box等人(Statistics forExperimenters，Wiley，New York，1978)；Cornell(Experimentswith Mixtures，Wiley，New York，1990)；John(Statistical Designand Analysis of Experiments，SIAM，Philadelphia，1998)；Gibas和Jambeck(Bioinformatics Computer Skills，O′Reilly，Sebastipol，Calif.，2001)；Pevzner(Computational MolecularBiology and Algorithmic Approach，The MIT Press，Cambridge，Mass.，2000)；Durbin等人(Biological Sequence Analysis：Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids，CambridgeUniversity Press，Cambridge，UK，1998)；以及Rashidi和Buehler(Bioinformatic Basics：Applications in BiologicalScience and Medicine，CRC Press LLC，Boca Raton，Fla.，2000)。这些参考资料中每一个的公开内容通过引用合并入本文。
上面提及的统计功能也可整合入系统软件，所述软件例如包含于主控制和处理计算机105中或包含于PCR后分析仪116中，包含于计算机内存中或计算机可读介质上。
例如，对于特定的疾病，假定存在10个已知的与进行特定遗传易感性或携带者状态(carrier state)(例如，疾病或发生疾病的风险)的诊断相关的SNP。患者样品的诊断可通过对患者样品进行10个相关SNP检测中的5个来开始。各SNP检测的结果是1(杂合子)或0(野生型)。各SNP检测可进行多次以确保观察到的结果(1或0)是正确的可靠性水平。如果，当完成5个SNP检测时，所有5个检测表明患者确实携带或不携带疾病或发生疾病的风险，则可具有合理的诊断可靠性水平，可以不必进行进一步的检测。在另一方面，如果2个SNP检测表明患者确实携带或没有携带疾病而其他3个表明相反的结果，那么最终诊断的可靠性水平不可能是高的，因而必须进行进一步的SNP检测(仍然可获得另外多至5个SNP检测)。
根据本发明，在通过微流控通道的患者样品材料的连续流中容易地进行多个不同的SNP检测和进行单个SNP检测多次，其中，对于待进行的每一个SNP检测，将一定量的适当的测定特异性试剂汲入通道。当期望额外的SNP检测以增加诊断或预测的可靠性水平(无论期望额外的不同的SNP检测还是需要重复已进行的SNP检测)时，这可按照本发明来实时测定和进行。SNP检测结果是简单的和数字的，即1或0，并且在诊断或预测方面检测结果的含意是已知的。因此，如果，在观察许多检测结果后，确定需要额外的检测，那么可在通过微流控通道的患者样品的连续流中导入额外的测定特异性试剂(所述试剂相应于待重复的检测或待进行的额外的不同的检测)。
图5中显示举例说明根据本发明的方面用于进行关于疾病、发生疾病的风险的诊断或进行关于治疗性药物的治疗的预测的方法的流程图。在步骤140中，将样品材料-优选基因组DNA材料提供至反应通道。例如，可向微流控芯片120的样品池122提供样品材料，这样当对通道103施用真空时，样品材料将流入通道103。在步骤142中，如上面所描述的，通过例如经由吸浆管126交替地吸取待分配入通道103的试剂和缓冲液来向通道103内的样品材料中加入测定特异性试剂。
在步骤144中，如上面所描述的，当成套试剂沿着通道103进行时，对试剂/样品混合物即对成套试剂132进行PCR方法。在步骤146中，当样品沿着通道103进行时，对样品进行热解链方法。在步骤150中获得关于样品材料的荧光对温度特征，和在步骤152中，分析荧光特征数据以获得关于目的SNP的存在的数字结果(1或0)。如果检测结果是不明确的(步骤154)，通过重复相同的测定(步骤158)一次或多次来获得更多的检测结果可增加检测结果的可靠性。通过例如本领域技术人员已知的任何适当的统计分析技术在步骤156中将重复检测数据整合，以获得明确的结果。
当检测结果明确时(步骤160)，可对样品进行额外的不同的测定(步骤162)以获得更多的与诊断或预测相关的“数据点”。可多次进行每一个不同的测定(步骤154、156、158)以获得关于对样品进行的各测定的明确结果。通过例如对于本领域技术人员来说是已知的任何适当的统计分析技术(步骤166)在步骤164中将额外的检测数据整合，然后在步骤168中报告具有可靠性水平的所得的诊断或预测(例如，“检测以95％的可靠性水平表明患者Jones是疾病X的携带者)。
用于进行图5的方法的系统优选是自动化的和计算机控制的，并且通过该系统产生的数据是鉴定各PCR反应的结果的连续的字节流。
本文中描述的某些方面和示例性实施方案公开了使用荧光监控热解链的方法。本发明不限于这些方面和示例性实施方案。在其他方面，热解链可通过其他方法来监控，所述其他方法通过例如紫外吸收或使用非荧光报告染料或分子来检测双链DNA的分离。
除非在本文中另外指出或通过上下文明确地与之相反，术语“一个”和“一种”和“该”和相似的所指对象在描述本发明的上下文中(特别地在下列权利要求的上下文中)被解释为包括单数和复数。除非另外指出，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即，表示“包括，但不限于”)。除非在本文中另外指出，本文中值的范围的引用只意欲用作个别地提及落在范围内的每一个分离值的速记法，并且将各分离值整合入说明书中，就如其在本文中被单独地引用一样。除非在本文中另外指出或通过上下文明确地与之相反，本文中所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外声明，本文中提供的任何和所有实施例或示例性措辞(例如，“例如”)的使用仅为了更好地说明本发明而不对发明的范围施加限制。本说明书中的措辞不应当解释为表示任何未要求的成分为本发明的实施所必需的。
将认识到，本发明的方法和组合物可以以多种实施方案的形式整合，本文只公开其中的少数。在阅读上述说明书后，这些实施方案的变化形式对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明者预期本领域技术人员可使用此类变化形式(适当时)，并且本发明者预期可不按本文中所明确描述的实施本发明。因此，本发明包括其所附的权利要求中引用的主题的所有改变和等同物，如适用的法律所允许的。此外，除非在本文中另外指出或通过上下文清楚地与之相反，在其所有可能的变化形式中上述要素的任何组合包括在本发明中。