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喷气燃料组合物及其制备和使用方法
    在先相关申请

    本申请依据35U.S.C.§119(e)主张2006年11月21日提交的美国临时专利申请号60/860,853以及2007年7月23日提交的美国临时专利申请号60/951,235的权利，其全文均通过参考并入本发明。

    【技术领域】

    除了别的以外，本发明提供了喷气燃料组合物及其制备和使用方法。在一些实施方案中，该燃料组合物包含至少一种可至少部分地由微生物容易和有效地生成的燃料组分。在特定的实施方案中，本发明提供的燃料组合物包含生物工程燃料组分。在进一步的实施方案中，本发明提供的燃料组合物包含蒈烷、蒎烷、桧烷或其组合。

    背景技术

    生物燃料通常指来自于生物质(即，最近存活的有机体或其代谢副产物，例如动物的粪肥)的燃料。生物燃料是理想的，因为其与其它天然来源如石油、煤炭和核燃料不同，它是一种可再生能源。然而，适于用作喷气燃料的生物燃料尚待开发。因此，对用于喷气发动机的生物燃料存在需求。本发明提供了这样的生物燃料。

    【发明内容】

    除了别的以外，本发明提供了包含C10二环类异戊二烯的燃料组合物及其制备和使用方法。这些化合物可显示出用于制备优良的喷气或导弹燃料的物理属性的良好平衡。在特定的实施方案中，C10二环类异戊二烯至少部分地由微生物容易和有效地生成。

    一方面，本发明提供了燃料组合物，其包含(a)占燃料组合物总体积的至少2％体积量的C10二环类异戊二烯；以及(b)占燃料组合物总体积的至少5％体积量的石油为基础的燃料。在一些实施方案中，该燃料组合物具有等于或大于38℃的闪点。在进一步的实施方案中，该燃料组合物在15℃下具有约750kg/m3至约850kg/m3的密度。

    另一方面，本发明提供了燃料组合物，其包含：(a)占燃料组合物总体积的至少10％体积量的C10二环类异戊二烯；以及(b)占燃料组合物总体积的至少40％体积量的煤油。在一些实施方案中，该燃料组合物在15℃下具有约750kg/m3至约840kg/m3的密度。在进一步的实施方案中，该燃料组合物具有等于或大于38℃的闪点。在更进一步的实施方案中，该燃料组合物具有低于-40℃的冻点。

    另一方面，本发明提供了制备燃料组合物的方法，其包括如下步骤：(a)将C10类异戊二烯起始原料与氢在催化剂的存在下相接触，以形成C10二环类异戊二烯；并(b)将该C10二环类异戊二烯与燃料组分相混合，以制备该燃料组合物。在特定的实施方案中，该C10类异戊二烯起始原料为蒈烯、α-蒎烯、β-蒎烯、桧烯或其组合。

    另一方面，本发明提供了从单糖制备燃料组合物的方法，其包括如下步骤：(a)在适于制备该C10类异戊二烯起始原料的条件下，将能够生成C10类异戊二烯起始原料的细胞与该单糖相接触；(b)将该C10类异戊二烯起始原料转化为C10二环类异戊二烯；并(c)将该C10二环类异戊二烯与燃料组分相混合，以制备该燃料组合物。在特定的实施方案中，该C10类异戊二烯起始原料为蒈烯、α-蒎烯、β-蒎烯、桧烯或其组合。

    另一方面，本发明提供了车辆，其包括内燃机、与该内燃机连接的燃料箱、以及燃料箱中的本发明公开的燃料组合物，其中该燃料组合物被用于向该内燃机提供动力。在一些实施方案中，该内燃机为喷气发动机。

    在另一方面，本发明提供了向发动机提供动力的方法，其包括燃烧本发明公开的一种或多种燃料组合物的步骤。在特定的实施方案中，该发动机为喷气发动机。

    在一些实施方案中，本发明公开的燃料组合物中的C10二环类异戊二烯为(或包括)蒈烷、蒎烷、桧烷或其组合。

    在特定的实施方案中，本发明公开的燃料组合物中的石油为基础的燃料为煤油、Jet A、Jet A-1、Jet B或其组合。在其它实施方案中，本发明公开的燃料组合物达到了针对Jet A、Jet A-1或Jet B的ASTM D 1655规范。

    【附图说明】

    图1为用于生成异戊烯二磷酸(“IPP”)地甲羟戊酸(“MEV”)途径的示意图。

    图2为生成IPP和二甲基丙烯焦磷酸脂(“DMAPP”)的DXP途径的示意图。Dxs为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶；Dxr为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(也称为IspC)；IspD为4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶；IspE为4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶；IspF为2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸合成酶；IspG为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(IspG)；IspH为异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶。

    图3为将一个IPP分子和一个DMAPP分子转化为香叶基二磷酸(“GPP”)的示意图。已知催化该步骤的酶是，例如，香叶基二磷酸合成酶。

    图4A-B显示了表达质粒pAM408、pAM409和pAM424的图谱。

    图5A-E显示了载体pAM489、pAM491、pAM493、pAM495和pAM497的插入片段的图谱。

    图6显示了表达质粒pTrc99A-APS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-CS和pTrc99A-SS的图谱。

    图7显示了表达质粒pRS425-leu2d-APS、pRS425-leu2d-BPS、pRS425-leu2d-CS和pRS425-leu2d-SS的图谱。

    图8显示了针对本发明公开的燃料组合物的特定实施方案的ASTM D1655测试数据。

    图9显示了Jet A以及Jet A和AMJ-400的特定混合物的蒸馏曲线。

    定义

    由ASTM国际公布的ASTM D 1655规范对Jet A、Jet A-1和Jet B提出了一些最低验收要求。

    “生物工程化合物”指由宿主细胞(包括任意的古细菌、细菌或真核细胞或微生物)生成的化合物。

    “生物燃料”指来自于生物量(即，最近存活的有机体或其代谢副产物，例如牛的粪肥)的任意燃料。与其它天然来源如石油、煤炭和核燃料不同，它是一种可再生能源。

    “蒈烷”指如下化合物

    “C10二环类异戊二烯”指包含两个环状部分的由10个碳原子组成的全饱和类异戊二烯化合物。在特定的实施方案中，该C10二环类异戊二烯选自：蒈烷(即，3，7，7-三甲基-二环[4.1.0]庚烷；CAS号554-59-6)、蒎烷(即，2，6，6-三甲基-二环[3.1.1]庚烷；CAS号473-55-2)、以及桧烷(即，4-甲基-1-(1-甲基乙基)二环[3.1.0]己烷；CAS号471-12-5)及其组合。

    “C10类异戊二烯起始原料”指香叶基焦磷酸(“GPP”)或能够由GPP衍生的化合物。

    “密度”指在特定温度下单位体积的质量。测定燃料密度的常规可接受的方法是ASTM标准D 4052，其作为参考并入本发明。

    “含硫试验”是对石油为基础的燃料(例如喷气燃料和煤油)中硫醇的检测。该试验还可提供该燃料中可能存在的硫化氢和元素硫的信息。测定燃料冻点的常规可接受的方法是ASTM标准D 4952，其作为参考并入本发明。

    “闪点”指在应用火源时使得易燃液体上的蒸汽在空气中燃烧的最低温度。通常每种易燃液体具有蒸气压，该蒸气压是该液体的温度的函数。随着温度上升，该液体的蒸气压也上升。随着蒸气压上升，空气中蒸发的液体的浓度也上升。在闪点温度下，正好有足够量的液体被蒸发，将该液体上方的蒸气-空气空间带到易燃性下限之上。例如，汽油的闪点为约43℃，这也是为什么汽油是高度易燃的。出于安全的理由，希望用于喷气发动机的燃料具有更高的闪点。测定燃料闪点的常规可接受的方法是ASTM标准D 56、ASTM标准D 93、ASTM标准D 3828-98，其均作为参考并入本发明。

    “冻点”指已被冷却至蜡状晶体形成的燃料，在进行加温时最后的蜡状晶体熔解时的温度。测定燃料冻点的常规可接受的方法是ASTM标准D 2386，其作为参考并入本发明。

    “燃料”指一种或多种烃、一种或多种醇、一种或多种脂肪酸酯或其混合物。优选地，可使用液体烃。燃料可用于向内燃机提供动力，例如，往复发动机(例如，汽油发动机和柴油发动机)、Wankel发动机、喷气发动机、一些火箭发动机、导弹发动机、以及燃气涡轮发动机。在一些实施方案中，燃料通常包含烃类，例如烷烃、环烷烃和芳香烃的混合物。在其它实施方案中，该燃料包含C10二环类异戊二烯。在其它实施方案中，燃料包含单独的蒈烷、蒎烷和桧烷或其混合物。

    “燃料添加剂”指向燃料添加以改变该燃料的性质(例如，提高发动机性能、燃料处理、燃料稳定性、或污染控制)的化学组分。添加剂的类型包括，但不限于：抗氧化剂、热稳定性改进剂、十六烷值增进剂、稳定剂、低温流动性改进剂、助燃剂、消泡剂、消光雾添加剂、缓蚀剂、润滑性能改进剂、防冰剂、喷射器清洁添加剂、防烟剂、减阻添加剂、金属减活剂、分散剂、去污剂、破乳剂、染料、标记物、防静电剂、杀虫剂及其组合。术语”常规添加剂”指本领域熟练技术人员已知的燃料添加剂，例如上述添加剂，但不包括C10二环类异戊二烯。

    “燃料组分”指用于配制燃料组合物的任意化合物或化合物的混合物。存在”主要燃料组分”和”次要燃料组分”。主要的燃料组分在燃料组合物中至少占50％的体积；而次要燃料组分在燃料组合物中的比例小于50％。燃料添加剂为次要燃料组分。C10二环类异戊二烯可以是主要燃料组分或次要燃料组分，或与其它燃料组分形成混合物。

    “燃料组合物”指包含至少两种燃料组分的燃料。

    “类异戊二烯”和”类异戊二烯化合物”在本发明中可互换，并指由异戊烯二磷酸(“IPP”)衍生的化合物。

    “喷气燃料”指适合在喷气发动机中使用的燃料。

    “煤油”通常指石油(也称为”原油”)在大气压下约150℃至约275℃之间的特定蒸馏组分。原油主要由石蜡族、环烷和芳香族烃组成。

    “导弹燃料”指适合在导弹发动机中使用的燃料。

    “对伞花烃”指如下化合物

    “蒎烷”指如下化合物

    “石油为基础的燃料”指包含了石油的蒸馏组分的燃料。

    “桧烷”指如下化合物

    “烟点”指燃料或燃料组合物被加热直至其分解冒烟的点。测定燃料烟点的常规可接受的方法是ASTM标准D 1322，其作为参考并入本发明。

    “粘度”指燃料或燃料组合物在剪切应力下抵御变形的量度。测定燃料粘度的常规可接受的方法是ASTM标准D 445，其作为参考并入本发明。

    如本发明所用，为”基本纯的”化合物的组合物基本不含一种或多种其它化合物，即，基于该组合物的总体积，该组合物包含大于80体积％、大于90体积％、大于95体积％、大于96体积％、大于97体积％、大于98体积％、大于99体积％、大于99.5体积％、大于99.6体积％、大于99.7体积％、大于99.8体积％、或大于99.9体积％的该化合物；或包含小于20体积％、小于10体积％、小于5体积％、小于3体积％、小于1体积％、小于0.5体积％、小于0.1体积％、或小于0.01体积％的一种或多种其它化合物。

    如本发明所用，“基本不含”一种化合物的组合物指基于该组合物的总体积，该组合物包含小于20体积％、小于10体积％、小于5体积％、小于4体积％、小于3体积％、小于2体积％、小于1体积％、小于0.5体积％、小于0.1体积％或小于0.01体积％的该化合物。

    本发明所用的术语“立体异构纯”指包含化合物的一种立体异构体，并且基本没有该化合物的另一立体异构体的组合物。例如，具有一个手性中心的化合物的立体异构纯的组合物将基本不含该化合物的相对的对映体。具有两个手性中心的化合物的立体异构纯组合物将基本不含该化合物的其它非对映异构体。典型的立体异构纯化合物包含大于约80％重量的该化合物的一种立体异构体，和少于约20％重量的该化合物其它立体异构体，更优选大于约90％重量的该化合物的一种立体异构体和少于约10％重量的该化合物其它立体异构体，更优选大于约95％重量的该化合物的一种立体异构体和少于约5％重量的该化合物其它立体异构体，最优选大于约97％重量的该化合物的一种立体异构体和少于约3％重量的该化合物其它立体异构体。

    本发明所用的术语“对映体纯”指具有一个手性中心的化合物的立体异构纯组合物。

    本发明所用的术语“外消旋”或“外消旋体”指相对于该分子中所有的手性中心，约50％的一种对映体和约50％的相应对映体。本发明包含了本发明的化合物的所有对映体纯、对映体富集、非对映体纯、非对映体富集，和外消旋混合物。

    除了上述定义外，本发明所述的特定化合物具有可以以Z或E异构体存在的一个或多个双键。在特定的实施方案中，本发明所述的化合物作为基本不含其它异构体的单独异构体存在，或者可选择地，作为各种异构体的混合物(例如，立体异构体的外消旋混合物)存在。

    在下文的描述中，本发明公开的所有数值均为大概的值，不论其是否与“大约”或“约”等词共用。它们可具有1％、2％、5％或有时为10-20％的变化。当公开的数值范围具有下限RL和上限RU时，则该范围内的任意数值均被特别公开了。具体地，在该范围内特别公开了如下数值：R＝RL+k*(RU-RL)，其中k为1％至100％范围内具有1％增量的变量，即，k为1％，2％，3％，4％，5％，5％，...，50％，51％，52，...，95％，96％，97％，98％，99或100％。此外，还特别公开了上文所述的由两个R值限定的任意数值范围。

    具体实施方案

    一方面，本发明提供了燃料组合物，其包含：

    (a)占燃料组合物总体积的至少2％体积的C10二环类异戊二烯；以及

    (b)占燃料组合物总体积的至少5％体积的石油为基础的燃料，

    其中该燃料组合物具有等于或大于38℃的闪点，并在15℃下具有约750kg/m3至约850kg/m3的密度。

    在一些实施方案中，该C10二环类异戊二烯为蒈烷。在其它实施方案中，该C10二环类异戊二烯为蒎烷。在其它实施方案中，该C10二环类异戊二烯为桧烷。在特定的实施方案中，该C10二环类异戊二烯为包含蒈烷、蒎烷和桧烷中两种或多种的混合物。

    在该C10二环类异戊二烯为蒎烷的特定实施方案中，该燃料组合物包含约0％至约10％的含氢化萘的物质。在特定的其它实施方案中，该燃料组合物不包含含氢化萘的物质。在其它实施方案中，该燃料组合物具有小于或等于300℃的终沸点。

    该燃料组合物中的每一种类异戊二烯化合物均能作为燃料组分，其在与氧气等氧化剂进行化学反应时释放能量；或可作为燃料添加剂，改变该燃料组分的性能或属性。在一些实施方案中，该类异戊二烯化合物占燃料组合物的总重或总体积至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。在其它实施方案中，该类异戊二烯化合物占燃料组合物的总重或总体积最多约5％、最多约10％、最多约15％、最多约20％、最多约25％、最多约30％、最多约35％、最多约40％、最多约45％、最多约50％、最多约60％、最多约70％、最多约80％、或最多约90％。在进一步的实施方案中，该类异戊二烯化合物占燃料组合物的总重或总体积的约2％至约99％、约2.5％至约95％、约5％至约90％、约7.5％至约85％、约10％至约80％、约15％至约80％、约20％至约75％、或约25％至约75％。

    在一些实施方案中，该C10类异戊二烯化合物衍生自生物工程C10类异戊二烯起始原料。在特定的实施方案中，该生物工程C10类异戊二烯起始原料可通过宿主细胞将碳源转化为C10类异戊二烯起始原料制备得到。

    在其它实施方案中，该碳源为糖，例如单糖(simple sugar)、二糖、或其一种或多种组合。在特定的实施方案中，该糖为能够支持本发明提供的一种或多种细胞生长的单糖。该单糖为本领域技术人员已知的任意单糖。一些合适的单糖的非限制性范例包括：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖及其组合。合适的二糖的一些非限制性范例包括：蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。

    在其它实施方案中，该碳源为多糖。合适的多糖的一些非限制性范例包括淀粉、糖原、纤维素、几丁质及其组合。

    在其它实施方案中，该碳源为不可发酵的碳源。不可发酵碳源的一些非限制性范例包括乙酸盐和甘油。

    在其它实施方案中，在本发明公开的燃料组合物中，所述石油为基础的燃料的量为燃料组合物总体积的至少约20％，而所述类异戊二烯化合物的量为燃料组合物总体积的约5％至约75％。在特定的实施方案中，所述石油为基础的燃料的量为燃料组合物总体积的至少约30％，而所述类异戊二烯化合物的量为燃料组合物总体积的约5％至约65％。在特定的实施方案中所述石油为基础的燃料的量为燃料组合物总体积的至少约40％，而所述类异戊二烯化合物的量为燃料组合物总体积的约5％至约50％。在特定的实施方案中，所述石油为基础的燃料的量为燃料组合物总体积的至少约50％，而所述类异戊二烯化合物的量为燃料组合物总体积的约5％至约45％。

    在一些实施方案中，所述石油为基础的燃料为煤油。常规的煤油通常是烃的混合物，具有约285°F至约610°F(即，约140℃至约320℃)的沸点。

    在其它实施方案中，所述石油为基础的燃料为喷气燃料。本发明可使用本领域技术人员已知的任意喷气燃料。美国检测与材料学会(“ASTM”)和英国国防部(“MOD”)已经率先设置并维持了针对民用航空涡轮燃料或喷气燃料的规范。由这两个组织颁布的相应规范非常相似，但不完全一致。众多其它国家颁布了他们自己的针对喷气燃料的国家规范，与ASTM或MOD规范非常接近或完全一致。ASTM D 1655是针对航空涡轮燃料的标准规范，并包括针对Jet A、Jet A-1以及Jet B燃料的规范。国防部标准91-91是针对Jet A-1的MOD规范。

    Jet A-1是最常用的喷气燃料，并按照国际标准化的一套范标制备。仅在美国，还采用了称为Jet A的一种Jet A-1类型。在民航中常用的另一种喷气燃料被称为Jet B。Jet B是石油脑-煤油(naptha-kerosene)领域的一种点火器燃油，因其改善的寒冷天气性能而被使用。在ASTM D 1655中对Jet A、Jet A-1以及Jet B进行了规定。

    或者，全世界的军队以不同的JP编号系统对喷气燃料进行了分类。其中的一些分类几乎与其民用对应分类一致，仅在少量添加剂的量上有所区别。例如，Jet A-1与JP-8类似，而Jet B与JP-4类似。

    在一些实施方案中，本发明提供的燃料组合物进一步包含芳香族化合物，例如对伞花烃、间伞花烃或邻伞花烃。在进一步的实施方案中，该芳香族化合物为对伞花烃或包含对伞花烃。在特定的实施方案中，对伞花烃的量为燃料组合物总体积的约0.1％至约50％体积、约0.1％至约45％体积、约0.1％至约40％体积、约0.1％至约35％体积。在其它实施方案中，该对伞花烃的量为燃料组合物总体积的约0.5％至约35％体积。在其它实施方案中，该对伞花烃的量为燃料组合物总体积的约5％至约25％体积、约5％至约20％体积、或约10％至约20％体积。

