一种人脐带间充质干细胞库的构建方法.pdf

本发明公开了一种利用新生儿脐带为资源的脐带间充质干细胞库的构建方法，目的在于构建脐带间充质干细胞库时步骤更少、操作更加简单、容易。本发明由下述步骤组成：(1)取人脐带进行检测，用缓冲液冲洗去除残留血液，剪碎，获得人脐带组织；(2)加入胶原酶消化；(3)加入缓冲液稀释消化后组织，混匀、离心；(4)弃上清，加入缓冲液重悬沉淀，过筛，收集滤液，离心，重复两次，即得人脐带间充质干细胞；(5)将获得的人脐带间充质干细胞置液氮保存，按其ABO/Rh分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脐带间充质干细胞库。与现有方法相比，本发明方法更快捷、更方便、对细胞损伤更小。

1.  一种人脐带间充质干细胞库的构建方法，由下述步骤组成：
(1)取人脐带进行ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、微生物免疫检测、用缓冲液冲洗去除残留血液，剪碎，获得人脐带组织；
(2)向步骤(1)所获得人脐带组织中加入1-3倍体积的0.05％-0.2％胶原酶消化，获得消化后组织；
(3)加入缓冲液稀释步骤(2)消化后组织，混匀、离心，离心力为600g，时间为15分钟；
(4)弃上清，加入缓冲液重悬步骤(3)沉淀，过200目筛网，收集滤液，离心，离心力为450g，时间为10分钟，重复两次，即获得人脐带间充质干细胞；
(5)将步骤(4)获得的人脐带间充质干细胞置液氮保存，按其ABO/Rh分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脐带间充质干细胞库。

2.  根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(4)与步骤(5)之间加入如下步骤：将步骤(4)得到的人脐带间充质干细胞按2×10⁴/cm²接种于塑料培养皿，用含10％FBS的LG-DMEM培养基，置37℃、5％CO₂培养箱培养，2天后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3天后换液，待细胞80％汇合，0.25％胰酶消化，按1∶3传代，扩增后得到大量间充质干细胞。

3.  根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸缓冲液。

4.  根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液pH值为7.2-7.4。

5.  根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述胶原酶消化温度为37℃，消化时间为1-3h。

6.  根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述胶原酶消化的同时，通过用转子进行搅拌来提高消化程度。

7.  根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述扩增后得到大量间充质干细胞，用冷冻保护剂预处理，分装放入冻存管。

8.  根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述冷冻保护剂由10％DMSO、10％右旋糖苷和80％LG-DMEM组成。

一种人脐带间充质干细胞库的构建方法
技术领域
本发明涉及一种干细胞库的构建方法，具体说是涉及一种人脐带间充质干细胞库的构建方法。
技术背景
在人骨髓中除了存在人造血干细胞外，还有一类具有干细胞特征的细胞群体，被称为人间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。人间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，在不同诱导条件下可分化为三胚层细胞，如骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经细胞等。此外，MSCs还表达IL6、G-CSF和SCF等多种造血细胞生长所需要的因子，能够维持长期培养的造血祖细胞增殖，显示MSC具有支持造血和促进造血恢复的作用。同时研究表明MSC具有免疫调节作用，在体外能够抑制T淋巴细胞增殖，体内动物实验发现MSCs移植可以抑制异体免疫反应，减轻移植相关的排斥反应，并延长异体移植物的存活时间。最近的临床试验发现MSCs联合造血干细胞移植可以减轻GVHD并降低移植失败率。MSC的多向分化能力和免疫调节能力决定了其在细胞治疗、组织工程等领域具有广阔的应用前景。
目前MSC的来源主要为成人骨髓。然而研究同时发现，人骨髓中MSCs含量极低，大约10⁴-10⁵个单个核细胞中才含有1个MSC，并且随着外科手术技术水平的提高，大创伤性手术越来越少，骨髓MSC来源越来越困难；另外，骨髓MSCs进行移植中可能存在的免疫排斥反应以及伦理道德将阻碍MSCs作为组织工程种子细胞的临床应用，因此，寻找新的MSCs来源成为目前国内外研究的热点。人脐带由于细胞原始、来源广泛、移植不涉及社会、伦理、法律等方面的争论，成为极好的MSC组织来源，本研究拟从人脐带中分离培养MSCs，拓展MSCs新来源。
干细胞库是在-196℃液氮中储存干细胞或者相关资源的场所。目前干细胞库主要分为中华骨髓库和脐带血造血干细胞库。中华骨髓库主要开展造血干细胞捐献和移植治疗工作，负责造血干细胞捐献者资料库总体规划的制定和实施，开展志愿捐献者的宣传、组织、动员、HLA(白细胞抗原)分型，为患者检索配型相合的捐献者及移植相关服务等。脐带血造血干细胞库主要以人体造血干细胞移植为目的将新生儿脐带血采集后分离冷冻储存的干细胞库。目前国际通行的保存脐血干细胞的模式分为公共库和自体库两种模式。公共库的干细胞主要面向需要进行移植但自体干细胞没有被保存的病人；自体库则是在出生或健康时，将干细胞采集一部分予以保存，在自己或亲属生病时用来治病。但是，对于随同脐带血一同产生的脐带组织则被丢弃，其中包含的脐带间充质干细胞这不可复得的重要资源则白白丢失。
发明内容
本发明的目的在于提供一种步骤更少、操作更加简单、容易的方法来构建利用新生儿脐带为资源的脐带间充质干细胞库。
本发明的技术方案概述如下：
一种充分利用新生儿脐带为资源的脐带间充质干细胞库的构建方法，由下述步骤组成：
(1)取人脐带进行ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、微生物免疫检测、用缓冲液冲洗去除残留血液，剪碎，获得人脐带组织；
(2)向步骤(1)所获得人脐带组织中加入1-3倍体积的0.05％-0.2％胶原酶消化，获得消化后组织；
(3)加入缓冲液稀释步骤(2)消化后组织，混匀、离心，离心力为600g，时间为15分钟；
(4)弃上清，加入缓冲液重悬步骤(3)沉淀，过200目筛网，收集滤液，离心，离心力为450g，时间为10分钟，重复两次，即获得人脐带间充质干细胞；
(5)将步骤(4)获得的人脐带间充质干细胞置液氮保存，按其ABO/Rh分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脐带间充质干细胞库。
上述步骤(4)所获得人脐带间充质干细胞按2×10⁴/cm²接种塑料培养皿，用含10％FBS(Gibco，BRL，USA)的LG-DMEM(Gibco，USA)培养基置37℃、5％CO₂培养箱培养，2d后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3d换液，待细胞80％汇合，0.25％胰酶(Sigma，USA)消化，按1∶3传代，可得到大量(1×10¹⁰)人脐带间充质干细胞用于科学研究和临床治疗。
优选地，所述缓冲液为磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液pH值为7.2-7.4。
优选地，所述胶原酶消化温度为37℃，消化时间为1-3h。
进一步地，所述胶原酶消化的同时，通过用转子进行搅拌来提高消化程度。
进一步地，所述扩增后得到大量间充质干细胞，用冷冻保护剂预处理，分装放入冻存管；所述冷冻保护剂由10％DMSO、10％右旋糖苷和80％LG-DMEM组成。
上述全部过程均在无菌环境中进行操作。
本发明所述的一种新的人脐带间充质干细胞库的构建方法，与现有建库方法相比，构建方法更快捷、更方便、对细胞损伤更小。根据本发明方法，储存于库内的间充质干细胞，经短期培养可获得大量富有活性的MSC，并且能够长时间保存而不失活性，操作简单易行，建库成本低廉，富有应用前景。
附图说明