    在一些实施方案中，该燃料组合物中芳香族化合物的总量为燃料组合物的总重量或总体积的约1％至约50％。在其它实施方案中，该燃料组合物中芳香族化合物的总量为燃料组合物的总重量或总体积的约15％至约35％。在其它实施方案中，该燃料组合物中芳香族化合物的总量为燃料组合物的总重量或总体积的约15％至约25％。在其它实施方案中，该燃料组合物中芳香族化合物的总量为燃料组合物的总重量或总体积的约5％至约10％。在其它实施方案中，该燃料组合物中芳香族化合物的总量为燃料组合物的总重量或总体积的至少约25％。

    在一些实施方案中，该燃料组合物进一步包含燃料添加剂。在特定的实施方案中，所述燃料添加剂为燃料组合物的总重量或总体积的约0.1％至约50％。在其它实施方案中，所述燃料添加剂选自：氧化剂、抗氧化剂、热稳定性改进剂、稳定剂、低温流动性改进剂、助燃剂、消泡剂、消光雾添加剂、缓蚀剂、润滑性能改进剂、防冰剂、喷射器清洁添加剂、防烟剂、减阻添加剂、金属减活剂、分散剂、去污剂、破乳剂、染料、标记物、防静电剂、杀虫剂及其组合。

    本发明公开的燃料组合物中的燃料添加剂的量可以是燃料组合物总量的约0.1％至小于约50％、约0.2％至约40％、约0.3％至约30％、约0.4％至约20％、约0.5％至约15％、或约0.5％至约10％。在特定的实施方案中，基于燃料组合物总量，所述燃料添加剂的量小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％或小于约0.5％。在一些实施方案中，上述量为燃料组合物总重量的重量百分比(wt.％)。在其它实施方案中，上述量为燃料组合物总体积的体积百分比(vol％)。

    下文更具体描述了燃料添加剂的示范性范例。其中一个范例是润滑性能改进剂。在特定的添加剂中，燃料中的润滑性能改进剂的浓度在约1ppm至约50000ppm、优选约10ppm至约20000ppm、且更优选约25ppm至约10000ppm的范围内。润滑性能改进剂的一些非限制性范例包括脂肪酸的酯。

    稳定剂提高该燃料组合物的贮存稳定性。稳定剂的一些非限制性范例包括叔烷基伯胺。稳定剂在该燃料组合物中的浓度可为该燃料组合物总重的约0.001wt.％至约2wt％，在一个实施方案中为约0.01wt.％至约1wt％。

    助燃剂可提高该燃料组合物的质量燃烧速率。助燃剂的一些非限制性范例包括：二茂铁(dicyclopentadienyliron)、铁基助燃剂(例如，TURBOTECTTMER-18，购于Turbotect(USA)Inc.，Tomball，Texas)、钡基助燃剂、铈助燃剂、以及铁和镁基助燃剂(例如，TURBOTECTTM 703，购于Turbotect(USA)Inc.，Tomball，Texas)。助燃剂在该燃料组合物中的浓度可为该燃料组合物总重的约0.001wt.％至约1wt％，在一个实施方案中为约0.01wt.％至约1wt％。

    抗氧化剂阻止由燃料在贮存中氧化引起的燃料系统组分的胶质沉淀物的形成和/或抑制在本发明中可使用的特定燃料组合物中的过氧化物化合物的形成。抗氧化剂在该燃料组合物中的浓度可为占燃料组合物总重的约0.001wt.％至约5wt％，在一个实施方案中为约0.01wt.％至约1wt％。

    防静电剂可减少燃料通过高流速燃料传递系统时生成的静电的影响。防静电剂在该燃料组合物中的浓度可为燃料组合物总重的约0.001wt.％至约5wt％，在一个实施方案中为约0.01wt.％至约1wt％。

    缓蚀剂可防止燃料处理系统(例如管道和燃料储罐)中的铁类金属被腐蚀。在需要附加润滑性的情况下，可采用能同时提高该组合物的润滑性能的缓蚀剂。缓蚀剂在该燃料组合物中的浓度可为燃料组合物总重的约0.001wt.％至约5wt％，在一个实施方案中为约0.01wt.％至约1wt％。

    燃料系统防冰剂(也称为抗冰添加剂)可降低由于高海拔下冷却从喷气燃料中沉降的水的冻点，并防止能限制燃料向发动机流动的冰晶的形成。某些燃料系统防冰剂还可用作杀虫剂。燃料系统防冰剂在该燃料组合物中的浓度可为燃料组合物总重的约0.001wt.％至约5wt％，在一个实施方案中为约0.01wt.％至约1wt％。

    杀虫剂用于抵御燃料组合物中的微生物生长。杀虫剂在该燃料组合物中的浓度可为燃料组合物总重的约0.001wt.％至约5wt％，在一个实施方案中为约0.01wt.％至约1wt％。

    金属减活剂抑制某些金属(特别是铜)对燃料氧化的催化作用。金属减活剂在该燃料组合物中的浓度可为燃料组合物总重的约0.001wt.％至约5wt％，在一个实施方案中为约0.01wt.％至约1wt％。

    热稳定性改进剂用于抑制航空器燃料系统的高温区域的沉积物形成。热稳定性改进剂在该燃料组合物中的浓度可为燃料组合物总重的约0.001wt.％至约5wt％，在一个实施方案中为约0.01wt.％至约1wt％。

    在一些实施方案中，该燃料组合物具有大于约32℃的闪点、大于约33℃的闪点、大于约34℃的闪点、大于约35℃的闪点、大于约36℃的闪点、大于约37℃的闪点、大于约38℃的闪点、大于约39℃的闪点、大于约40℃的闪点、大于约41℃的闪点、大于约42℃的闪点、大于约43℃的闪点、或大于约44℃的闪点。在其它实施方案中，该燃料组合物具有大于38℃的闪点。在特定的实施方案中，本发明公开的燃料组合物的闪点参照ASTM标准D 56测定。在其它的实施方案中，本发明公开的燃料组合物的闪点参照ASTM标准D 93测定。在进一步的实施方案中，本发明公开的燃料组合物的闪点参照ASTM标准D 3828-98测定。在更进一步的实施方案中，本发明公开的燃料组合物的闪点参照本领域熟练技术人员已知的用于测定燃料闪点的任意常规方法来测定。

    在一些实施方案中，该燃料组合物在15℃下具有约750kg/m3至约850kg/m3、约750kg/m3至约845kg/m3、约750kg/m3至约840kg/m3、约760kg/m3至约845kg/m3、约770kg/m3至约850kg/m3、约770kg/m3至约845kg/m3、约775kg/m3至约850kg/m3、或约775kg/m3至约845kg/m3的密度。在其它实施方案中，该燃料组合物在15℃下具有约780kg/m3至约845kg/m3的密度。在其它实施方案中，该燃料组合物在15℃下具有约775kg/m3至约840kg/m3的密度。在其它实施方案中，该燃料组合物在15℃下具有约750kg/m3至约805kg/m3的密度。在特定的实施方案中，本发明公开的燃料组合物的密度参照ASTM标准D 4052测定。在进一步的实施方案中，本发明公开的燃料组合物的密度参照本领域熟练技术人员已知的用于测定燃料密度的任意常规方法来测定。

    在一些实施方案中，该燃料组合物具有低于-30℃、低于-40℃、低于-50℃、低于-60℃、低于-70℃、或低于-80℃的冻点。在其它实施方案中，该燃料组合物具有约-80℃至约-30℃、约-75℃至约-35℃、约-70℃至约-40℃、或约-65℃至约-45℃的冻点。在特定的实施方案中，本发明公开的燃料组合物的冻点参照ASTM标准D 2386来测定。在进一步的实施方案中，本发明公开的燃料组合物的冻点参照本领域熟练技术人员已知的用于测定燃料冻点的任意常规方法来测定。

    在一些实施方案中，该燃料组合物在15℃下具有约750kg/m3至约850kg/m3的密度，以及等于或大于38℃的闪点。在特定的实施方案中，该燃料组合物在15℃下具有约750kg/m3至约850kg/m3的密度，等于或大于38℃的闪点，以及低于-40℃的冻点。在特定的实施方案中，该燃料组合物在15℃下具有约750kg/m3至约840kg/m3的密度，等于或大于38℃的闪点，以及低于-40℃的冻点。

    在一些实施方案中，该燃料组合物具有约140℃至约170℃的初沸点。在其它实施方案中，该燃料组合物具有约180℃至约300℃的终沸点。在另一实施方案中，该燃料组合物具有约140℃至约170℃的初沸点和约180℃至约300℃的终沸点。在特定的实施方案中，该燃料组合物达到了ASTM D 86的蒸馏规范。

    在一些实施方案中，该燃料组合物具有等于或大于245℃的喷气燃料热氧化测试(JFTOT)温度。在其它实施方案中，该燃料组合物具有等于或大于250℃、等于或大于255℃、等于或大于260℃、或等于或大于265℃的JFTOT温度。

    在一些实施方案中，该燃料组合物在-20℃下具有小于6mm2/sec、小于7mm2/sec、小于8mm2/sec、小于9mm2/sec、或小于10mm2/sec的粘度。在特定的实施方案中，本发明公开的燃料组合物的粘度参照ASTM标准D 445来测定。

    在一些实施方案中，该燃料组合物达到了ASTM D 1655对Jet A-1的规范。在其它实施方案中，该燃料组合物达到了ASTM D 1655对Jet A的规范。在其它实施方案中，该燃料组合物达到了ASTM D 1655对Jet B的规范。

    另一方面，本发明提供了燃料组合物，其包含：

    (a)占燃料组合物总体积的至少10％体积的C10二环类异戊二烯；以及

    (b)占燃料组合物总体积的至少40％体积的煤油，

    其中该燃料组合物在15℃下具有约750kg/m3至约850kg/m3的密度，等于或大于38℃的闪点，以及低于-40℃的冻点。

    在一些实施方案中，该C10二环类异戊二烯化合物的量占燃料组合物总重或总体积的至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％的重量或体积。在特定的实施方案中，该量为占燃料组合物总重量的重量百分比。在其它实施方案中，该量为占燃料组合物总体积的体积百分比。

    在一些实施方案中，该C10二环类异戊二烯为蒈烷。在其它实施方案中，该C10二环类异戊二烯为蒎烷。在其它实施方案中，该C10二环类异戊二烯为桧烷。在特定的实施方案中，该C10二环类异戊二烯为包含蒈烷、蒎烷和桧烷中两种或多种的混合物。

    在特定的实施方案中，该燃料组合物达到了ASTM D 1655对Jet A的规范。

    另一方面，本发明提供了包括含有本发明提供的燃料组合物的燃料箱的燃料系统。可选地，该燃料系统进一步包括具有再循环发动机冷却液的发动机冷却系统，连接该燃料箱和内燃机的燃料管和/或设置在燃料管上的燃料过滤器。内燃机的一些非限制性范例包括：往复发动机(例如，汽油发动机和柴油发动机)、Wankel发动机、喷气发动机、一些火箭发动机、以及燃气涡轮发动机。

    在一些实施方案中，该燃料箱与所述冷却系统设置在一起，从而允许在该再循环发动机冷却液和该燃料箱中的燃料组合物间进行热传递。在其它实施方案中，该燃料系统进一步包括含有用于喷气发动机的第二燃料的第二燃料箱和连接该第二燃料箱和该发动机的第二燃料管。可选地，该第一和第二燃料管可配备电磁操作阀，该阀可彼此独立地或同步地开启或关闭。在其它实施方案中，该第二燃料为Jet A。

    另一方面，本发明提供了发动机装置，其包括内燃机，含有本发明公开的燃料组合物的燃料箱，连接该燃料箱和内燃机的燃料管。可选地，该发动机装置进一步包括燃料过滤器和/或含有再循环发动机冷却液的发动机冷却系统。在一些实施方案中，该内燃机为柴油发动机。在其它实施方案中，该内燃机为喷气发动机。

    当使用本发明公开的燃料组合物时，需要在将其注入该发动机前除去该燃料组合物中产生的微粒状物质。因此，需要在本发明公开的燃料系统中选用适当的燃料过滤器。在内燃机中使用的燃料中的水，即使数量极少，也可对发动机引起极大的危害。因此，需要在燃料组合物注入发动机前除去其中的任意水分。在一些实施方案中，可通过采用涡轮式离心机的燃料过滤器去除水和微粒状物质，其中水和微粒状物质从该燃料组合物分离的程度使得过滤后的燃料组合物可以注入该发动机而不带来损伤该发动机的危险。也可采用其它类型的燃料过滤器来去除水和/或微粒状物质。

    另一方面，本发明提供了包括内燃机、含有本发明公开的燃料组合物的燃料箱、连接该燃料箱和内燃机的燃料管的交通工具。可选地，该交通工具进一步包括燃料过滤器和/或含有再循环发动机冷却液的发动机冷却系统。交通工具的一些非限制性范例包括汽车、摩托车、火车、轮船、和航空器。

    制备燃料组合物的方法

    另一方面，本发明提供了制备燃料组合物的方法，其包括如下步骤：

    (a)将C10类异戊二烯起始原料与氢在催化剂的存在下相接触，以形成C10二环类异戊二烯；并

    (b)将该C10二环类异戊二烯与燃料组分相混合，以制备该燃料组合物。

    在一个实施方案中，该C10类异戊二烯起始原料为蒈烯，该C10二环类异戊二烯为蒈烷。在另一实施方案中，该C10类异戊二烯起始原料为α-蒎烯，该C10二环类异戊二烯为蒎烷。在另一实施方案中，该C10类异戊二烯起始原料为β-蒎烯，该C10二环类异戊二烯为蒎烷。在其它实施方案中，该C10类异戊二烯起始原料为α-蒎烯和β-蒎烯的混合物，该C10二环类异戊二烯为蒎烷。在进一步的实施方案中，该C10类异戊二烯起始原料为桧烯，该C10二环类异戊二烯为桧烷。

    另一方面，本发明提供了从单糖制备燃料组合物的方法，其包括如下步骤：

    (a)在适于生成C10类异戊二烯起始原料的条件下，将能够生成C10类异戊二烯起始原料的细胞与单糖相接触；

    (b)将C10类异戊二烯起始原料转化为C10二环类异戊二烯；并

    (c)将C10二环类异戊二烯与燃料组分相混合，以制备该燃料组合物。

    在一些实施方案中，通过将C10类异戊二烯起始原料与氢在催化剂的存在下接触，将C10类异戊二烯起始原料转化为C10二环类异戊二烯。

    另一方面，本发明提供了用于生产本发明的燃料、生物工程燃料组分、或生物工程燃料添加剂的装置。在特定的实施方案中，该装置能够以生物方法生产该C10起始原料。在特定的实施方案中，该装置进一步能够从该起始原料制备类异戊二烯燃料添加剂或燃料组分。

    该装置可包括能够用于采用微生物制备C10起始原料的任意结构。在一些实施方案中，该生物装置包含本发明公开的一种或多种细胞。在一些实施方案中，该生物装置包含细胞培养物，该细胞培养物包含占其总重至少约1wt.％、至少约5wt.％、至少约10wt.％、至少约20wt.％、或至少约30wt.％的至少一种C10起始原料。在其它实施方案中，该生物装置包括含有本发明所述的一种或多种细胞的发酵罐。

    本发明可使用能够提供适于细胞或微生物生长或繁殖的稳定和适宜环境的任意发酵罐。在一些实施方案中，该发酵罐包含含有本发明公开的一种或多种细胞的培养物。在其它实施方案中，该发酵罐包含能够以生物方式生成香叶基焦磷酸(GPP)的细胞培养物。在其它实施方案中，该发酵罐包含能够以生物方式生成异戊烯二磷酸(IPP)的细胞培养物。在特定实施方案中，该发酵罐包含细胞培养物，该细胞培养物包含占其总重至少约1wt.％、至少约5wt.％、至少约10wt.％、至少约20wt.％、或至少约30wt.％的至少一种C10起始原料。

    该装置可进一步包括能够由C10起始原料生产燃料组分或燃料添加剂的任意结构。该结构可包含用于氢化C10起始原料的氢化器。本发明可使用能在本领域熟练技术人员已知的条件下将C＝C双键还原为C-C单键的任意氢化器。该氢化器可包含本发明公开的氢化催化剂。在一些实施方案中，该结构进一步包括混合器，容器，以及在该容器中的来自氢化步骤的氢化产物和常规燃料添加剂的混合物。

    该单糖为本领域技术人员已知的任意单糖。合适的单糖的一些非限制性范例包括：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖及其组合。合适的二糖的一些非限制性范例包括：蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。在特定的实施方案中，该生物工程燃料组分可从多糖获得。合适的多糖的一些非限制性范例包括淀粉、糖原、纤维素、几丁质及其组合。

    适用于制备生物工程四甲基环己烷的单糖、二糖和多糖可从多种农作物或来源中发现。合适的农作物或来源的一些非限制性范例包括甘蔗、甘蔗渣、芒、甜菜、蜀黍、高粱、柳枝稷、大麦、麻、槿麻、土豆、红薯、木薯、向日葵、水果、糖浆、乳清或脱脂牛奶、玉米、秸秆、谷物、小麦、木材、纸、稻草、棉花、多种纤维类废物和其他生物量。在特定的实施方案中，合适的农作物或来源包括甘蔗、甜菜和玉米。

    制备化合物的方法

    本发明的化合物可通过本领域技术人员已知的任意方法制备，包括生物方法，化学合成(不使用生物来源的原料)，以及同时采用生物和化学手段的混合方法。在特定的实施方案中，该C10类异戊二烯起始原料各自由宿主细胞将单糖转化为目标产物来进行制备。

    宿主细胞

    该C10类异戊二烯起始原料还可通过本领域已知的任意方法制备，该方法包括生物方法、化学合成和混合方法。当C10类异戊二烯起始原料通过生物方法制备时，可采用经改良以生成目标产物的宿主细胞。与所有的类异戊二烯类似，C10类异戊二烯起始原料可通过常见的中间体异戊烯二磷酸(“IPP”)经生物化学方法来制备。

    该宿主细胞可根据本领域技术人员已知的任意技术来进行生长。特别地，宿主细胞可生长于适合宿主细胞的培养基中。在有利的实施方案中，培养基包含容易获得的可再生的组分。因此，本发明提供了容易获得的可再生的能源，将其用于生成燃料组合物的方法。在特定的实施方案中，宿主细胞在适于其生长和生成C10类异戊二烯的条件下通过与单糖接触来进行生长或培养。在特定的实施方案中，宿主细胞可通过与葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖或其组合相接触进行生长或培养。因此，本发明提供了来自于单糖(例如，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖或其组合)的燃料组合物，以及从该单糖生成它们的方法。

    任意合适的宿主细胞可用于本发明所述的方法和组合物的使用。在一实施方案中，该宿主细胞为遗传修饰的宿主微生物，其中核酸分子被插入、缺失或修饰(即，突变的；例如，通过核苷酸的插入、缺失、替换和/或倒位)，从而生成所需的类异戊二烯或类异戊二烯衍生物，或者提高所需的类异戊二烯或类异戊二烯衍生物的产量。在特定的实施方案中，该宿主细胞能够在液体生长培养基中生长。

    合适的宿主细胞的范例包括古细菌细胞、细菌细胞和真核细胞。古细菌细胞的范例包括但不限于那些属于：气火菌属(Aeropyrum)、Archaeglobus、嗜盐杆菌属(Halobacterium)、甲烷球菌属(Melhanococcus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、热球菌属(Pyrococcus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、和嗜热枝原体属(Thermoplasma)的古细菌细胞。古细菌菌株的范例包括但不限于：嗜热泉生古细菌(Aeropyrum pernix)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus  fulgidus)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、超好热菌(Pyrococcus abyssi)、极端嗜热球古菌(Pyrococcus honkoshii)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、和Thermoplasma volcamum。