图1、人脐带来源的MSC细胞形态观察：(A)采用本发明方法获得的MSC原代培养第1d细胞形态，细胞成短梭形；(B)MSC原代培养第5d细胞形态，细胞成梭形；(C)P1代MSC培养5d细胞形态，细胞成梭形；(D)P3代MSC培养5d细胞形态，细胞成梭形；(E)P6代MSC培养5d细胞形态，细胞成梭形；(F)P9代MSC培养5d细胞形态，细胞成梭形。
图2、人脐带间充质干细胞P3代细胞表面标志性抗原检测：取P3代MSC消化，收集细胞，流式检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD106、CD152、CD166、CD271。
具体实施方式
下面结合附图和具体实例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于下述实施例。
实施例1：
人脐带间充质干细胞库的构建：
(1)将人脐带经过严格检测程序(ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等)确认安全性后，由缓冲液反复冲洗，去除残留血液，用无菌刀具将其切割至约1mm³-1.5mm³小碎块；
(2)取小碎块10ml，置于50ml离心管中，加入0.05％的胶原酶10ml，置37℃消化1h获得消化后混合物；
(3)往消化后混合物中加入磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)至充满50ml离心管，混匀，600g离心15min；
(4)弃上清，加入20ml磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)，重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，450g离心10min，重复两次，即制备出建库所需人脐带间充质干细胞。
(5)干细胞入库前，按2×10⁴/cm²接种于塑料培养皿，用含10％FBS(Gibco BRL，USA)的LG-DMEM(Gibco，USA)培养基，置37℃、5％CO₂培养箱培养，2d后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3d后换液，待细胞80％汇合，0.25％胰酶(Sigma，USA)消化，按1∶3传代，扩增后得到大量间充质干细胞，将所获得细胞用10％DMSO、10％右旋糖苷和80％LG-DMEM冷冻保护剂预处理，分装放入2ml冻存管，-196℃液氮保存。留取小部分细胞储存在-80℃冰箱，作为库存产品的复查样品。将其详细信息(供者姓名、供者父母姓名、地址、联系方式、干细胞的配型信息等)输入电脑数据库，建立完善的数据档案。
实施例2：
人脐带间充质干细胞库的构建：
(1)将人脐带经过严格检测程序(ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等)确认安全性后，由缓冲液反复冲洗，去除残留血液，用无菌刀具将其切割至约1mm³-1.5mm³小碎块；
(2)取小碎块10ml，置于50ml离心管中，加入0.1％的胶原酶20ml，置37℃消化2h获得消化后混合物；
(3)往消化后混合物中加入磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)至充满50ml离心管，混匀，600g离心15min；
(4)弃上清，加入20ml磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)，重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，450g离心10min，重复两次，即制备出建库所需人脐带间充质干细胞。
(5)干细胞入库前，按2×10⁴/cm²接种于塑料培养皿，用含10％FBS(Gibco BRL，USA)的LG-DMEM(Gibco，USA)培养基，置37℃、5％CO₂培养箱培养，2d后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3d后换液，待细胞80％汇合，0.25％胰酶(Sigma，USA)消化，按1∶3传代，扩增后得到大量间充质干细胞，将所获得细胞用10％DMSO、10％右旋糖苷和80％LG-DMEM冷冻保护剂预处理，分装放入2ml冻存管，-196℃液氮保存。留取小部分细胞储存在-80℃冰箱，作为库存产品的复查样品。将其详细信息(供者姓名、供者父母姓名、地址、联系方式、干细胞的配型信息等)输入电脑数据库，建立完善的数据档案。
实施例3：
人脐带间充质干细胞库的构建：
(1)将人脐带经过严格检测程序(ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等)确认安全性后，由缓冲液反复冲洗，去除残留血液，用无菌刀具将其切割至约1mm³-1.5mm³小碎块；
(2)取小碎块10ml，置于50ml离心管中，加入0.2％的胶原酶30ml，置37℃消化3h获得消化后混合物；
(3)往消化后混合物中加入磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)至充满50ml离心管，混匀，600g离心15min；