    有用的细菌种类的范例包括但不限于那些属于：农杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥藻属(Anabaena)、组囊蓝细菌属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、定氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、产色菌属(Chromatium)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、大肠杆菌属(Escherichia)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、席蓝细菌属(Phormidium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、深红红螺菌(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、Scenedesmun、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphlococcus)、链霉菌属(Strepromyces)、Synnecoccus和发酵单胞菌属(Zymomonas)的种类。

    有用的细菌菌株的范例包括但不限于：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、医学环状杆菌(Bacillus amyloliquefacines)、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)、Brevibacterium immariophilum、拜季林斯基(氏)梭菌(Clostridium beigerinckii)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazaku)、大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、Pseudomonasmevalonii、Pseudomonas pudica、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、球形红细菌Rhodobacter sphaeroides)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、肠炎沙门(氏)菌(Salmonella enterica)、沙门氏菌伤寒杆菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门(氏)菌(Salmonella typhimurium)、志贺氏痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺(氏)菌(Shigella flexneri)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。

    一般而言，当使用细菌宿主细胞时，优选非病原性菌株。非病原性菌株的范例包括但不限于：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、嗜酸乳杆菌(Lactibacillus acidophilus)、瑞士乳(酸)杆菌(Lactobacillushelveticus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、Pseudomonas mevalonii、恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、光合菌(Rodobacter capsulatus)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)等。

    有用的真核细胞的范例包括但不限于真菌细胞。真菌细胞的范例包括但不限于那些属于以下属的真菌细胞：曲霉属(Aspergillus)、念珠菌属(Candida)、金孢子菌属(Chrysosporium)、隐球酵母属(Cryotococcus)、镰孢菌属(Fusarium)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、内生真菌属(Neotyphodium)、链孢霉属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、和木霉菌属(Trichoderma)的真菌细胞。

    有用的真核细胞菌株的范例包括但不限于：构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、白色念珠菌Candida albicans)、Chrysosporium lucknowense、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、镰孢霉Fusarium venenatum)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、吉利蒙德(氏)毕赤酵母(Pichia finlandica)、库德毕赤酵母(Pichia kodamae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、奥默酵母(Pichia opuntiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、毕赤酵母pijperi(Pichiapijperi)、毕赤酵母quercuum(Pichia quercuum)、毕赤酵母salictaria(Pichiasalictaria)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、Pichia trehalophila、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、抗菌素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、链金黄色葡萄球菌(Streptomyces aureus)、贝酵母(Saccaromyces bayanus)、布拉氏酵母(Saccaromyces boulardi)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、产橄榄色链霉菌(Streptomycesolivogriseus)、枝链霉菌(Streptomyces rameus)、田无链霉菌(Streptomycestanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus)、和里氏木霉(Trichodermareesei)。

    一般而言，当使用真核细胞时，优选非病原性种类。非病原性种类的范例包括但不限于：禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、镰孢霉(Fusariumvenenatum)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、布拉氏酵母(Saccaromycesboulardi)、和酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)。

    此外，某些种类经食品药品管理局指定为GRAS或通常认为安全。这些菌株包括：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜酸乳杆菌(Lactibacillusacidophilus)、瑞士乳(酸)杆菌(Lactobacillus helveticus)、和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

    IPP途经

    存在两种已知的合成IPP及其异构体二甲基丙烯焦磷酸脂(“DMAPP”)的生物合成途径。不同于植物，真核生物使用甲羟戊酸-依赖性(“MEV”)类异戊二烯途径专有地将乙酰辅酶A(“乙酰-CoA”)转化为IPP，IPP随后被异构化为DMAPP。原核生物(存在少数例外)使用该甲羟戊酸-依赖性或脱氧木酮糖5-磷酸(“DXP”)途径通过一个分支点分别生成IPP和DMAPP。一般而言，植物同时使用MEV和DXP途径进行IPP合成。

    MEV途径

    图1显示了MEV途径的示意图。一般而言，该途径包括六个步骤。

    在第一步骤，两个乙酰辅酶A分子经酶催化合并形成乙酰乙酰辅酶A。已知催化该步骤的酶是，例如，乙酰辅酶A硫解酶。核苷酸序列的范例包括但不限于来源于如下GenBank录入号以及从中获得该序列的有机物：(NC000913 REGION：2324131..2325315；大肠杆菌)，(D49362；脱氮微球菌)，和(L20428；酿酒酵母)。

    在MEV途径的第二步骤，乙酰乙酰辅酶A与另一乙酰辅酶A分子缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)。已知催化该步骤的酶是，例如，HMG-CoA合成酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(NC_001145.互补19061..20536；酿酒酵母)，(X96617；酿酒酵母)，(X83882；拟南芥)，(AB037907；Kitasatospora griseola)，(BT007302；智人)，以及(NC_002758，基因座标签基因座标签SAV2546，Gene ID 1122571；金黄色葡萄球菌)。

    在第三步，HMG辅酶A酶催化转化为甲羟戊酸。已知催化该步骤的酶是，例如，HMG-CoA还原酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(NM_206548；黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、(NC_002758，基因座标签基因座标签SAV2545，GeneID 1122570；金黄色葡萄球菌)、(NM_204485；红原鸡(Gallusgallus))、(AB015627；链霉菌属KO 3988)、(AF542543；渐狭叶烟草(Nicotianaattenuata))、(AB037907；Kitasatospora griseola)、，(AX 128213，提供编码截短HMGR的序列；酿酒酵母)、以及(NC_001145；互补(115734..118898；酿酒酵母)。

    在第四步，甲羟戊酸被酶催化磷酸化形成甲羟戊酸5-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(L77688；拟南芥)和(X55875；酿酒酵母)。

    在第五步，向该甲羟戊酸5-磷酸酶催化添加第二个磷酸基团，从而形成甲羟戊酸5-焦磷酸脂。已知催化该步骤的酶是，例如，磷酸甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(AF429385；巴西橡胶树(Hevea brasiliensis))、(NM_006556；智人)、和(NC_001145；互补体712315..713670；酿酒酵母)。

    在第六步，甲羟戊酸5-焦磷酸脂被酶催化转化为IPP。已知催化该步骤的酶是，例如，甲羟戊酸焦磷酸脂脱羧酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(X97557；酿酒酵母)、(AF290095；屎肠球菌(Enterococcus faecium))、和(U49260；智人)。

    如要通过该甲羟戊酸途径将IPP转化为DMAPP，则需要进行第七步。已知催化该步骤的酶是，例如，IPP异构酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(NC_000913，3031087..3031635；大肠杆菌)、和(AF082326；雨生红球藻(Haematococcus pluvialis))。

    DXP途径

    图2显示了DXP途径的示意图。一般而言，DXP途径包括七个步骤。在第一步，将丙酮酸盐与D-甘油醛3-磷酸缩合形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(AF035440；大肠杆菌)、(NC_002947，基因座标签基因座标签PP0527；恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas putida))、(CP000026，基因座标签基因座标签SPA2301；肠炎副伤寒沙门氏菌(Salmonella entericaParatyphi)，见ATCC 9150)、(NC_007493，基因座标签基因座标签RSP_0254；球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1)、(NC_005296，基因座标签基因座标签RPA0952；沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009)、(NC_004556，基因座标签基因座标签PD1293；苛养木杆菌(Xylellafastidiosa)Temeculal)、和(NC_003076，基因座标签基因座标签AT5G 11380；拟南芥)。

    在第二步，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸被转化为2C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(AB013300；大肠杆菌)、(AF 148852；拟南芥)、(NC_002947，基因座标签PP1597；恶臭假单胞菌KT2440)、(AL939124，基因座标签SCO5694；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2))、(NC_007493，基因座标签RSP_2709；球形红细菌2.4.1)、和(NC_007492，基因座标签Pf1_1107；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)PfO-1)。

    在第三步，2C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸被转化为4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇。已知催化该步骤的酶是，例如，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(AF230736；大肠杆菌)、(NC_007493，基因座标签RSP_2835；球形红细菌2.4.1)、(NC_003071，基因座标签AT2G02500；拟南芥)、和(NC_002947，基因座标签PP1614；恶臭假单胞菌KT2440)。

    在第四步，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇被转化为4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇激酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(AF216300；大肠杆菌)和(NC_007493，基因座标签RSP_1779；球形红细菌2.4.1)。

    在第四步，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸被转化为2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸合成酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(AF230738；大肠杆菌)、(NC_007493，基因座标签RSP_6071；球形红细菌2.4.1)、以及(NC_002947，基因座标签PP1618；恶臭假单胞菌KT2440)。

    在第五步中，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸被转化为2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(AF230738；大肠杆菌)、(NC_007493，基因座标签RSP_6071；球形红细菌2.4.1)、以及(NC_002947，基因座标签PP1618；恶臭假单胞菌KT2440)

    在第六步中，2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸被转化为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(AY033515；大肠杆菌)、(NC_002947，基因座标签PP0853；恶臭假单胞菌KT2440)、以及(NC_007493，基因座标签RSP_2982；球形红细菌2.4.1)。

    在第七步中，1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸被转化为IPP或其异构体DMAPP。已知催化该步骤的酶是，例如，异戊基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶。核苷酸序列的范例包括但不限于：(AY062212；大肠杆菌)和(NC_002947，基因座标签PP0606；恶臭假单胞菌KT2440)。

    在一些实施方案中，宿主细胞自身的代谢过程和本发明提供的涉及IPP生成的过程之间的“相互干扰(cross talk)”(或干扰)被最小化或完全消除。例如，当该宿主微生物专门依赖DXP途径合成IPP，而MEV途径被导入以提供额外的IPP时，相互干扰被最小化或完全消除。该种宿主微生物不会被修饰以改变该MEV途径酶的表达或处理与该MEV途径相关的中间体。专门或主要依赖DXP途径的有机体包括，例如，大肠杆菌。

    在一些实施方案中，该宿主细胞专门通过MEV途径或通过MEV途径与DXP途径联合生成IPP。在其它实施方案中，宿主DXP途径的功能缺失，从而使宿主细胞专门通过外部引入的MEV途径生成IPP。可通过使一种或多种DXP途径酶停止基因表达或功能失活使该DXP途径缺失功能。

    类异戊二烯起始原料

    在一些实施方案中，GPP可参照图3所示的方法进行制备。将一分子的IPP和一分子的DMAPP缩合形成GPP。在一些实施方案中，该反应可被已知催化该步骤的酶(例如，香叶基二磷酸合成酶)所催化。各种C10类异戊二烯起始原料可由GPP制备。

    编码香叶基焦磷酸合成酶的多聚核苷酸的范例包括但不限于：(AF513111；北美冷杉(Abies grandis))、(AF513112；北美冷杉)、(AF513113；北美冷杉)、(AY534686；金鱼草(Antirrhinum majus))、(AY534687；金鱼草)、(Y17376；拟南芥)、(AE016877，基因座AP11092；蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)；ATCC 14579)、(AJ243739；甜橙(Citrus sinensis))、(AY534745；仙女扇(Clarkia breweri))、(AY953508；Ipspini)、(DQ286930；番茄(Lycopersiconesculentum))、(AF182828；胡椒薄荷(Mentha x piperita))、(AF1 82827；Menthax piperita)、(MPI249453；Mentha x piperita)、(PZE431697，基因座CAD24425；Paracoccus zeaxanthinifaciens)、(AY866498；库洛胡黄连(Picrorhiza kurrooa))、(AY351862；葡萄(Vitis vinifera))、以及(AF203881，基因座AAF12843；酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。

    然后可采用一种或多种萜烯合成酶将GPP转化为各种C10类异戊二烯起始原料。一些非限制性范例包括如下范例及其立体异构体。

    蒈烯

    蒈烯，其结构为

    发现于多种树(特别是松树)的树脂中。蒈烯可通过蒈烯合成酶由GPP制备。合适的核苷酸序列的范例包括但不限于：(AF461460，REGION 43..1926；挪威云杉(Picea abies))和(AF527416，REGION：78..1871；Salvia stenophylla)。

    α-蒎烯

    α-蒎烯，其结构为

    发现于松树和桉树中。α-蒎烯可通过α-蒎烯合成酶由GPP制备。合适的核苷酸序列的范例包括但不限于：(+)α-蒎烯合成酶(AF543530，REGION：1..1887；火炬松(Pinus taeda))、(-)α-蒎烯合成酶(AF543527，REGION：32..1921；火炬松)、以及(+)/(-)α-蒎烯合成酶(AGU87909，REGION：6111892；北美冷杉)。

    β-蒎烯

    β-蒎烯，其结构为

    发现于松树、迷迭香、欧芹、莳萝、罗勒、和玫瑰中。β-蒎烯可通过β-蒎烯合成酶由GPP制备。合适的核苷酸序列的范例包括但不限于：(-)β-蒎烯合成酶(AF276072，REGION：1..1749；青蒿素(Artemisia annua))和(AF514288，REGION：26..1834；柠檬(Cirtus limon))。

    桧烯

    桧烯，其结构为

    发现于黑胡椒、胡萝卜种子、鼠尾草和茶树。桧烯可通过桧烯合成酶由GPP制备。合适的核苷酸序列的范例包括但不限于：来自于鼠尾草的AF051901，REGION：26..1798。

    在一些实施方案中，该类异戊二烯起始原料可从天然存在的萜烯获得或制备得到，该萜烯可由多种植物(例如，香脂苏木(Copaifera langsdorfii)、针叶树、和大戟树)，昆虫(例如，燕尾蝶、叶甲、白蚁、以及松叶蜂)和海洋生物(例如，海藻、海绵、珊瑚、软体动物、和鱼)生成。

    香脂苏木或香脂树也称为柴油树和煤油树。它在地方语言中具有多个名称，包括kupa′y，cabismo，和。香脂树可在其木材和叶子中生成大量的萜烯烃。一般而言，一颗香脂树每年可生成约30至约40升的萜烯油。

    萜烯油还可从针叶属和大戟属获得。针叶属属于植物中的松柏门(Pinophyta)或松柏科(Coniferae)，且通常为具有维管组织的以松果携带种子的植物。针叶树中大部分是树，但有些针叶树可能是灌木。合适的针叶树的一些非限制性范例包括：雪松、柏树、道格拉斯枞树、枞树、杜松、贝壳松、落叶松、松树、红杉、云杉、以及紫杉。大戟属，也称为Euphorbia，是在全世界广泛分布的植物，属于大戟科(Euphorbiaceae)。由约2160个种类组成的大戟属，是植物王国最大的物种之一。

    该C10类异戊二烯起始原料为倍半萜，它是称为萜烯的更大类别化合物的一部分。作为烃类中较大的类别，萜烯包括半萜烯、单萜烯、倍半萜、二萜烯、二倍半萜、三萜烯、四萜烯和多萜烯。因此，可从萜烯油中分离合适的C10类异戊二烯起始原料用于本发明。

    化学转化

    在特定的实施方案中，从天然存在的来源分离一种或多种C10类异戊二烯起始原料，随后转化为相应的C10二环类异戊二烯。

    不管为何种来源，C10类异戊二烯起始原料均可通过已知的还原反应(例如氢化反应)化学转化为C10二环类异戊二烯。在一些实施方案中，该C10类异戊二烯起始原料可采用催化剂(例如，Pd、Pd/C、Pt、PtO2、Ru(PPh3)2Cl2、兰尼镍及其组合)被氢化还原。一般而言，在完成后，可洗涤该反应混合物，浓缩，并干燥以获得相应的氢化产物。

    C10类异戊二烯起始原料的氢化反应的催化剂可以以能够使该反应进行的任意量存在。在一些实施方案中，该氢化催化剂的量为每升反应物约1g至约100g、每升反应物约2g至约75g、每升反应物约3g至约50g、每升反应物约4g至约40g、每升反应物约5g至约25g、或每升反应物约5g至约10g。

    在一些实施方案中，该氢化反应在室温下进行。在特定的实施方案中，该反应温度介于约10℃和约75℃、介于约15℃和约60℃、介于约20℃和约50℃、或介于约20℃和约40℃。在其它实施方案中，该反应温度介于约75℃和约150℃、介于约90℃和约130℃、或介于约100℃和约125℃。

    氢化反应中氢的压力可以是使该反应进行的任意压力。在一些实施方案中，该氢的压力介于约10psi和约1000psi、介于约50psi和约800psi、介于约400psi和约600psi、或介于约450psi和约550psi。在其它实施方案中，该氢的压力小于100psi。

    在一些实施方案中，该催化剂为Pd催化剂。在其它实施方案中，该催化剂为5％Pd/C。在其它实施方案中，该催化剂为10％Pd/C。在特定的这些实施方案中，该催化剂载量介于每升反应物约1g至约10g。在其它实施方案中，该催化剂载量介于每升反应物约5g至约5g。

    在一些实施方案中，该C10类异戊二烯起始原料中的C＝C键在室温下于催化剂和氢的存在下被氢化还原为相应的C-C键。在特定的实施方案中，如下文图解1所示，蒈烯在10％Pd/C催化剂的存在下被氢还原为蒈烷。

    图解1

    在进一步的实施方案中，如下文图解2所示，α-蒎烯或β-蒎烯在10％Pd/C催化剂的存在下被氢还原为蒎烷。

    图解2

    在更进一步的实施方案中，如下文图解3所示，桧烯在10％Pd/C催化剂的存在下被氢还原为桧烷。

    图解3

    可选择地，也可使用任何能将C＝C键还原为C-C键的还原剂。例如，该C10类异戊二烯起始原料可通过在氧气氛中，在催化剂(例如，5-乙基-3-甲基光黄素高氯酸酯)存在下，以肼处理氢化得到相应的氢化产物。该种用肼进行的还原反应公开于Imada等人，J.Am.Chem.Soc.，127，14544-14545(2005)，其通过参考并入本发明。

    该C10类异戊二烯起始原料的氢化可在不对称氢化催化剂(例如铑-手性双膦复合物)的存在下进行，从而形成基本不含其它立体异构体的立体特异性氢化产物。该非对称氢化催化剂的非限制性范例包括铑-DIPAMP催化剂。该铑-DIPAMP催化剂和其它非对称氢化催化剂公开于Vineyard等人，J.Am.Chem.Soc.1977，99，(18)，5946；Ryoji Noyori，“Asymmetric Catalysis In OrganicSynthesis，”John Wiley & Sons Inc.，New York，第二章，16-94页(1994)；以及Blaser等人，“Asymmetric Catalysis on Industrial  Scale：Challenges，Approaches and Solutions，”Wiley-VCH，Weinheim，23-52页(2004)，其全文均通过参考并入本发明。

    在一些实施方案中，蒈烯可在不对称氢化催化剂的存在下被氢化形成下文所示的蒈烷的四种可能的立体异构体之一：

    在其它实施方案中，α-蒎烯或β-蒎烯可在不对称氢化催化剂的存在下被氢化形成下文所示的蒎烷的四种可能的立体异构体之一：

    在进一步的实施方案中，桧烯可在不对称氢化催化剂的存在下被氢化形成下文所示的桧烷(也称为侧柏烷或tenacetane)的四种可能的立体异构体之

    商业方法

    本发明的一个方面涉及商业方法，其包括：(a)通过糖与重组宿主细胞的发酵反应获得包含由C10类异戊二烯起始原料获得的C10二环类异戊二烯的生物燃料，其中该重组宿主细胞生成该C10类异戊二烯起始原料；和(b)营销和/或销售所述生物燃料。

    在其它实施方案中，本发明提供了向燃料的经销商、承办商和/或使用者经销或分销本发明所述的生物燃料的方法，该方法包括对本发明公开的生物燃料进行广告和/或许诺销售。在进一步的实施方案中，本发明公开的生物燃料可相对于天然燃料或相对应的含乙醇生物燃料具有改良的物理或市场特征。

    在特定的实施方案中，本发明提供了与确立的石油油料精炼商合伙或合作或许可其将本发明公开的生物燃料混合进入石油为基础的燃料(例如汽油、喷气燃料、煤油、柴油燃料或其组合)的方法。在另一实施方案中，本发明提供了与已成立的石油油料精炼商合伙或合作或许可其加工(例如，氢化、加氢裂化、进一步纯化)本发明公开的生物燃料，从而使其经修饰具有有益属性的方法。上述已成立的石油油料精炼商可将本发明公开的生物燃料作为原料进行进一步的化学修饰，该终产品可用作燃料或燃料组合物的混合组分。

    在进一步的实施方案中，本发明提供了与从可再生来源(例如，谷物、甘蔗、甘蔗渣或木质纤维材料)获得糖的生产商合伙或合作或许可其利用该种可再生糖来源生产本发明公开的生物燃料的方法。在一些实施方案中，可使用糖的传统来源谷物和甘蔗。在其它实施方案中，可将廉价的木质纤维材料(农业废物、谷物秸秆或柳枝草和蒲苇等生物量农作物)作为糖的来源。根据本发明公开的方法，可将来自于该种廉价来源的糖进行投料，以生产本发明公开的生物燃料。

    在特定的实施方案中，本发明提供了与从可再生来源(例如，谷物、甘蔗、甘蔗渣或木质纤维材料)生产和/或使用糖的化工生产商合伙或合作或许可其利用该种来自可再生糖来源的糖生产本发明公开的生物燃料的方法。

    实施例

    如下实施例仅作阐述之用，不以任何方式限制本发明的范围。

    除非另行指明，本发明的实施可采用在本领域技术范围内的生物合成等行业中的常规技术。对于本发明未完全描述的该种技术，人们可在科技文献中找到有关于此的充分参考。

    在如下的实施例中，我们努力确保所用数字(例如，数量、温度等)的精确性，但应容许变化和偏差，且当本发明存在该种数值的书写错误时，本发明所述领域的普通技术人员应能根据本发明其余的公开推出正确的量。除非另行指明，温度报道为摄氏度，压力等于或接近海平面的大气压。除非另行指明，所有的试剂均为商购的。如下实施例仅作阐述之用，不以任何方式限制本发明的范围。

    实施例1

    本实施例描述了的编码排列在操纵子中的酶的表达质粒的制备方法，所述酶包括来自酿酒酵母的MEV途径的酶。

    表达质粒pMevT可通过将MevT操纵子插入pBAD33载体后生成。该MevT操纵子编码MEV途径的一组可共同将普遍存在的前体乙酰辅酶A转化为(R)-甲羟戊酸的酶，即，乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG辅酶A合成酶、以及HMG辅酶A还原酶。通过PCR扩增来源于大肠杆菌基因组DNA的atoB基因编码序列(GenBank录入号NC_000913REGION 2324131..2325315)(编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶)、来源于酿酒酵基因组DNA母的ERG13基因的编码序列(GenBank录入号X96617，REGION 220..1695)(编码HMG辅酶A合成酶)、以及来源于酿酒酵母基因组DNA的HMG1基因的编码区域的一个片段(GenBank录入号M22002，REGION 1660..3165)(编码截短的HMG辅酶A还原酶(tHMGR))，以生成该MevT操纵子。用于HMG1基因片段扩增的上游PCR引物包括人工起始密码子。通过重叠延伸(SOEing)将扩增的片段拼接在一起，在该过程中，核糖体结合位点被引入到atoB和ERG13编码序列之后。添加3′A突出末端后，将MevT操纵子连接至TA克隆载体pCR4(Invitrogen，Carlsbad，CA)。随后，该MevT操纵子被连接至载体pBAD33的XmaI PstI限制性酶切位点(Guzman等人.(1995)J.Bacteriol.177(14)：4121-4130)。为使该操纵子受到PLac启动子的控制，以pBBR1MCS的NsiI-XmaI片段替换pBAD33的araC-PBAD Nsil-XmaI片段，以得到表达载体pMevT(参见美国专利7,192,751)。

    表达质粒pAM36-MevT66可通过将MevT66操纵子插入pAM36载体来生成。pAM36载体可通过将含有AscI-SfiI-AsiSI-XhoI-PacI-FsIl-PmeI限制性酶切位点的寡聚核苷酸盒插入pACYC184载体(GenBank录入号XO6403)，并除去pACYC184中赋予四霉素耐受性的基因后获得。该MevT66操纵子可通过以SEQ ID NO：1为模板合成得到，该SEQ ID NO：1包含了来自大肠杆菌的atoB基因(GenBank录入号NC_000913REGION 2324131..2325315)、来自酿酒酵母的ERG13基因(GenBank录入号X96617，REGION 220..1695)、以及来自酿酒酵母的截短型HMG1基因(GenBank录入号M22002，REGION1777..3285)，所有三种序列均被密码子优化以在大肠杆菌内表达。该合成生成的MevT66操纵子侧翼连接5′EcoRI限制性酶切位点和3′Hind III限制性酶切位点，因此可被克隆至克隆载体(例如标准pUC或pACYC来源的载体)的相容限制性酶切位点。该MevT66操纵子从该构建体PCR扩增，并带有侧翼的SfiI和AsiSI限制性酶切位点，使用SfiI和AsiSI限制性内切酶将扩增的DNA片段消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，通过凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)凝胶提取约4.2kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接至pAM36载体的SfiI AsiSI限制性酶切位点，以产生表达质粒pAM36-MevT66。

    表达质粒pAM25可通过将MevT66操纵子插入pAM29载体生成。该pAM29载体可通过将来自pZS24-MCS1的p15A复制起始区和赋予卡那霉素耐受性的基因(Lutz和Bujard(1997)Nucl Acids Res.25：1203-1210)与寡聚核苷酸生成的lacUV5启动子装配后生成。使用EcoRI和Hind III限制性内切酶将包含MevT66操纵子(参见上述pAM36-MevT66的描述)的DNA合成构建体消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取约4.2kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接至pAM296的EcoRI HindIII限制性酶切位点，获得表达质粒pAM25。

    表达质粒pMevB-Cm可通过将MevB操纵子插入pBBR1 MCS-1载体后生成。该MevB操纵子编码一组能共同将(R)-甲羟戊酸转化为IPP的酶，即，甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶以及甲羟戊酸焦磷酸脂羧化酶。该MevB操纵子可通过从酿酒酵母基因组DNA中PCR扩增ERG12基因(GenBank录入号X55875，REGION：580..1911)(编码甲羟戊酸激酶)、ERG8基因(GenBank录入号Z49939，REGION：3363..4718)(编码磷酸甲羟戊酸激酶)、以及MVD1基因(GenBank录入号X97557，REGION：544..1734)(编码甲羟戊酸焦磷酸脂羧化酶)的编码序列，并通过重叠延伸(SOEing)将PCT片段拼接在一起后获得。通过选择适当的引物序列，在扩增过程中将ERG12和ERG8的终止密码子由TAA变为TAG，以引入核糖体结合位点。添加3′A悬挂序列后，将MevB操纵子连接至TA克隆载体pCR4(Invitrogen，Carlsbad，CA)。通过采用PstI限制性内切酶完全消化该克隆构建体以切除该MevB操纵子，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取约4.2kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接至pBBR1 MCS-1载体的PstI限制性酶切位点(Kovach等人，Gene 166(1)：175-176(1995))，获得表达质粒pMevB-Cm。

    表达质粒pMBI可通过将MBI操纵子插入pBBR1 MCS-3载体生成。除了MevB操纵子的酶外，该MBI操纵子还编码异戊烯基焦磷酸酶异构酶，其将IPP催化转化为DMAPP。该MBI操纵子可通过如下方式获得：以包含5′端的XmaI限制性酶切位点的引物从大肠杆菌基因组DNA中PCR扩增idi基因(GenBank录入号AF119715)的编码序列，使用XmaI限制性内切酶将扩增的DNA片段消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取约0.5kb片段，并将分离的DNA片段连接至pMevB-Cm表达质粒的XmaI限制性酶切位点，从而将idi置于MevB操纵子的3′端。将该MBI操纵子亚克隆进入载体pBBR1MCS-3的SalI SacI限制性酶切位点(Kovach等人，Gene 166(1)：175-176(1995))，获得表达载体pMBI(参见美国专利7,192,751)。

    通过将ispA基因插入pMBI生成表达质粒pMBIS。该ispA基因编码法呢基二磷酸合成酶，其将两分子IPP与一分子DMAPP催化缩合生成法呢基焦磷酸(FPP)。采用具有SacII限制性酶切位点的正向引物和具有SacI限制性酶切位点的反向引物从大肠杆菌基因组DNA中PCR扩增该ispA基因(GenBank录入号D00694，REGION：484..1383)的编码序列。使用SacII和SacI限制性内切酶将扩增的PCR产物消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取约0.9kb片段，并将分离的DNA片段连接至pMBI表达质粒的SacII SacI限制性酶切位点，从而将该ispA基因置于idi和MevB操纵子的3′端，并获得表达质粒pMBIS(参见美国专利7,192,751)。

    可通过将表达质粒pMBIS的ispA编码序列替换为编码香叶基二磷酸合成酶(“gpps”)的核苷酸序列来获得表达质粒pMBIS-gpps。包含编码香叶基二磷酸合成酶的核苷酸序列的DNA片段可采用经过针对大肠杆菌表达进行密码子优化的拟南芥gpps基因(GenBank录入号Y17376，REGION：52..1320)编码序列作为模板(SEQ ID NO：2)合成得到。该核苷酸序列侧翼连接前导SacII限制性酶切位点和末端SacI限制性酶切位点，因此可被克隆进入克隆载体(例如标准pUC或pACYC来源载体)的相容限制性酶切位点。合成生成的香叶基二磷酸合成酶序列可通过如下方式分离：使用SacII和SacI限制性内切酶将该DNA合成构建体消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取约1.3kbDNA片段，并将分离的DNA片段连接至pMBIS表达质粒的SacII SacI限制性酶切位点，获得表达质粒pMBIS-gpps。

    实施例2

    本实施例描述了编码排列在操纵子中的酶的表达载体的制备方法，所述酶包括来自金黄色葡萄球菌的MEV途径的酶。

    可通过将表达质粒pAM25的HMG1基因(编码酿酒酵母HMG辅酶A还原酶)的编码序列替换为mvaA基因(编码金黄色葡萄球菌HMG辅酶A还原酶(GenBank录入号BA000017，REGION：2688925..2687648))的编码序列获得表达质粒pAM41。采用引物4-49mvaA SpeI(SEQ ID NO：11)和4-49mvaAR XbaI(SEQ ID NO：12)从金黄色葡萄球菌(ATCC 70069)基因组DNA中PCR扩增mvaA基因的编码序列，使用SpeI限制性内切酶将扩增的DNA片段消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取约1.3kb DNA片段。通过使用HindIII限制性内切酶将pAM25消化完全，从该质粒中去除HMG1编码序列。采用T4DNA聚合酶平端化所得线性DNA片段的末端悬挂。然后采用SpeI限制性内切酶部分消化该DNA片段，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取4.8kb DNA片段。分离的DNA片段与SpeI-消化的mvaA PCR产物连接，获得表达质粒pAM41。

    可通过将表达质粒pAM41的ERG 13基因(编码酿酒酵母HMG辅酶A合成酶)的编码序列替换为mvaS基因(编码金黄色葡萄球菌HMG辅酶A合成酶(GenBank录入号BA000017，REGION：2689180..2690346))的编码序列获得表达质粒pAM52。通过引物HMGS 5′Sa mvaS-S(SEQ ID NO：13)和HMGS 3′Sa mvaS-AS(SEQ ID NO：14)从金黄色葡萄球菌(ATCC 70069)基因组DNA中PCR扩增mvaS基因的编码序列，该扩增的DNA片段可用作PCR引物，并按照Geiser等人(BioTechniques 31：88-92(2001))的方法替换pAM41中的HMG1基因的编码序列，以获得表达质粒pAM52。

    实施例3

    本实施例描述了编码排列在操纵子中的酶的表达质粒的制备方法，所述酶包括来自大肠杆菌的DXP途径的酶。

    表达质粒pAM408可通过将编码“顶端”DXP途径的酶的基因插入pAM29载体后生成。“顶端”DXP途径的酶包括1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(由大肠杆菌的dxs基因编码)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(由大肠杆菌的dxr基因编码)、4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶(由大肠杆菌的ispD基因编码)、以及4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶(由大肠杆菌的ispE基因编码)，这些酶共同将丙酮酸盐和D-甘油醛-3-磷酸转化为4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸。包含编码“顶端”DXP途径的酶的核苷酸序列的DNA片段可通过采用SEQ ID NO：15至22所示的PCR引物，从具有加入了最佳Shine Dalgarno序列以及5′和3′限制性酶切位点的大肠杆菌菌株DH1(ATCC #33849)中PCR扩增dxs(GenBank录入号U00096 REGION：437539..439401)、dxr(GenBank序列号U00096 REGION：193521..194717)、ispD(GenBank录入号U00096 REGION：2869803..2870512)、以及ispE(GenBank录入号U00096REGION 1261249..1262100)基因的编码序列后生成。通过凝胶电泳分离PCR产物，凝胶提取，使用适当的限制性内切酶(XhoI和KpnI可用于包含dxs基因的PCR产物；KpnI和ApaI可用于包含dxr基因的PCR产物；ApaI和NdeI可用于包含ispD基因的PCR产物；NdeI和MluI可用于包含ispE基因的PCR产物)消化至完全，并采用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。然后将大约等摩尔量的各PCR产物添加至连接反应，以将单个基因组装进入操纵子。1μl的该连接反应的反应混合物被用于PCR扩增两个单独的基因盒，即dxs-dxr和ispD-ispE基因盒。使用引物67-1A-C(SEQ ID NO：15)和67-1D-C(SEQ ID NO：18)PCR扩增该dxs-dxr基因盒，并使用67-1E-C(SEQ ID NO：19)和67-1H-C(SEQ ID NO：22)引物PCR扩增该ispD-ispE基因盒。通过凝胶电泳分离两种PCR产物，并凝胶提取。使用XhoI和ApaI限制性内切酶将包含该dxs-dxr基因盒的PCR产物消化完全，使用ApaI和MluI限制性内切酶将包含该ispD-ispE基因盒的PCR产物消化完全。纯化该两种PCR产物，并将纯化的DNA片段连接至pAM29载体的Sall MluI限制性酶切位点，获得表达质粒pAM408(参见图4的质粒图谱)。

    表达质粒pAM409可通过将编码“底部”DXP途径的酶的基因插入pAM369载体后生成。“底部”DXP途径的酶包括2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸合成酶(由大肠杆菌的ispF基因编码)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶(由大肠杆菌的ispG基因编码)、以及异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶(由大肠杆菌的ispH基因编码)，这些酶共同将4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸转化为IPP和DMAPP。IPP还可通过异戊基二磷酸异构酶(由大肠杆菌的idi基因编码)的活性转化为DMAPP。DMAPP还可通过法呢基二磷酸合成酶(例如由大肠杆菌的ispA基因编码)的活性进一步转化为FPP。编码“底部”DXP途径的酶以及异戊基二磷酸异构酶和法呢基二磷酸合成酶的操纵子可通过采用SEQ ID NO：23至32所示的PCR引物从具有加入了最佳Shine Dalgarno序列以及5′和3′限制性酶切位点的大肠杆菌菌株DH1(ATCC#33849)中PCR扩增ispF(GenBank录入号U00096 REGION：2869323..2869802)、ispG(GenBank录入号U00096 REGION：2638708..2639826)、ispH(GenBank录入号U00096 REGION：26277.-27227)、idi(GenBank录入号AF119715)，以及ispA(GenBank录入号D00694 REGION：484..1383)基因后生成。通过凝胶电泳分离PCR产物，凝胶提取，使用适当的限制性内切酶(BamHI和ApaI可用于包含ispF基因的PCR产物；KpnI和ApaI可用于包含ispG基因的PCR产物；SalI和KpnI可用于包含ispH基因的PCR产物；SalI和HindIII可用于包含idi基因的PCR产物；HindIII和Ncol可用于包含ispA基因的PCR产物)消化，并纯化。然后将大约等摩尔量的各PCR产物添加至连接反应，以将单个基因组装进入操纵子。1μl的该连接反应的反应混合物被用于PCR扩增两个单独的基因盒，即ispF-ispG和ispH-idi-ispA基因盒。使用引物67-2A-C(SEQ ID NO：23)和67-2D-C(SEQ ID NO：26)PCR扩增该ispe-ispG基因盒，并使用引物67-2E-C(SEQ ID NO：27)和67-2J-C(SEQID NO：32)PCR扩增该ispH-idi-ispA基因盒。通过凝胶电泳分离两种PCR产物，并凝胶提取。使用BamHI和KpnI限制性内切酶将包含该ispF-ispG基因盒的PCR产物消化完全，使用KpnI和NcoI限制性内切酶将包含该ispH-idi-ispA基因盒的PCR产物消化完全。纯化两种PCR产物。可通过将来自pAM29的p15A复制起始区，来自pZE12-luc的用于氨比西林耐受的β内酰胺酶基因(Lutz和Bujard(1997)Nucl Acids Res.25：1203-1210)与寡聚核苷酸生成的lacUV5启动子装配后生成载体pAM369。将包含“底部”DXP途径操纵子的两种分离PCR产物连接至pAM369载体的BamHI NcoI限制性酶切位点，获得表达质粒pAM409(参见图4B的质粒图谱)。

    包含广泛宿主范围RK2复制起始区的表达质粒pAM409的衍生物--表达质粒pAM424可通过将pAM409的lacUV5启动子和ispFGH-idi-ispA操纵子转移至pAM257载体后生成。载体pAM257可按如下方式生成：采用引物9-156A(SEQ ID NO：33)和9-156B(SEQ ID NO：34)从RK2质粒DNA PCR扩增RK2 par基因座(Meyer等人.(1975)Science 190：1226-1228)，采用AatlI和XhoI限制性内切酶将该2.6kb PCR产物消化至完全，并将该DNA片段连接至含有来自载体pZA31-luc的p15复制起始区和赋予氯霉素耐受性的基因的质粒(Lutz和Bujard(1997)Nucl Acids Res.25：1203-1210)，获得质粒pAM37-par；采用SacI和HindIII限制性内切酶将pAM37-par消化至完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取含有RK2 par基因座和氯霉素耐受性基因的DNA片段，并将分离的DNA片段连接至mini-RK2复制子pRR10的SacI HindIII位点(Roberts等人.(1990)J Bacteriol.172：6204-6216)，获得载体pAM133；采用BglII和HindIII限制性内切酶将pAM133消化至完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取缺失氨比西林耐受性基因和oriT结合起始区的约6.4kbDNA片段，并将该分离的DNA片段与合成生成的包含多个克隆位点(包含PciI和XhoI限制性酶切位点)DNA片段相连接，获得载体pAM257。使用XhoI和PciI限制性内切酶完全消化所得的表达质粒pAM409，通过凝胶电泳分离该反应混合物，凝胶提取约4.4kb DNA片段，将分离的DNA片段连接至pAM257载体的XhoI PciI限制性酶切位点，获得表达质粒pAM424(参见图4C的质粒图谱)。

    实施例4

    本实施例描述了制备载体以将编码酶(包括MEV途径的酶)的核酸定向整合至酿酒酵母的特定染色体位置的方法。

    基因组DNA分离自酿酒酵母菌株Y002(CEN.PK2背景；MATA；ura3-52；trp1-289；leu2-3，112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2)、Y007(S288C背景MATAtrp1Δ63)、Y051(S288C背景；MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0PGAL1-HMG11586-3323 PGAL1-upc2-1 erg9::PMET3-ERG9::HIS3 PGAL1-ERG20PGAL1-HMG11586-3323)、和EG123(MATA ura3；trp1；leu2；his4 can1)。该菌株在含有1％酵母提取物、2％细菌蛋白胨、和2％右旋糖的液体培养基(YPD培养基)中生长过夜。通过3,100rpm离心，以10mL超纯水洗涤细胞团，再次离心从10mL液体培养物中分离细胞。使用Y-DER酵母DNA抽提试剂盒(Pierce Biotechnologies，Rockford，IL)根据生产商的建议方案抽提基因组DNA。将抽提的基因组DNA重悬浮于100μL 10mM Tris-Cl(pH 8.5)中，在ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE)上读取OD260/280读数，以确定基因组DNA浓度和纯度。

    在Applied Biosystems 2720 Thermocycler(Applied Biosystems Inc，FosterCity，CA)中，采用Phusion高保真DNA聚合酶系统(Finnzymes OY，Espoo，Finland)，并参照生产商的建议方案，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA。在完成待插入TOPO TA pCR2.1克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)的DNA片段的PCR扩增后，通过向该反应混合物添加1μL的Qiagen Taq聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)，额外运行10分钟，72℃ PCR伸展步骤，然后冷却至4℃，以生成核苷酸悬挂序列。在PCR扩增完成后，将8μL的50％甘油溶液添加至反应混合物，并将完整的混合物加载至含有0.5ug/mL溴化乙啡啶的1％TBE(0.89M Tris，0.89M硼酸，0.02M EDTA钠盐)琼脂糖凝胶上。

    在120V，400mA下进行琼脂糖凝胶电泳30分钟，并采用紫外线显示DNA条带。使用无菌刀片从凝胶中切除DNA条带，并采用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)参照生产商的建议方案对切除的DNA进行凝胶纯化。将纯化的DNA洗脱至10μL超纯水中，在ND-1000分光光度计上读取OD260/280读数，以确定DNA浓度和纯度。

    使用100-500ug的纯化PCR产物和高浓度的T4DNA连接酶(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA)，参照生产商的建议方案进行连接。为进行质粒增殖，将连接的构建体参照生产商的建议方案转化进入大肠杆菌DH5α化学感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在含有1.5％Bacto琼脂、1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、以及50ug/mL适当抗生素的固体培养基上选择阳性转化体。使分离的转化体在含有50ug/mL羧苄青霉素或卡那霉素抗生素的液体LB培养基中于37℃下生长16小时，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)参照生产商的建议方案分离和纯化质粒。通过诊断性限制性内切酶消化来验证构建体，在琼脂糖凝胶上分离DNA片段，并采用紫外光显示该条带。还可通过DNA测序来验证选择的构建体，该工作由Elim Biopharmaceuticals Inc.(Hayward，CA)完成。

    通过将载体pAM471的ERG20-PGAL-tHMGR插入片段插入载体pAM466生成质粒pAM489。通过将DNA片段ERG20-PGAL-tHMGR插入TOPO ZeroBlunt II克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)生成载体pAM471，该DNA片段ERG20-PGAL-tHMGR包含ERG20的开放阅读框架(ORF)(ERG20核苷酸位置1至1208；ATG起始密码子的A为核苷酸1)(ERG20)，该基因组基因座包含趋异进化GAL1和GAL10启动子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PGAL)，以及HMG1的截短ORF(HMG1核苷酸位置1586至3323)(tHMGR)。通过将DNA片段TRP1-856至+548插入TOPO TA pCR2.1克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)生成载体pAM466，该DNA片段TRP1-856至+548包含从核苷酸位置-856延伸至位置548的酿酒酵母野生型TRP1基因座的片段，并在碱基-226和-225之间带有非天然内部XmaI限制性酶切位点。参照表1的概述通过PCR扩增生成DNA片段ERG20-PGAL-tHMGR和TRP1-856至+548。为构建pAM489，使用XmaI限制性内切酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)将400ng的pAM471和100ng的pAM466消化完全，将对应于ERG20-PGAL-tHMGR插入片段和线性化的pAM466载体的DNA片段凝胶纯化，并将4摩尔当量的该纯化插入片段和1摩尔当量的该种纯化线性化载体相连接，获得pAM489(参见图5A的图谱，以及ERG20-PGAL-tHMGR插入片段的核苷酸序列SEQ ID NO：3)。

    通过将载体pAM472的ERG13-PGAL-tHMGR插入片段插入载体pAM467生成质粒pAM491。通过将DNA片段ERG13-PGAL-tHMGR插入TOPO ZeroBlunt II克隆载体的XmaI限制性酶切位点生成载体pAM472，该DNA片段ERG13-PGAL-tHMGR包含ERG13的ORF(ERG13核苷酸位置1至1626)(ERG13)，该基因组基因座包含趋异进化GAL1和GAL10启动子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PGAL)，以及HMG1的截短ORF(HMG1核苷酸位置1586至3323)(tHMGR)。通过将DNA片段URA3-723至701插入TOPO TA pCR2.1克隆载体生成载体pAM467，该DNA片段URA3-723至701包含从核苷酸位置-723延伸至位置-224的酿酒酵母野生型URA3基因座片段，并在碱基-224和-223之间带有非天然内部XmaI限制性酶切位点。参照表2的概述通过PCR扩增生成DNA片段ERG13-PGAL-tHMGR和URA3723至701。为构建pAM491，使用XmaI限制性内切酶将400ng的pAM472和100ng的pAM467消化完全，将对应于ERG13-PGAL-tHMGR插入片段和线性化的pAM467载体的DNA片段凝胶纯化，并将4摩尔当量的该纯化插入片段和1摩尔当量的该种纯化线性化载体相连接，获得pAM491(参见图5B的图谱，以及ERG13-PGAL-tHMGR插入片段的核苷酸序列SEQ ID NO：4)。

    通过将载体pAM473的IDI1-PGAL-tHMGR插入片段插入载体pAM468生成质粒pAM493。通过将DNA片段IDI1-PGAL-tHMGR插入TOPO Zero Blunt II克隆载体生成载体pAM473，该DNA片段IDI1-PGAL-tHMGR包含IDI1的ORF(IDI1核苷酸位置1至1017)(IDI1)，该基因组基因座包含趋异进化GAL1和GAL10启动子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PGAL)，以及HMG1的截短ORF(HMG1核苷酸位置1586至3323)(tHMGR)。通过将DNA片段ADE1-825至653插入TOPO TA pCR2.1克隆载体生成载体pAM468，该DNA片段ADE1-825至653包含从核苷酸位置-225延伸至位置653的酿酒酵母野生型ADE1基因座的片段，并在碱基-226和-225之间带有非天然内部XmaI限制性酶切位点。参照表3的概述通过PCR扩增生成DNA片段IDI1-PGAL-tHMGR和ADE1-825至653。为构建pAM493，使用XmaI限制性内切酶将400ng的pAM473和100ng的pAM468消化完全，将对应于IDI1-PGAL-tHMGR插入片段和线性化的pAM468载体的DNA片段凝胶纯化，并将4摩尔当量的该纯化插入片段和1摩尔当量的该种纯化线性化载体相连接，获得pAM493(参见图5C的图谱，以及IDI1-PGAL-tHMGR插入片段的核苷酸序列SEQ ID NO：5)。

    通过将载体pAM474的ERG10-PGAL-ERG12插入片段插入载体pAM469生成质粒pAM495。通过将DNA片段ERG10-PGAL-ERG12插入TOPO ZeroBlunt II克隆载体生成载体pAM474，该DNA片段ERG8-PGAL-ERG12包含ERG10的ORF(ERG10核苷酸位置1至1347)(ERG10)，该基因组基因座包含趋异进化GAL1和GAL10启动子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PGAL)，以及ERG12的ORF(ERG12核苷酸位置1至1482)(ERG12)。通过将DNA片段HIS3-32至-1000-HISMX-HIS3504至-1103插入TOPO TA pCR2.1克隆载体生成载体pAM469，该DNA片段HIS3-32至-1000-HISMX-HIS3504至-1103包含从核苷酸位置-32延伸至位置-1000的酿酒酵母野生型HIS基因座，HISMX标记，并在HIS3504至-1103序列和该HISMX标记之间带有非天然XmaI限制性酶切位点。参照表4的概述通过PCR扩增生成DNA片段ERG10-PGAL-ERG12和HIS3-32至-1000-HISMX-HIS3504至-1103。为构建pAM495，使用XmaI限制性内切酶将400ng的pAM474和100ng的pAM469消化完全，将对应于ERG10-PGAL-ERG12插入片段和线性化的pAM469载体的DNA片段凝胶纯化，并将4摩尔当量的该纯化插入片段和1摩尔当量的该种纯化线性化载体相连接，获得pAM495(参见图5D的图谱，以及ERG10-PGAL-ERG12插入片段的核苷酸序列SEQ ID NO：6)。

    通过将载体pAM475的ERG8-PGAL-ERG19插入片段插入载体pAM470生成质粒pAM497。通过将DNA片段ERG8-PGAL-ERG19插入TOPO Zero BluntII克隆载体生成载体pAM475，该DNA片段ERG8-PGAL-ERG19包含ERG8的ORF(ERG8核苷酸位置1至1512)(ERG8)，该基因组基因座包含趋异进化GAL1和GAL10启动子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PGAL)，以及ERG19的ORF(ERG19核苷酸位置1至1341)(ERG19)。通过将DNA片段LEU2-100至450-HISMX-LEU21096至1770插入TOPO TA pCR2.1克隆载体生成载体pAM470，该DNA片段LEU2-100至450-HISMX-LEU21096至1770包含从核苷酸位置-100延伸至位置450和从核苷酸位置1096延伸至位置1770的酿酒酵母野生型LEU2基因座的两个片段，HISMX标记，以及在LEU21096至1770序列和该HISMX标记之间带有非天然XmaI限制性酶切位点。参照表5的概述通过PCR扩增生成DNA片段ERG8-PGAL-ERG19和LEU2-100至450-HISMX-LEU21096至1770。为构建pAM497，使用XmaI限制性内切酶将400ng的pAM475和100ng的pAM470消化完全，纯化对应于ERG8-PGAL-ERG19插入片段和线性化的pAM470载体的DNA片段，并将4摩尔当量的该纯化插入片段和1摩尔当量的该种纯化线性化载体相连接，获得pAM497(参见图5E的图谱，以及ERG8-PGAL-ERG19插入片段的核苷酸序列SEQ ID NO：7)。

    实施例5

    本实施例描述了编码转化GPP的酶的表达质粒的制备方法。

    通过将编码α-蒎烯合成酶(“APS”)的核苷酸序列插入pTrc99A载体生成表达质粒pTrc99A-APS。该核苷酸序列插入片段可采用针对大肠杆菌表达进行密码子优化的火炬松α-蒎烯合成酶基因(GenBank录入号AF543530REGION：1..1887)的编码序列作为模板合成生成(SEQ ID No：8)。该核苷酸序列侧翼连接前导XmaI限制性酶切位点和末端XbaI限制性酶切位点。该合成的核酸被克隆进入克隆载体(例如标准pUC或pACYC来源载体)的相容限制性酶切位点，使用XbaI和XmaI限制性内切酶将该DNA合成构建体消化完全以再次从该位点释放该核酸序列，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取约1.9kb萜烯合成酶编码DNA片段。将分离的DNA片段连接至载体pTrc99A的XmaIXbaI限制性酶切位点(Amman等人，Gene 40：183-190(1985))，以获得表达质粒pTrc99A-APS(参见图6的质粒图谱)。

    分别通过将编码β-蒎烯合成酶(“BPS”)、蒈烯合成酶(“CS”)或桧宁(sabinine)合成酶(“SS”)的核苷酸序列插入pTrc99A载体来生成表达质粒pTrc99 A-BPS、pTrc99A-CS和pTrc99A-SS。该核苷酸序列插入片段可采用，例如，青蒿素β-蒎烯合成酶的编码序列(GenBank录入号AF276072 REGION：1..1749)、Salviastenophylla的蒈烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AF527416 REGION：78..1871)、或是鼠尾草的桧宁合成酶的编码序列(GenBank录入号AF051901REGION：26..1798)作为模板合成生成。编码β-蒎烯和桧宁合成酶的核苷酸序列侧翼连接前导XmaI限制性酶切位点和末端XbaI限制性酶切位点，而编码蒈烯合成酶的核苷酸序列侧翼连接前导NcoI限制性酶切位点和末端XmaI限制性酶切位点。采用XmaI和XbaI限制性内切酶将该β-蒎烯和桧宁合成酶DNA合成构建体消化完全，并采用NcoI和XmaI限制性内切酶将该蒈烯合成酶DNA合成构建体消化完全。通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取约1.7至1.8kbDNA片段，然后将分离的DNA片段连接至pTrc99A载体的XmaI XbaI限制性酶切位点(针对β-蒎烯和桧宁合成酶插入片段)或NcoI XmaI限制性酶切位点(针对蒈烯合成酶插入片段)，获得表达质粒pTrc99 A-BPS、pTrc99A-CS或pTrc99A-SS(参见图6的质粒图谱)。

    可通过将连接趋异进化GAL1和GAL10启动子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PGAL)的编码α-蒎烯合成酶(“APS”)、β-蒎烯合成酶(“BPS”)、蒈烯合成酶(“CS”)、或桧宁合成酶(“SS”)的核苷酸序列分别插入载体pRS425-leu2d以得到表达质粒pRS425-leu2d-APS、pRS425-leu2d-BPS、pRS425-leu2d-CS以及pRS425-leu2d-SS。载体pRS425-leu2d可通过如下方式生成：采用引物PW-91-079-CPK373-G(SEQ ID NO：87)和PW-79-079-CPK374-G(SEQ ID NO：88)PCR扩增pAM178的leu2基因(SEQ ID NO：10)，采用PW-91-079-CPK376-G(SEQ ID NO：89)和PW-79-079-CPK375-G(SEQ ID NO：90)PCR扩增pRS425载体的骨架(GenBank录入号U03452)，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取约1.6kb leu2基因片段和约4.6kb pRS425载体骨架，以T4激酶处理该DNA片段，以加入末端磷酸基团，并连接这两个DNA片段。该核苷酸序列插入片段可采用，例如火炬松的α-蒎烯合成酶的编码序列(GenBank录入号AF543530REGION：1..1887)、青蒿素的β-蒎烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AF276072REGION：1..1749)、Salvia stenophylla的蒈烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AF527416REGION：78..1871)或是鼠尾草的桧宁合成酶的编码序列(GenBank录入号AF051901REGION：26..1798)作为模板合成生成，上述每一个编码序列均连接了趋异进化GAL1和GAL10启动子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PGAL)，该核苷酸序列均有平头末端，因此可被克隆进入克隆载体(例如标准pUC或pACYC来源载体)的相容限制性酶切位点。合成生成的PGAL-萜烯合成酶序列可通过如下方式分离，使用SmaI限制性内切酶将该DNA合成构建体消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取约2.5kb至2.6kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接至载体pRS425-leu2d的SmaI限制性酶切位点，获得表达质粒pRS425-leu2d-APS、pRS425-leu2d-BPS、pRS425-leu2d-CS或pRS425-leu2d-SS(见图7的质粒图谱)。

    实施例6

    本实施例描述了可用于本发明的大肠杆菌宿主菌株的生成。

    如表6所述，通过实施例1至3和实施例5的一种或多种表达质粒转染化学感受态大肠杆菌亲代细胞以生成宿主菌株。

    在含有抗生素的Luria Bertoni(LB)琼脂上选择宿主细胞转化体。将单克隆从LB琼脂转移至含有5mL的LB液体培养基和抗生素的培养管中。在250rpm的旋转振荡器上于37℃下孵育培养物，直至生长至指数期。通过将细胞在含有0.8％葡萄糖和抗生素的M9-MOPS培养基(M9-MOPS培养基的组分可参见表7)中连续传代4至5代，使细胞适应最小培养基。将细胞以由400μL无菌50％甘油和600μL液体培养基组成的1mL储存液储存在-80℃下的冷冻小瓶中。

    实施例7

    本实施例描述了可用于本发明的酿酒酵母菌株的生成。

    可通过以酿酒酵母MET3启动子替换ERG9启动子，并以光滑念珠菌LEU2基因(CgLEU2)替换ADE1ORF来制备酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C(Y002)(MATA；ura3-52；trp1-289；leu2-3，112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2)和CEN.PK2-1D(Y003)(MATα；ura3-52；trp1-289；leu2-3，112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2)(van Dijken等人.(2000)Enzyme Microb.Technol.26(9-10)：706-714)以导入可诱导MEV途径基因。这可通过以引物50-56-pw100-G(SEQ ID NO：85)和50-56-pw101-G(SEQ ID NO：86)PCR扩增载体pAM328的KanMX-PMET3区(SEQ ID NO：9)(其包含与天然ERG9启动子同源的45个碱基对)，使用40％w/w聚乙二醇3350(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、100mM醋酸锂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、以及10ug鲑鱼精子DNA(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)来将10ug所得的PCR产物转化进入对数生长的Y002和Y003细胞中，将该细胞在30℃下孵育30分钟后在42℃下热冲击30分钟后(Schiestl和Gietz.(1989)Curr.Genet.16，339-346)来实现。阳性重组体可通过其在含有0.5ug/mL遗传霉素(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)的丰富培养基上生长的能力来进行鉴定，并可通过诊断性PCR对所选的克隆进行确认。所得克隆命名为Y93(MAT A)和Y94(MATα)。然后使用引物61-67-CPK066-G(SEQ ID NO：83)和61-67-CPK067-G(SEQ ID NO：84)从光滑念珠菌基因组DNA(ATCC，Manassas，VA)扩增该3.5kb CgLEU2基因组基因座(其包含与ADE1ORF同源的50个碱基对)，并将10ug所得的PCR产物转化进入对数生长的Y93和Y94细胞，通过在没有亮氨酸添加下生长来选择阳性重组体，并通过诊断PCR确认所选的克隆。所得克隆命名为Y 176(MAT A)和Y 177(MATα)。

    然后通过使用PmeI限制性内切酶(New England Biolabs，Beverly，MA)消化2ug的pAM491和pAM495质粒DNA，并将该纯化的DNA插入片段导入对数生长的Y176细胞以得到菌株Y188。通过在缺乏尿嘧啶和组氨酸的培养基上生长来选择阳性重组体，并通过诊断性PCR确认整合进入正确的基因组基因座。

    然后通过使用PmeI限制性内切酶消化2ug的pAM489和pAM497质粒DNA，并将该纯化的DNA插入片段导入对数生长的Y177细胞来得到菌株Y189。通过在缺乏色氨酸和组氨酸的培养基上生长来选择阳性重组体，并通过诊断性PCR确认整合进入正确的基因组基因座。

    将来自菌株Y188和Y189的约1×107细胞在YPD培养板上室温下混合6小时以允许交配。将混合的细胞培养物涂覆在缺乏组氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培养基上以选择二倍体细胞的生长。以被PmeI限制性内切酶完全消化的2ug的pAM493质粒DNA转化该二倍体细胞，并将纯化的DNA插入片段导入对数生长的二倍体细胞，从而形成菌株Y238。通过在缺乏腺嘌呤的培养基上生长来选择阳性重组体，并通过诊断性PCR确认整合进入正确的基因组基因座。

    单倍体菌株Y211(MATα)可通过如下方式生成：在2％醋酸钾和0.02％棉子糖液体培养基中使菌株Y238形成孢子，采用Singer Instruments MSM300系列显微操作仪(Singer Instrument LTD，Somerset，UK)分离约200个遗传四分体，通过在缺乏腺嘌呤、组氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培养基中生长的能力来鉴定包含诱导的遗传物质的适当补体的独立遗传分离物，并通过诊断性PCR确认所有诱导的DNA的整合。

    最后，以表达质粒pRS425-leu2d-APS、pRS425-leu2d-BPS、pRS425-leu2d-CS或pRS425-leu2d-SS转化菌株Y211生成宿主菌株9至12。在含有2％葡萄糖和除亮氨酸外的所有氨基酸的合成的确定组分培养基(SM-glu)上选择宿主细胞转化体。将单个克隆转移至含有5mL缺乏亮氨酸的液体SM-glu的培养瓶中，并在30℃下振荡孵育该培养物直至达到静止期。将细胞以由400μL无菌50％甘油和600μL液体培养基组成的1mL储存液储存在-80℃下的冷冻小瓶中。

    实施例8

    本实施例描述了在大肠杆菌宿主菌株中通过MEV途径来生成α-蒎烯、β-蒎烯、蒈烯以及桧宁。

    将宿主菌株1至4的等分储液添加至含有25mL M9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物、以及表6中所述的抗生素的单独的125mL烧瓶中，并生长过夜，以形成宿主菌株1至4的接种培养物。该接种培养物可用于以约0.05的初始OD600接种含有40mL M9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物以及抗生素的单独的250mL烧瓶。在250rpm的旋转振荡器上于30℃下孵育培养物直至其达到约0.2的OD600，此时通过向培养基添加40uL的1M IPTG诱导宿主细胞中的目标化合物的生成。该目标化合物可通过溶剂-溶剂萃取从培养基中分离，或者当该目标化合物的滴定浓度大到足以在培养基中饱和并形成第二相时，可通过沉降和倾析进行分离。

    实施例9

    本实施例描述了在大肠杆菌宿主菌株中通过DXP途径来生成α-蒎烯、β-蒎烯、蒈烯以及桧宁。

    将宿主菌株5至8的等分储液添加至含有25mL M9-MOPS、0.8％葡萄糖、0.5％酵母提取物、以及表6中所述的抗生素的单独的125mL烧瓶中，并生长过夜，以形成宿主菌株5至8的接种培养物。该接种培养物可用于以约0.05的初始OD600接种含有40mL M9-MOPS、45ug/mL硫胺素、微量营养素、1.00E-5mol/L FeSO4、0.1M MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物以及抗生素的单独的250mL烧瓶。在250rpm的加湿培养振荡器上于30℃下孵育培养物直至其达到约0.2至0.3的OD600，此时通过向培养基添加40uL的1M IPTG诱导宿主细胞中的目标化合物的生成。该目标化合物可通过溶剂-溶剂萃取从该培养基中分离，或者当该目标化合物的滴定浓度大到足以在培养基中饱和并形成第二相时，可通过沉降和倾析进行分离。

    实施例10

    本实施例描述了在酿酒酵母宿主菌株中α-蒎烯、β-蒎烯、蒈烯以及桧宁的生成。

    将宿主菌株9至12的等分储液添加至含有缺乏亮氨酸的25mL SM-glu的单独的125mL烧瓶中，并分别生长过夜，以形成宿主菌株9至12的接种培养物。该接种培养物可用于以约0.05的初始OD600接种含有0.2％葡萄糖和1.8％半乳糖，缺乏亮氨酸的40mL合成的组分明确培养基的250mL带挡板烧瓶。在200rpm的旋转振荡器上于30℃下孵育培养物。该目标化合物可通过溶剂-溶剂萃取从培养基中分离，或者当该目标化合物的滴定浓度大到足以在培养基中饱和并形成第二相时，可通过沉降和倾析进行分离。

    实施例11

    本实施例描述将α-蒎烯氢化为蒎烷。

    以6g/L的量向反应容器添加α-蒎烯和10％Pd/C[钯，在活性炭上含10wt.％，Aldrich #205699]。将容器密封，以氮气清洗，然后通过真空系统抽真空。为启动反应，在搅拌该容器的同时在80psig下添加压缩氢气。在室温下进行该温和的放热反应。最终的转化为100％，这可以氢耗尽为标志，并通过结合火焰离子化检测的气相色谱来进行验证。该产物-催化剂混合物可经硅胶通过重力过滤进行分离，并以Agilent DB-XLB柱和火焰离子化检测器来进行分析。

    实施例12

    将包含98.7％蒎烷的燃料组合物(称为AMJ-400)与各种量的Jet A混合。AMJ-400的组分可通过气相色谱/火焰离子化检测器(GC/FID)进行鉴定。各种混合物的效果符合ASTM D 1655的结果显示于表8：Jet A，100％AMJ-400，50％ AMJ-400和50％ Jet A，以及20％ AMJ-400和80％ Jet A。图9显示了Jet A和Jet A与AMJ-400的特定混合物的蒸馏曲线

    本发明描述的该燃料组合物可通过具有成本效益的和环境良好的方式制备。有利的是，用于本发明的燃料组合物的该C10二环类异戊二烯化合物可通过一种或多种微生物生成。这些C10二环类异戊二烯化合物从而可提供可用于柴油或喷气燃料、特别是本发明提供的燃料组合物的可再生能源。此外，这些C10二环类异戊二烯化合物可降低对不可再生的燃料、燃料组分和/或燃料添加剂的来源的依赖性。在特定的实施方案中，本发明提供的燃料组合物包含生物工程蒈烷、蒎烷和桧烷。

    尽管本发明已通过有限量的实施方案进行了描述，一个实施方案的具体特征不应归于本发明的其它实施方案。没有一个单独的实施方案可代表所主张的主题的所有方面。在一些实施方案中，该组合物或方法可包括多种本发明未提及的化合物或步骤。在其它实施方案中，该组合物或方法不包括，或基本不包括，本发明未列举的任何化合物或步骤。存在对本发明所述的实施方案的变化和改动。应注意，本发明公开的该喷气燃料组合物的应用不限于喷气发动机；它可用于任何需要喷气燃料的装备。尽管对于多数喷气燃料存在规范，并非本发明公开的所有喷气燃料组合物均需要满足这些规范的所有要求。应注意，本发明公开的制备和使用该喷气燃料的方法涉及多个步骤。这些步骤可以任何顺序实施。可省略或合并一个或多个步骤，但依然实现基本相同的结果。所附的权利要求书意在覆盖所有落入本发明范围的该种变化和改动。

    本说明书中所涉及的所有出版物和专利申请均作为参考引入本文，其引用程度如同每一个单独的出版物和专利申请均为特定的单独的作为参考引入本文一样。尽管为了清楚理解的目的，前述发明已通过图示和范例进行了详细描述，本领域的普通技术人员根据本发明的教导应当能够容易地理解可在不背离所加权利要求的主旨和范围的情况下对其进行一定的更改和调整。

    本发明描述的该燃料组合物可通过具有成本效益的和环境良好的方式制备。有利的是，用于本发明的燃料组合物的该C10二环类异戊二烯化合物可通过一种或多种微生物生成。这些C10二环类异戊二烯化合物从而可以提供了可用于柴油或喷气燃料、特别是本发明提供的燃料组合物的可再生能源。此外，这些C10二环类异戊二烯化合物可降低对不可再生的燃料、燃料组分和/或燃料添加剂的来源的依赖性。在特定的实施方案中，本发明提供的燃料组合物包含生物工程蒈烷、蒎烷和桧烷。

    尽管本发明已通过有限数量的实施方案进行了描述，一个实施方案的具体特征不应归于本发明的其它实施方案。没有一个单独的实施方案可代表所主张的主题的所有方面。在一些实施方案中，该组合物或方法可包括多种本发明未提及的化合物或步骤。在其它实施方案中，该组合物或方法不包括，或基本不包括，本发明未列举的任何化合物或步骤。存在对本发明所述的实施方案的变化和改动。应注意，本发明公开的该喷气燃料组合物的应用不限于喷气发动机；它可用于任何需要喷气燃料的装备。尽管对于多数喷气燃料存在规范，并非本发明公开的所有喷气燃料组合物均需要满足这些规范的所有要求。应注意，本发明公开的制备和使用该喷气燃料的方法涉及多个步骤。这些步骤可以任何顺序实施。可省略或合并一个或多个步骤，但依然实现基本相同的结果。所附的权利要求书意在覆盖所有落入本发明范围的该种变化和改动。

    本说明书中所涉及的所有出版物和专利申请均作为参考引入本文，其引用程度如同每一个单独的出版物和专利申请均为特定的单独的作为参考引入本文中一样。尽管为了清楚理解的目的，前述发明已通过图示和范例进行了详细描述，本领域的普通技术人员根据本发明的教导应当能够容易理解可在不背离所附权利要求的精神和范围的情况下对其进行一定的更改和调整。

    【序列表】

    SEQ ID NO：1

    MevT66启动子(5’至3’)

    GAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCT

    GCGGTCCGCACGGCGATCGGCAGCTTTAACGGCTCTTTAGCGAGC

    ACCTCTGCAATCGATCTGGGTGCGACGGTCATTAAGGCCGCCATTG

    AACGCGCCAAAATCGACAGCCAGCACGTTGATGAGGTGATCATGG

    GCAATGTGTTACAAGCCGGCCTGGGTCAAAACCCAGCGCGTCAAG

    CACTGTTAAAATCTGGTCTGGCCGAGACCGTGTGTGGCTTCACCGT

    CAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCCTGAAGAGCGTGGCCCTGGCAGC

    ACAAGCGATTCAAGCCGGTCAGGCACAAAGCATCGTTGCGGGTGG

    CATGGAGAACATGTCTCTGGCGCCGTACTTATTAGATGCCAAAGCC

    CGCAGCGGTTATCGCCTGGGCGATGGTCAGGTGTACGACGTCATC

    TTACGCGATGGCTTAATGTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGTA

    TTACGGCCGAAAACGTGGCGAAAGAATACGGCATTACGCGCGAGA

    TGCAGGATGAATTAGCACTGCACTCTCAGCGCAAAGCAGCAGCCG

    CGATCGAGTCTGGTGCGTTTACGGCGGAAATCGTGCCAGTTAACGT

    GGTCACGCGCAAGAAGACGTTCGTTTTCAGCCAGGACGAGTTCCC

    GAAGGCAAACAGCACCGCGGAGGCCTTAGGTGCCTTACGCCCAGC

    CTTTGACAAAGCGGGCACGGTCACCGCCGGTAATGCGAGCGGCAT

    CAATGATGGTGCAGCGGCACTGGTCATCATGGAAGAGAGCGCCGC

    ATTAGCAGCGGGTCTGACCCCATTAGCGCGCATTAAATCTTATGCC

    AGCGGCGGCGTCCCACCAGCCCTGATGGGCATGGGTCCGGTCCCA

    GCCACGCAAAAAGCCCTGCAATTAGCGGGCCTGCAACTGGCCGAC

    ATTGATCTGATCGAGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGTTCCTG

    GCGGTGGGTAAGAATCTGGGCTTCGACAGCGAGAAAGTCAATGTG

    AACGGTGGCGCGATTGCGTTAGGCCATCCGATTGGTGCAAGCGGC

    GCACGCATCTTAGTGACGTTACTGCACGCCATGCAGGCACGCGAC

    AAGACCTTAGGCCTGGCGACCTTATGTATTGGTGGCGGTCAAGGTA

    TCGCCATGGTGATCGAACGCCTGAACTGAAGATCTAGGAGGAAAG

    CAAAATGAAACTGAGCACCAAGCTGTGCTGGTGTGGCATCAAGGG

    TCGCCTGCGCCCACAAAAGCAGCAACAGCTGCACAACACGAACCT

    GCAAATGACCGAGCTGAAAAAGCAGAAGACGGCCGAGCAAAAGAC

    CCGCCCGCAGAACGTTGGCATCAAGGGCATCCAGATTTATATCCCG

    ACGCAGTGTGTCAACCAATCTGAGCTGGAGAAATTCGATGGCGTCA

    GCCAGGGTAAGTACACCATCGGCCTGGGCCAGACCAACATGAGCT

    TCGTGAACGACCGTGAGGACATCTATTCTATGAGCCTGACGGTGCT

    GTCTAAGCTGATCAAGAGCTACAACATCGACACGAATAAGATCGGT

    CGTCTGGAGGTGGGTACGGAGACGCTGATTGACAAGAGCAAAAGC

    GTGAAGTCTGTCTTAATGCAGCTGTTCGGCGAGAACACGGATGTCG

    AGGGTATCGACACCCTGAACGCGTGTTACGGCGGCACCAACGCAC

    TGTTCAATAGCCTGAACTGGATTGAGAGCAACGCCTGGGATGGCC

    GCGATGCGATCGTCGTGTGCGGCGATATCGCCATCTATGACAAGG

    GTGCGGCACGTCCGACCGGCGGTGCAGGCACCGTTGCGATGTGGA

    TTGGCCCGGACGCACCAATTGTCTTCGATTCTGTCCGCGCGTCTTA

    CATGGAGCACGCCTACGACTTTTACAAGCCGGACTTCACGAGCGAA

    TACCCGTACGTGGACGGCCACTTCTCTCTGACCTGCTATGTGAAGG

    CGCTGGACCAGGTTTATAAGTCTTATAGCAAAAAGGCGATTTCTAA

    GGGCCTGGTCAGCGACCCGGCAGGCAGCGACGCCCTGAACGTGCT

    GAAGTATTTCGACTACAACGTGTTCCATGTCCCGACCTGCAAATTA

    GTGACCAAATCTTATGGCCGCCTGTTATATAATGATTTCCGTGCCA

    ACCCGCAGCTGTTCCCGGAGGTTGACGCCGAGCTGGCGACGCGTG

    ATTACGACGAGAGCCTGACCGACAAGAACATCGAGAAGACCTTCG

    TCAACGTCGCGAAGCCGTTCCACAAAGAGCGTGTGGCCCAAAGCC

    TGATCGTCCCGACCAACACGGGCAACATGTATACCGCGTCTGTCTA

    CGCGGCATTCGCGAGCCTGCTGAATTACGTCGGTTCTGACGACCTG

    CAGGGCAAGCGCGTTGGCCTGTTCAGCTACGGTAGCGGCTTAGCG

    GCCAGCCTGTATAGCTGCAAAATTGTCGGCGACGTCCAGCACATCA

    TCAAGGAGCTGGACATCACCAACAAGCTGGCGAAGCGCATCACCG

    AGACGCCGAAAGATTACGAGGCAGCGATCGAGTTACGCGAGAATG

    CGCATCTGAAGAAGAACTTCAAGCCGCAAGGTAGCATCGAGCACC

    TGCAGAGCGGCGTCTACTACCTGACGAACATTGACGACAAGTTCCG

    CCGTTCTTATGACGTCAAAAAGTAACTAGTAGGAGGAAAACATCAT

    GGTGCTGACGAACAAAACCGTCATTAGCGGCAGCAAGGTGAAGTC

    TCTGAGCAGCGCCCAAAGCTCTAGCAGCGGCCCGTCTAGCAGCAG

    CGAGGAGGACGACAGCCGTGACATTGAGTCTCTGGACAAGAAGAT

    CCGCCCGCTGGAGGAGTTAGAGGCCCTGCTGAGCAGCGGCAACAC

    CAAGCAGCTGAAGAACAAGGAAGTTGCAGCGCTGGTGATCCACGG

    TAAGCTGCCACTGTATGCGCTGGAAAAGAAACTGGGCGATACGAC

    GCGTGCGGTCGCGGTGCGTCGCAAAGCCTTAAGCATCTTAGCGGA

    GGCCCCGGTGTTAGCCAGCGACCGCCTGCCGTACAAGAACTACGA

    CTACGACCGCGTGTTTGGCGCGTGCTGCGAGAATGTCATTGGCTAC

    ATGCCGTTACCGGTTGGTGTGATCGGCCCGCTGGTCATTGATGGCA

    CGAGCTATCACATTCCAATGGCGACCACGGAAGGTTGCTTAGTCGC

    CAGCGCCATGCGTGGCTGTAAGGCGATTAACGCCGGCGGTGGCGC

    GACGACCGTGTTAACCAAGGATGGTATGACGCGCGGTCCGGTCGT

    CCGCTTCCCAACGCTGAAGCGCAGCGGCGCGTGTAAGATTTGGCT

    GGATTCTGAGGAGGGCCAAAACGCGATCAAGAAAGCCTTCAACTC

    TACGAGCCGTTTCGCGCGTTTACAGCATATCCAGACCTGCCTGGCC

    GGCGACCTGCTGTTCATGCGCTTCCGCACCACCACGGGCGATGCG

    ATGGGCATGAACATGATCAGCAAGGGCGTCGAATATAGCCTGAAA

    CAAATGGTGGAAGAATATGGCTGGGAGGACATGGAGGTTGTCTCT

    GTGAGCGGCAACTATTGCACCGACAAGAAGCCGGCAGCCATTAAC

    TGGATTGAGGGTCGCGGCAAAAGCGTCGTGGCAGAAGCGACCATC

    CCAGGCGACGTGGTCCGTAAGGTTCTGAAGAGCGACGTCAGCGCC

    CTGGTTGAGTTAAATATCGCGAAAAACCTGGTCGGCAGCGCGATG

    GCGGGCAGCGTGGGTGGCTTTAACGCACATGCAGCGAATCTGGTT

    ACGGCGGTTTTCTTAGCCTTAGGTCAGGACCCAGCCCAAAATGTCG

    AGAGCAGCAACTGCATTACCTTAATGAAAGAGGTTGACGGTGACCT

    GCGCATCAGCGTTTCTATGCCGTCTATCGAGGTCGGCACGATCGGC

    GGCGGCACCGTTTTAGAACCGCAAGGTGCGATGCTGGATCTGCTG

    GGCGTGCGCGGCCCACATGCAACGGCCCCAGGCACCAATGCCCGC

    CAACTGGCCCGTATCGTGGCCTGCGCGGTTCTGGCGGGTGAGCTG

    AGCCTGTGCGCCGCATTAGCCGCGGGCCATTTAGTTCAATCTCACA

    TGACCCACAACCGCAAGCCGGCAGAACCAACCAAGCCAAATAACC

    TGGACGCAACCGACATTAACCGTCTGAAGGATGGCAGCGTCACGT

    GCATTAAAAGCTGAGCATGCTACTAAGCTT

    SEQ ID NO：2

    拟南芥的香叶基二磷酸合成酶，针对大肠杆菌中的表达进行密码子优化，且其侧翼连接NotI和SacI酶切位点(5’至3’)

    GCGGCCGCGGAAAAGGAGGCCGGCCGGCATGCTGCTGTCTAATAA

    ACTGCGTGAAATGGTTCTGGCTGAAGTACCTAAACTGGCCTCCGCA

    GCAGAATATTTCTTCAAGCGTGGCGTTCAGGGCAAACAGTTCCGTA

    GCACCATCCTGCTGCTGATGGCTACCGCCCTGGACGTGCGTGTCCC

    GGAAGCCCTGATCGGCGAATCCACCGACATCGTGACCTCTGAACT

    GCGTGTTCGTCAGCGTGGTATCGCGGAAATCACCGAAATGATCCAC

    GTTGCGTCTCTGCTGCACGACGATGTGCTGGACGATGCAGACACC

    CGTCGTGGTGTTGGTTCCCTGAACGTGGTGATGGGTAACAAAATGA

    GCGTGCTGGCAGGCGACTTTCTGCTGTCTCGCGCCTGTGGTGCTCT

    GGCTGCGCTGAAGAACACCGAGGTAGTGGCACTGCTGGCGACTGC

    CGTAGAGCACCTGGTTACCGGCGAAACGATGGAAATTACTTCTTCC

    ACCGAACAGCGTTACTCCATGGACTACTACATGCAGAAGACTTACT

    ATAAAACCGCGTCCCTGATTAGCAACTCTTGTAAAGCAGTAGCAGT

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    TTGGGGCAAGAAGAATACGAAAAGGTTGCCATTCTAGGTTGGTGC

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    ACTTAGACTGCTTCGGTACCCCAGAACAGATCGGTAAGATCGGTAC

    AGATATCCAAGATAACAAATGTTCTTGGGTAATCAACAAGGCATTG

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    ATAGTATAAGCTTTAAGATAGTATCTCTCGATCTACCGTTCCACGT

    GACTAGTCCAAGGATTTTTTTTAACCCGGGATATATGTGTACTTTG

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    AGGTAGTTCTGGTCCATTGGTGAAAGTTTGCGGCTTGCAGAGCACA

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    TTATATGTGTGCCCAATAGAAAGAGAACAATTGACCCGGTTATTGC

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    ACTCCGAAATACTTGGTTGGCGTGTTTCGTAATCAACCTAAGGAGG

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    GCTAAGAGATAGTGATGATATTTCATAAATAATGTAATTCTATATAT

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    TTGACCATCAAAGAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTCAGGGTCCATA

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    GGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTA

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    TTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGC

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    TTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATAT

    CTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACA

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    AAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGT

    TGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTG

    CGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGA

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    TCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCT

    TACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGC

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    ACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAG

    CGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATC

    AGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTA

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    GTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATT

    CTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGA

    ATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGC

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    TTCTTGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAG

    TTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTT

    GTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAA

    ATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATA

    TATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCC

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    AATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCA

    ATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTAT

    TGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACG

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    TTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAG

    TAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATAT

    GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTT

    TGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGGTGT

    GGTATTAAAGGAAGACTTAGGCCGCAAAAGCAACAACAATTACACA

    ATACAAACTTGCAAATGACTGAACTAAAAAAACAAAAGACCGCTGA

    ACAAAAAACCAGACCTCAAAATGTCGGTATTAAAGGTATCCAAATT

    TACATCCCAACTCAATGTGTCAACCAATCTGAGCTAGAGAAATTTG

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    GACGTCGAAGGTATTGACACGCTTAATGCCTGTTACGGTGGTACCA

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    TAAAGGGTTGGTTAGCGATCCCGCTGGTTCGGATGCTTTGAACGTT

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    AATGTTGCTAAGCCATTCCACAAAGAGAGAGTTGCCCAATCTTTGA

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    AATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGTAATAC

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    CTGGAGAATATACTAAGGGTACTGTTGACATTGCGAAGAGCGACAA

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    ATGTGGTCTCTACAGGATCTGACATTATTATTGTTGGGTTTAAAC

    SEQ ID NO：5

    pAM493的IDI1-PGAL-tHMGR插入物(5’至3’)

    GTTTAAACTACTCAGTATATTAAGTTTCGAATTGAAGGGCGAACTC

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    AATCCTCGTTTCCTAAAGTAAGTTTACTTCCACTTGTAGGCCTATTA

    TTAATGATATCTGAATAATCCTCTATTAGGGTTGGATCATTCAGTA

    GCGCGTGCGATTGAAAGGAGTCCATGCCCGACGTCGACGTGATTA

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    CTCCTTGACACCACTTGCGGAAGTCTCATCAACATGCTCTTCCTTA

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    GTATTTCACCTCTTTCTCGACTTGAACACGTCCAACTCCTTAAGTAC

    TACCACAGCCAGGAAAGAATGGATCCAGTTCTACACGATAGCAAAG

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    GCACTTGATCCATGTAGCCATACTCGAAATTTCAACTCATCTGAAA

    CTTTTCCTGAAGGTTGAAAAAGAATGCCATAAGGGTCACCCGAAGC

    TTATTCACGCCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTT

    CTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAA

    ACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCT

    TTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAAT

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    AAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCA

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    ATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTG

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    TAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCA

    CCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCA

    AATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCG

    ACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCA

    CTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCAT

    TGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCG

    GAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAG

    TAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGAT

    GGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACA

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    TTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGC

    TTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTAC

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    TGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCA

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    CTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAA

    GGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTT

    TCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATG

    GTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAG

    AGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTT

    TTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAG

    CGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAAT

    GCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAAT

    ATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAG

    CTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGA

    CTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGC

    AGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTTTTCACCAATTGGTCTGCA

    GCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTA

    ACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATAC

    AAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTT

    TGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGAT

    TAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCC

    TATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAG

    GTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTA

    GAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTT

    TCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCT

    TCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTT

    CAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGA

    GAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACA

    ACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCC

    ATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGT

    AAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGACTGCCGACAACAATAGT

    ATGCCCCATGGTGCAGTATCTAGTTACGCCAAATTAGTGCAAAACC

    AAACACCTGAAGACATTTTGGAAGAGTTTCCTGAAATTATTCCATT

    ACAACAAAGACCTAATACCCGATCTAGTGAGACGTCAAATGACGAA

    AGCGGAGAAACATGTTTTTCTGGTCATGATGAGGAGCAAATTAAGT

    TAATGAATGAAAATTGTATTGTTTTGGATTGGGACGATAATGCTAT

    TGGTGCCGGTACCAAGAAAGTTTGTCATTTAATGGAAAATATTGAA

    AAGGGTTTACTACATCGTGCATTCTCCGTCTTTATTTTCAATGAACA

    AGGTGAATTACTTTTACAACAAAGAGCCACTGAAAAAATAACTTTC

    CCTGATCTTTGGACTAACACATGCTGCTCTCATCCACTATGTATTG

    ATGACGAATTAGGTTTGAAGGGTAAGCTAGACGATAAGATTAAGG

    GCGCTATTACTGCGGCGGTGAGAAAACTAGATCATGAATTAGGTAT

    TCCAGAAGATGAAACTAAGACAAGGGGTAAGTTTCACTTTTTAAAC

    AGAATCCATTACATGGCACCAAGCAATGAACCATGGGGTGAACATG

    AAATTGATTACATCCTATTTTATAAGATCAACGCTAAAGAAAACTTG

    ACTGTCAACCCAAACGTCAATGAAGTTAGAGACTTCAAATGGGTTT

    CACCAAATGATTTGAAAACTATGTTTGCTGACCCAAGTTACAAGTT

    TACGCCTTGGTTTAAGATTATTTGCGAGAATTACTTATTCAACTGGT

    GGGAGCAATTAGATGACCTTTCTGAAGTGGAAAATGACAGGCAAAT

    TCATAGAATGCTATAACAACGCGTCAATAATATAGGCTACATAAAA

    ATCATAATAACTTTGTTATCATAGCAAAATGTGATATAAAACGTTTC

    ATTTCACCTGAAAAATAGTAAAAATAGGCGACAAAAATCCTTAGTA

    ATATGTAAACTTTATTTTCTTTATTTACCCGGGAGTCAGTCTGACTC

    TTGCGAGAGATGAGGATGTAATAATACTAATCTCGAAGATGCCATC

    TAATACATATAGACATACATATATATATATATACATTCTATATATTC

    TTACCCAGATTCTTTGAGGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCA

    GTTGGTACTATTAAGAACAATCGAATCATAAGCATTGCTTACAAAG

    AATACACATACGAAATATTAACGATAATGTCAATTACGAAGACTGA

    ACTGGACGGTATATTGCCATTGGTGGCCAGAGGTAAAGTTAGAGA

    CATATATGAGGTAGACGCTGGTACGTTGCTGTTTGTTGCTACGGAT

    CGTATCTCTGCATATGACGTTATTATGGAAAACAGCATTCCTGAAA

    AGGGGATCCTATTGACCAAACTGTCAGAGTTCTGGTTCAAGTTCCT

    GTCCAACGATGTTCGTAATCATTTGGTCGACATCGCCCCAGGTAAG

    ACTATTTTCGATTATCTACCTGCAAAATTGAGCGAACCAAAGTACA

    AAACGCAACTAGAAGACCGCTCTCTATTGGTTCACAAACATAAACT

    AATTCCATTGGAAGTAATTGTCAGAGGCTACATCACCGGATCTGCT

    TGGAAAGAGTACGTAAAAACAGGTACTGTGCATGGTTTGAAACAAC

    CTCAAGGACTTAAAGAATCTCAAGAGTTCCCAGAACCAATCTTCAC

    CCCATCGACCAAGGCTGAACAAGGTGAACATGACGAAAACATCTCT

    CCTGCCCAGGCCGCTGAGCTGGTGGGTGAAGATTTGTCACGTAGA

    GTGGCAGAACTGGCTGTAAAACTGTACTCCAAGTGCAAAGATTATG

    CTAAGGAGAAGGGCATCATCATCGCAGACACTAAATTGTTTAAAC

    SEQ ID NO：6

    pAM495的ERG10-PGAL-ERG12插入物(5’至3’)

    GTTTAAACTATTGTGAGGGTCAGTTATTTCATCCAGATATAACCCG

    AGAGGAAACTTCTTAGCGTCTGTTTTCGTACCATAAGGCAGTTCAT

    GAGGTATATTTTCGTTATTGAAGCCCAGCTCGTGAATGCTTAATGC

    TGCTGAACTGGTGTCCATGTCGCCTAGGTACGCAATCTCCACAGGC

    TGCAAAGGTTTTGTCTCAAGAGCAATGTTATTGTGCACCCCGTAAT

    TGGTCAACAAGTTTAATCTGTGCTTGTCCACCAGCTCTGTCGTAAC

    CTTCAGTTCATCGACTATCTGAAGAAATTTACTAGGAATAGTGCCA

    TGGTACAGCAACCGAGAATGGCAATTTCTACTCGGGTTCAGCAACG

    CTGCATAAACGCTGTTGGTGCCGTAGACATATTCGAAGATAGGATT

    ATCATTCATAAGTTTCAGAGCAATGTCCTTATTCTGGAACTTGGATT

    TATGGCTCTTTTGGTTTAATTTCGCCTGATTCTTGATCTCCTTTAGC

    TTCTCGACGTGGGCCTTTTTCTTGCCATATGGATCCGCTGCACGGT

    CCTGTTCCCTAGCATGTACGTGAGCGTATTTCCTTTTAAACCACGA

    CGCTTTGTCTTCATTCAACGTTTCCCATTGTTTTTTTCTACTATTGC

    TTTGCTGTGGGAAAAACTTATCGAAAGATGACGACTTTTTCTTAAT

    TCTCGTTTTAAGAGCTTGGTGAGCGCTAGGAGTCACTGCCAGGTAT

    CGTTTGAACACGGCATTAGTCAGGGAAGTCATAACACAGTCCTTTC

    CCGCAATTTTCTTTTTCTATTACTCTTGGCCTCCTCTAGTACACTCT

    ATATTTTTTTATGCCTCGGTAATGATTTTCATTTTTTTTTTTTCCACC

    TAGCGGATGACTCTTTTTTTTTCTTAGCGATTGGCATTATCACATAA

    TGAATTATACATTATATAAAGTAATGTGATTTCTTCGAAGAATATAC

    TAAAGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGAC

    ATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCT

    CAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCC

    CCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCG

    CGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGA

    AACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCC

    TGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTT

    TCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCA

    CATCCGAACATAAACAACCATGGCAGAACCAGCCCAAAAAAAGCAA

    AAACAAACTGTTCAGGAGCGCAAGGCGTTTATCTCCCGTATCACTA

    ATGAAACTAAAATTCAAATCGCTATTTCGCTGAATGGTGGTTATAT

    TCAAATAAAAGATTCGATTCTTCCTGCAAAGAAGGATGACGATGTA

    GCTTCCCAAGCTACTCAGTCACAGGTCATCGATATTCACACAGGTG

    TTGGCTTTTTGGATCATATGATCCATGCGTTGGCAAAACACTCTGG

    TTGGTCTCTTATTGTTGAATGTATTGGTGACCTGCACATTGACGAT

    CACCATACTACCGAAGATTGCGGTATCGCATTAGGGCAAGCGTTCA

    AAGAAGCAATGGGTGCTGTCCGTGGTGTAAAAAGATTCGGTACTG

    GGTTCGCACCATTGGATGAGGCGCTATCACGTGCCGTAGTCGATTT

    ATCTAGTAGACCATTTGCTGTAATCGACCTTGGATTGAAGAGAGAG

    ATGATTGGTGATTTATCCACTGAAATGATTCCACACTTTTTGGAAA

    GTTTCGCGGAGGCGGCCAGAATTACTTTGCATGTTGATTGTCTGAG

    AGGTTTCAACGATCACCACAGAAGTGAGAGTGCGTTCAAGGCTTTG

    GCTGTTGCCATAAGAGAAGCTATTTCTAGCAATGGCACCAATGACG

    TTCCCTCAACCAAAGGTGTTTTGATGTGAAGTACTGACAATAAAAA

    GATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTG

    TAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTT

    CGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAA

    GTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGC

    TGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGATGGTCTGCTT

    AAATTTCATTCTGTCTTCGAAAGCTGAATTGATACTACGAAAAATTT

    TTTTTTGTTTCTCTTTCTATCTTTATTACATAAAACTTCATACACAGT

    TAAGATTAAAAACAACTAATAAATAATGCCTATCGCAAATTAGCTT

    ATGAAGTCCATGGTAAATTCGTGTTTCCTGGCAATAATAGATCGTC

    AATTTGTTGCTTTGTGGTAGTTTTATTTTCAAATAATTGGAATACTA

    GGGATTTGATTTTAAGATCTTTATTCAAATTTTTTGCGCTTAACAAA

    CAGCAGCCAGTCCCACCCAAGTCTGTTTCAAATGTCTCGTAACTAA

    AATCATCTTGCAATTTCTTTTTGAAACTGTCAATTTGCTCTTGAGTA

    ATGTCTCTTCGTAACAAAGTCAAAGAGCAACCGCCGCCACCAGCAC

    CGGTAAGTTTTGTGGAGCCAATTCTCAAATCATCGCTCAGATTTTT

    AATAAGTTCTAATCCAGGATGAGAAACACCGATTGAGACAAGCAGT

    CCATGATTTATTCTTATCAATTCCAATAGTTGTTCATACAGTTCATT

    ATTAGTTTCTACAGCCTCGTCATCGGTGCCTTTACATTTACTTAACT

    TAGTCATGATCTCTAAGCCTTGTAGGGCACATTCACCCATGGCATC

    TAGAATTGGCTTCATAACTTCAGGAAATTTCTCGGTGACCAACACA

    CGAACGCGAGCAACAAGATCTTTTGTAGACCTTGGAATTCTAGTAT

    AGGTTAGGATCATTGGAATGGCTGGGAAATCATCTAAGAACTTAAA

    ATTGTTTGTGTTTATTGTTCCATTATGTGAGTCTTTTTCAAATAGCA

    GGGCATTACCATAAGTGGCCACAGCGTTATCTATTCCTGAAGGGGT

    ACCGTGAATACACTTTTCACCTATGAAGGCCCATTGATTCACTATA

    TGCTTATCGTTTTCTGACAGCTTTTCCAAGTCATTAGATCCTATTAA

    CCCCCCCAAGTAGGCCATAGCTAAGGCCAGTGATACAGAAATAGA

    GGCGCTTGAGCCCAACCCAGCACCGATGGGTAAAGTAGACTTTAA

    AGAAAACTTAATATTCTTGGCATGGGGGCATAGGCAAACAAACATA

    TACAGGAAACAAAACGCTGCATGGTAGTGGAAGGATTCGGATAGT

    TGAGCTAACAACGGATCCAAAAGACTAACGAGTTCCTGAGACAAGC

    CATCGGTGGCTTGTTGAGCCTTGGCCAATTTTTGGGAGTTTACTTG

    ATCCTCGGTGATGGCATTGAAATCATTGATGGACCACTTATGATTA

    AAGCTAATGTCCGGGAAGTCCAATTCAATAGTATCTGGTGCAGATG

    ACTCGCTTATTAGCAGGTAGGTTCTCAACGCAGACACACTAGCAGC

    GACGGCAGGCTTGTTGTACACAGCAGAGTGTTCACCAAAAATAATA

    ACCTTTCCCGGTGCAGAAGTTAAGAACGGTAATGACATTATAGTTT

    TTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTT

    GATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATG

    TTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATAT

    CTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAG

    AAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAAT

    TTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATT

    TTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGT

    TCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGA

    CCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGG

    CTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAAT

    GAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTT

    AGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAA

    GATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGAT

    TATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGA

    AAATTCAATATAAATGTCTCAGAACGTTTACATTGTATCGACTGCC

    AGAACCCCAATTGGTTCATTCCAGGGTTCTCTATCCTCCAAGACAG

    CAGTGGAATTGGGTGCTGTTGCTTTAAAAGGCGCCTTGGCTAAGGT

    TCCAGAATTGGATGCATCCAAGGATTTTGACGAAATTATTTTTGGT

    AACGTTCTTTCTGCCAATTTGGGCCAAGCTCCGGCCAGACAAGTTG

    CTTTGGCTGCCGGTTTGAGTAATCATATCGTTGCAAGCACAGTTAA

    CAAGGTCTGTGCATCCGCTATGAAGGCAATCATTTTGGGTGCTCAA

    TCCATCAAATGTGGTAATGCTGATGTTGTCGTAGCTGGTGGTTGTG

    AATCTATGACTAACGCACCATACTACATGCCAGCAGCCCGTGCGGG

    TGCCAAATTTGGCCAAACTGTTCTTGTTGATGGTGTCGAAAGAGAT

    GGGTTGAACGATGCGTACGATGGTCTAGCCATGGGTGTACACGCA

    GAAAAGTGTGCCCGTGATTGGGATATTACTAGAGAACAACAAGACA

    ATTTTGCCATCGAATCCTACCAAAAATCTCAAAAATCTCAAAAGGA

    AGGTAAATTCGACAATGAAATTGTACCTGTTACCATTAAGGGATTT

    AGAGGTAAGCCTGATACTCAAGTCACGAAGGACGAGGAACCTGCT

    AGATTACACGTTGAAAAATTGAGATCTGCAAGGACTGTTTTCCAAA

    AAGAAAACGGTACTGTTACTGCCGCTAACGCTTCTCCAATCAACGA

    TGGTGCTGCAGCCGTCATCTTGGTTTCCGAAAAAGTTTTGAAGGAA

    AAGAATTTGAAGCCTTTGGCTATTATCAAAGGTTGGGGTGAGGCCG

    CTCATCAACCAGCTGATTTTACATGGGCTCCATCTCTTGCAGTTCC

    AAAGGCTTTGAAACATGCTGGCATCGAAGACATCAATTCTGTTGAT

    TACTTTGAATTCAATGAAGCCTTTTCGGTTGTCGGTTTGGTGAACA

    CTAAGATTTTGAAGCTAGACCCATCTAAGGTTAATGTATATGGTGG

    TGCTGTTGCTCTAGGTCACCCATTGGGTTGTTCTGGTGCTAGAGTG

    GTTGTTACACTGCTATCCATCTTACAGCAAGAAGGAGGTAAGATCG

    GTGTTGCCGCCATTTGTAATGGTGGTGGTGGTGCTTCCTCTATTGT

    CATTGAAAAGATATGATTACGTTCTGCGATTTTCTCATGATCTTTTT

    CATAAAATACATAAATATATAAATGGCTTTATGTATAACAGGCATA

    ATTTAAAGTTTTATTTGCGATTCATCGTTTTTCAGGTACTCAAACGC

    TGAGGTGTGCCTTTTGACTTACTTTTCCCGGGAGAGGCTAGCAGAA

    TTACCCTCCACGTTGATTGTCTGCGAGGCAAGAATGATCATCACCG

    TAGTGAGAGTGCGTTCAAGGCTCTTGCGGTTGCCATAAGAGAAGC

    CACCTCGCCCAATGGTACCAACGATGTTCCCTCCACCAAAGGTGTT

    CTTATGTAGTGACACCGATTATTTAAAGCTGCAGCATACGATATAT

    ATACATGTGTATATATGTATACCTATGAATGTCAGTAAGTATGTATA

    CGAACAGTATGATACTGAAGATGACAAGGTAATGCATCATTCTATA

    CGTGTCATTCTGAACGAGGCGCGCTTTCCTTTTTTCTTTTTGCTTTT

    TCTTTTTTTTTCTCTTGAACTCGAGAAAAAAAATATAAAAGAGATGG

    AGGAACGGGAAAAAGTTAGTTGTGGTGATAGGTGGCAAGTGGTAT

    TCCGTAAGAACAACAAGAAAAGCATTTCATATTATGGCTGAACTGA

    GCGAACAAGTGCAAAATTTAAGCATCAACGACAACAACGAGAATG

    GTTATGTTCCTCCTCACTTAAGAGGAAAACCAAGAAGTGCCAGAAA

    TAACAGTAGCAACTACAATAACAACAACGGCGGCGTTTAAAC

    SEQ ID NO：7

    pAM497的ERG8-PGAL-ERG19插入物(5’至3’)

    GTTTAAACTTTTCCAATAGGTGGTTAGCAATCGTCTTACTTTCTAAC

    TTTTCTTACCTTTTACATTTCAGCAATATATATATATATATTTCAAG

    GATATACCATTCTAATGTCTGCCCCTAAGAAGATCGTCGTTTTGCC

    AGGTGACCACGTTGGTCAAGAAATCACAGCCGAAGCCATTAAGGTT

    CTTAAAGCTATTTCTGATGTTCGTTCCAATGTCAAGTTCGATTTCGA

    AAATCATTTAATTGGTGGTGCTGCTATCGATGCTACAGGTGTTCCA

    CTTCCAGATGAGGCGCTGGAAGCCTCCAAGAAGGCTGATGCCGTT

    TTGTTAGGTGCTGTGGGTGGTCCTAAATGGGGTACCGGTAGTGTTA

    GACCTGAACAAGGTTTACTAAAAATCCGTAAAGAACTTCAATTGTA

    CGCCAACTTAAGACCATGTAACTTTGCATCCGACTCTCTTTTAGAC

    TTATCTCCAATCAAGCCACAATTTGCTAAAGGTACTGACTTCGTTG

    TTGTCAGAGAATTAGTGGGAGGTATTTACTTTGGTAAGAGAAAGGA

    AGACGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGA

    CATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGC

    TCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATC

    CCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGC

    GCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGG

    AAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCC

    CTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCT

    TTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATC

    ACATCCGAACATAAACAACCATGGCAGAACCAGCCCAAAAAAAGCA

    AAAACAAACTGTTCAGGAGCGCAAGGCGTTTATCTCCCGTATCACT

    AATGAAACTAAAATTCAAATCGCTATTTCGCTGAATGGTGGTTATA

    TTCAAATAAAAGATTCGATTCTTCCTGCAAAGAAGGATGACGATGT

    AGCTTCCCAAGCTACTCAGTCACAGGTCATCGATATTCACACAGGT

    GTTGGCTTTTTGGATCATATGATCCATGCGTTGGCAAAACACTCTG

    GTTGGTCTCTTATTGTTGAATGTATTGGTGACCTGCACATTGACGA

    TCACCATACTACCGAAGATTGCGGTATCGCATTAGGGCAAGCGTTC

    AAAGAAGCAATGGGTGCTGTCCGTGGTGTAAAAAGATTCGGTACT

    GGGTTCGCACCATTGGATGAGGCGCTATCACGTGCCGTAGTCGATT

    TATCTAGTAGACCATTTGCTGTAATCGACCTTGGATTGAAGAGAGA

    GATGATTGGTGATTTATCCACTGAAATGATTCCACACTTTTTGGAA

    AGTTTCGCGGAGGCGGCCAGAATTACTTTGCATGTTGATTGTCTGA

    GAGGTTTCAACGATCACCACAGAAGTGAGAGTGCGTTCAAGGCTTT

    GGCTGTTGCCATAAGAGAAGCTATTTCTAGCAATGGCACCAATGAC

    GTTCCCTCAACCAAAGGTGTTTTGATGTGAAGTACTGACAATAAAA

    AGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATT

    GTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTT

    TCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAA

    GTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGC

    TGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGTTTCTCATTCA

    AGTGGTAACTGCTGTTAAAATTAAGATATTTATAAATTGAAGCTTG

    GTCGTTCCGACCAATACCGTAGGGAAACGTAAATTAGCTATTGTAA

    AAAAAGGAAAAGAAAAGAAAAGAAAAATGTTACATATCGAATTGAT

    CTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCTTTGCGTCAATCAAAGATTCGTTT

    GTTTCTTGTGGGCCTGAACCGACTTGAGTTAAAATCACTCTGGCAA

    CATCCTTTTGCAACTCAAGATCCAATTCACGTGCAGTAAAGTTAGA

    TGATTCAAATTGATGGTTGAAAGCCTCAAGCTGCTCAGTAGTAAAT

    TTCTTGTCCCATCCAGGAACAGAGCCAAACAATTTATAGATAAATG

    CAAAGAGTTTCGACTCATTTTCAGCTAAGTAGTACAACACAGCATT

    TGGACCTGCATCAAACGTGTATGCAACGATTGTTTCTCCGTAAAAC

    TGATTAATGGTGTGGCACCAACTGATGATACGCTTGGAAGTGTCAT

    TCATGTAGAATATTGGAGGGAAAGAGTCCAAACATGTGGCATGGA

    AAGAGTTGGAATCCATCATTGTTTCCTTTGCAAAGGTGGCGAAATC

    TTTTTCAACAATGGCTTTACGCATGACTTCAAATCTCTTTGGTACGA

    CATGTTCAATTCTTTCTTTAAATAGTTCGGAGGTTGCCACGGTCAA

    TTGCATACCCTGAGTGGAACTCACATCCTTTTTAATATCGCTGACA

    ACTAGGACACAAGCTTTCATCTGAGGCCAGTCAGAGCTGTCTGCGA

    TTTGTACTGCCATGGAATCATGACCATCTTCAGCTTTTCCCATTTCC

    CAGGCCACGTATCCGCCAAACAACGATCTACAAGCTGAACCAGACC

    CCTTTCTTGCTATTCTAGATATTTCTGAAGTTGACTGTGGTAATTGG

    TATAACTTAGCAATTGCAGAGACCAATGCAGCAAAGCCAGCAGCG

    GAGGAAGCTAAACCAGCTGCTGTAGGAAAGTTATTTTCGGAGACAA

    TGTGGAGTTTCCATTGAGATAATGTGGGCAATGAGGCGTCCTTCGA

    TTCCATTTCCTTTCTTAATTGGCGTAGGTCGCGCAGACAATTTTGA

    GTTCTTTCATTGTCGATGCTGTGTGGTTCTCCATTTAACCACAAAGT

    GTCGCGTTCAAACTCAGGTGCAGTAGCCGCAGAGGTCAACGTTCT

    GAGGTCATCTTGCGATAAAGTCACTGATATGGACGAATTGGTGGGC

    AGATTCAACTTCGTGTCCCTTTTCCCCCAATACTTAAGGGTTGCGA

    TGTTGACGGGTGCGGTAACGGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGT

    TTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTG

    TTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAA

    TGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATAT

    ATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCA

    GAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTA

    ATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAA

    TTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATT

    GTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGC

    GACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAG

    GGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCA

    ATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTT

    TTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGT

    AAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATG

    ATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTT

    GAAAATTCAATATAAATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGTGCCCCAG

    GGAAAGCGTTACTAGCTGGTGGATATTTAGTTTTAGATCCGAAATA

    TGAAGCATTTGTAGTCGGATTATCGGCAAGAATGCATGCTGTAGCC

    CATCCTTACGGTTCATTGCAAGAGTCTGATAAGTTTGAAGTGCGTG

    TGAAAAGTAAACAATTTAAAGATGGGGAGTGGCTGTACCATATAAG

    TCCTAAAACTGGCTTCATTCCTGTTTCGATAGGCGGATCTAAGAAC

    CCTTTCATTGAAAAAGTTATCGCTAACGTATTTAGCTACTTTAAGCC

    TAACATGGACGACTACTGCAATAGAAACTTGTTCGTTATTGATATT

    TTCTCTGATGATGCCTACCATTCTCAGGAGGACAGCGTTACCGAAC

    ATCGTGGCAACAGAAGATTGAGTTTTCATTCGCACAGAATTGAAGA

    AGTTCCCAAAACAGGGCTGGGCTCCTCGGCAGGTTTAGTCACAGTT

    TTAACTACAGCTTTGGCCTCCTTTTTTGTATCGGACCTGGAAAATA

    ATGTAGACAAATATAGAGAAGTTATTCATAATTTATCACAAGTTGC

    TCATTGTCAAGCTCAGGGTAAAATTGGAAGCGGGTTTGATGTAGCG

    GCGGCAGCATATGGATCTATCAGATATAGAAGATTCCCACCCGCAT

    TAATCTCTAATTTGCCAGATATTGGAAGTGCTACTTACGGCAGTAA

    ACTGGCGCATTTGGTTAATGAAGAAGACTGGAATATAACGATTAAA

    AGTAACCATTTACCTTCGGGATTAACTTTATGGATGGGCGATATTA

    AGAATGGTTCAGAAACAGTAAAACTGGTCCAGAAGGTAAAAAATTG

    GTATGATTCGCATATGCCGGAAAGCTTGAAAATATATACAGAACTC

    GATCATGCAAATTCTAGATTTATGGATGGACTATCTAAACTAGATC

    GCTTACACGAGACTCATGACGATTACAGCGATCAGATATTTGAGTC

    TCTTGAGAGGAATGACTGTACCTGTCAAAAGTATCCTGAGATCACA

    GAAGTTAGAGATGCAGTTGCCACAATTAGACGTTCCTTTAGAAAAA

    TAACTAAAGAATCTGGTGCCGATATCGAACCTCCCGTACAAACTAG

    CTTATTGGATGATTGCCAGACCTTAAAAGGAGTTCTTACTTGCTTA

    ATACCTGGTGCTGGTGGTTATGACGCCATTGCAGTGATTGCTAAGC

    AAGATGTTGATCTTAGGGCTCAAACCGCTGATGACAAAAGATTTTC

    TAAGGTTCAATGGCTGGATGTAACTCAGGCTGACTGGGGTGTTAG

    GAAAGAAAAAGATCCGGAAACTTATCTTGATAAATAACTTAAGGTA

    GATAATAGTGGTCCATGTGACATCTTTATAAATGTGAAGTTTGAAG

    TGACCGCGCTTAACATCTAACCATTCATCTTCCGATAGTACTTGAA

    ATTGTTCCTTTCGGCGGCATGATAAAATTCTTTTAATGGGTACAAG

    CTACCCGGGCCCGGGAAAGATTCTCTTTTTTTATGATATTTGTACA

    TAAACTTTATAAATGAAATTCATAATAGAAACGACACGAAATTACA

    AAATGGAATATGTTCATAGGGTAGACGAAACTATATACGCAATCTA

    CATACATTTATCAAGAAGGAGAAAAAGGAGGATGTAAAGGAATACA

    GGTAAGCAAATTGATACTAATGGCTCAACGTGATAAGGAAAAAGAA

    TTGCACTTTAACATTAATATTGACAAGGAGGAGGGCACCACACAAA

    AAGTTAGGTGTAACAGAAAATCATGAA ACTATGATTCCTAATTTAT

    ATATTGGAGGATTTTCTCTAAAAAAAAAAAAATACAACAAATAAAA

    AACACTCAATGACCTGACCATTTGATGGAGTTTAAGTCAATACCTT

    CTTGAACCATTTCCCATAATGGTGAAAGTTCCCTCAAGAATTTTACT

    CTGTCAGAAACGGCCTTAACGACGTAGTCGACCTCCTCTTCAGTAC

    TAAATCTACCAATACCAAATCTGATGGAAGAATGGGCTAATGCATC

    ATCCTTACCCAGCGCATGTAAAACATAAGAAGGTTCTAGGGAAGCA

    GATGTACAGGCTGAACCCGAGGATAATGCGATATCCCTTAGTGCCA

    TCAATAAAGATTCTCCTTCCACGTAGGCGAAAGAAACGTTAACACG

    TTTAAAC

    SEQ ID NO：8

    火炬松α-蒎烯合成酶，针对大肠杆菌中的表达进行密码子优化，且其侧翼连接XmaI和XbaI酶切位点(5’至3’)

    GGAATTCCCGGGCGAGCTCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTAT

    AATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTGAATTCAAAGGAGGAA

    AATAAAATGGATGATGATTCTATTGCATCTCTGAGCACGTCCTATG

    AAGCTCCTAGCTACCGCAAGCGTGCGGATAAACTGATTGGCGAAG

    TGAAAAATATCTTTGATCTGATGTCTGTGGAGGATGGTGTTTTCAC

    TAGCCCGCTGAGCGACCTGCACCATCGCCTGTGGATGGTTGACTCT

    GTTGAACGCCTGGGCATCGACCGTCACTTTAAGGACGAGATCAACA

    GCGCTCTGGATCATGTGTACTCTTACTGGACCGAAAAGGGTATCGG

    CCGTGGCCGTGAATCTGGTGTAACCGATCTGAACAGCACCGCACT

    GGGCCTGCGTACCCTGCGCCTGCACGGTTATACCGTATCTAGCCAT

    GTCCTGGATCACTTCAAGAACGAAAAAGGTCAGTTCACTTGTTCCG

    CGATCCAGACCGAAGGCGAAATTCGTGACGTTCTGAACCTGTTCCG

    TGCGTCCCTGATCGCGTTTCCGGGTGAAAAGATCATGGAAGCGGC

    CGAAATCTTCTCCACCATGTACCTGAAAGACGCTCTGCAGAAAATT

    CCGCCGTCCGGTCTGAGCCAGGAAATTGAATATCTGCTGGAGTTCG

    GCTGGCACACCAACCTGCCGCGTATGGAAACCCGCATGTATATCGA

    CGTCTTTGGCGAAGACACCACCTTCGAAACCCCGTACCTGATCCGT

    GAAAAACTGCTGGAACTGGCGAAACTGGAATTTAACATCTTTCATT

    CCCTGGTGAAACGTGAACTGCAGTCCCTGTCCCGCTGGTGGAAGG

    ACTACGGTTTCCCTGAAATCACCTTCTCTCGTCACCGTCACGTAGA

    ATACTACACCCTGGCTGCCTGTATCGCTAATGACCCGAAACACAGC

    GCTTTTCGTCTGGGCTTCGGTAAAATCTCTCACATGATTACCATCC

    TGGATGACATTTATGACACCTTCGGCACCATGGAAGAGCTGAAACT

    GCTGACCGCAGCTTTCAAACGTTGGGACCCGAGCTCCATTGAGTGT

    CTGCCAGACTATATGAAGGGTGTTTATATGGCAGTTTACGATAACA

    TTAACGAGATGGCGCGTGAAGCGCAGAAGATCCAGGGTTGGGACA

    CGGTTTCCTATGCGCGCAAGTCTTGGGAAGCTTTTATCGGCGCGTA

    CATTCAGGAGGCTAAATGGATTTCTTCCGGCTACCTGCCGACCTTC

    GACGAATACCTGGAGAACGGTAAAGTCTCCTTCGGCTCCCGTATCA

    CTACCCTGGAACCGATGCTGACTCTGGGTTTTCCGCTGCCGCCTCG

    TATTCTGCAGGAAATCGACTTCCCGTCTAAATTCAACGACCTGATC

    TGTGCAATCCTGCGTCTGAAAGGCGATACTCAGTGCTATAAAGCGG

    ACCGTGCACGCGGTGAAGAAGCCTCTGCGGTTTCCTGTTATATGAA

    AGACCATCCGGGTATTACCGAAGAAGATGCCGTAAACCAGGTGAA

    CGCGATGGTGGATAATCTGACCAAAGAACTGAACTGGGAACTGCT

    GCGTCCGGATTCCGGCGTCCCGATCAGCTATAAAAAGGTGGCGTT

    CGATATTTGCCGCGTTTTCCACTACGGTTACAAATATCGCGATGGT

    TTCTCCGTGGCATCTATCGAAATCAAAAACCTGGTGACTCGTACCG

    TCGTGGAAACGGTGCCGCTGTGATAGTAATCTAGAGGAATTT

    SEQ ID NO：9

    pAM328的KanMX-PMET3区(5’至3’)

    GAATTCGCCCTTNTGGATGGCGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAG

    TATAGCGACCAGCATTCACATACGATTGACGCATGATATTACTTTC

    TGCGCACTTAACTTCGCATCTGGGCAGATGATGTCGAGGCGAAAAA

    AAATATAAATCACGCTAACATTTGATTAAAATAGAACAACTACAAT

    ATAAAAAAACTATACAAATGACAAGTTCTTGAAAACAAGAATCTTT

    TTATTGTCAGTACTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAA

    CTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAA

    GCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAG

    GATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACA

    TCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAG

    TGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAA

    AAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTA

    CGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTC

    GTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAG

    GACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTG

    CCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAAT

    ACCTGGAATGCTGTTTTGCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCAT

    GCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGC

    ATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACAT

    CATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGC

    ATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCG

    ACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGT

    TGGAATTTAATCGCGGCCTCGAAACGTGAGTCTTTTCCTTACCCAT

    GGTTGTTTATGTTCGGATGTGATGTGAGAACTGTATCCTAGCAAGA

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    GAATTC

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    TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGTCATTACCGTTCTTAACTT

    CTGCA

    SEQ ID NO：77

    引物61-67-CPK060-G(5’至3’)

    AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGT

    G

    SEQ ID NO：78

    引物61-67-CPK061-G(5’至3’)

    CACTGAAGGCTCTCAACTCTGACATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

    SEQ ID NO：79

    引物61-67-CPK062-G(5’至3’)

    GGTAACGGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGTTTTTTCTCCTTGA

    CGTTA

    SEQ ID NO：80

    引物61-67-CPK063-G(5’至3’)

    TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGACCGTTTACACAGCATCCG

    TTACC

    SEQ ID NO：81

    引物61-67-CPK064-G(5’至3’)

    AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATG

    C

    SEQ ID NO：82

    引物61-67-CPK065-G(5’至3’)

    GCATACTATTGTTGTCGGCAGTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

    SEQ ID NO：83

    引物61-67-CPK066-G(5’至3’)

    GGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAA

    CAATCACAGGAAACAGCTATGACC

    SEQ ID NO：84

    引物61-67-CPK067-G(5’至3’)

    TTGCGTTTTGTACTTTGGTTCGCTCAATTTTGCAGGTAGATAATCG

    AAAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT

    SEQ ID NO：85

    引物50-56-pw100-G(5’至3’)

    GAGTGAACCTGCTGCCTGGCGTGCTCTGACTCAGTACATTTCATAG

    TGGATGGCGGCGTTAGTATC

    SEQ ID NO：86

    引物50-56-pw101-G(5’至3’)

    CGTGTATACGTTTTCCGCTTCTGCTCTTCGTCTTTTCTCTTCTTCCG

    ATATCACAACTGTTACGA

    SEQ ID NO：87

    引物PW-91-079-CPK373-G(5’至3’)

    TCGACTACGTCGTAAGGCCGT

    SEQ ID NO：88

    引物PW-91-079-CPK374-G(5’至3’)

    GCATCTGTGCGGTATTTCACTATATATATTTCAAGGATATAC

    SEQ ID NO：89

    引物PW-91-079-CPK376-G(5’至3’)

    TATGGTGCACTCTCAGTACAATCTG

    SEQ ID NO：90

    引物PW-91-079-CPK375-G(5’至3’)

    GTATATCCTTGAAATATATATAGTGAAATACCGCACAGATGC