(4)弃上清，加入20ml磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)，重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，450g离心10min，重复两次，即制备出建库所需人脐带间充质干细胞。
(5)干细胞入库前，按2×10⁴/cm²接种于塑料培养皿，用含10％FBS(Gibco BRL，USA)的LG-DMEM(Gibco，USA)培养基，置37℃、5％CO₂培养箱培养，2d后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3d后换液，待细胞80％汇合，0.25％胰酶(Sigma，USA)消化，按1∶3传代，扩增后得到大量间充质干细胞，将所获得细胞用10％DMSO、10％右旋糖苷和80％LG-DMEM冷冻保护剂预处理，分装放入2ml冻存管，-196℃液氮保存。留取小部分细胞储存在-80℃冰箱，作为库存产品的复查样品。将其详细信息(供者姓名、供者父母姓名、地址、联系方式、干细胞的配型信息等)输入电脑数据库，建立完善的数据档案。
实施例4：
人脐带间充质干细胞库的构建：
(1)将人脐带经过严格检测程序(ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等)确认安全性后，由缓冲液反复冲洗，去除残留血液，用无菌刀具将其切割至约1mm³-1.5mm³小碎块；
(2)取小碎块10ml，置于50ml离心管中，加入0.05％的胶原酶30ml，置37℃消化3h获得消化后混合物；
(3)往消化后混合物中加入磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)至充满50ml离心管，混匀，600g离心15min；
(4)弃上清，加入20ml磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)，重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，450g离心10min，重复两次，即制备出建库所需人脐带间充质干细胞。
(5)干细胞入库前，按2×10⁴/cm²接种于塑料培养皿，用含10％FBS(Gibco BRL，USA)的LG-DMEM(Gibco，USA)培养基，置37℃、5％CO₂培养箱培养，2d后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3d后换液，待细胞80％汇合，0.25％胰酶(Sigma，USA)消化，按1∶3传代，扩增后得到大量间充质干细胞，将所获得细胞用10％DMSO、10％右旋糖苷冷冻保护剂和80％LG-DMEM预处理，分装放入2ml冻存管，-196℃液氮保存。留取小部分细胞储存在-80℃冰箱，作为库存产品的复查样品。将其详细信息(供者姓名、供者父母姓名、地址、联系方式、干细胞的配型信息等)输入电脑数据库，建立完善的数据档案。
实施例5：
人脐带间充质干细胞库的构建：
(1)将人脐带经过严格检测程序(ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等)确认安全性后，由缓冲液反复冲洗，去除残留血液，用无菌刀具将其切割至约1mm³-1.5mm³小碎块；
(2)取小碎块10ml，置于50ml离心管中，加入0.2％的胶原酶10ml，置37℃消化1h获得消化后混合物；
(3)往消化后混合物中加入磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)至充满50ml离心管，混匀，600g离心15min；
(4)弃上清，加入20ml磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)，重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，450g离心10min，重复两次，即制备出建库所需人脐带间充质干细胞。
(5)干细胞入库前，按2×10⁴/cm²接种于塑料培养皿，用含10％FBS(Gibco BRL，USA)的LG-DMEM(Gibco，USA)培养基，置37℃、5％CO₂培养箱培养，2d后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3d后换液，待细胞80％汇合，0.25％胰酶(Sigma，USA)消化，按1∶3传代，扩增后得到大量间充质干细胞，将所获得细胞用10％DMSO、10％右旋糖苷和80％LG-DMEM冷冻保护剂预处理，分装放入2ml冻存管，-196℃液氮保存。留取小部分细胞储存在-80℃冰箱，作为库存产品的复查样品。将其详细信息(供者姓名、供者父母姓名、地址、联系方式、干细胞的配型信息等)输入电脑数据库，建立完善的数据档案。
实施例6：
人脐带间充质干细胞库的构建：
(1)将人脐带经过严格检测程序(ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等)确认安全性后，由缓冲液反复冲洗，去除残留血液，用无菌刀具将其切割至约1mm³-1.5mm³小碎块；
(2)取小碎块10ml，置于50ml离心管中，加入0.2％的胶原酶20ml，置37℃消化2h获得消化后混合物；
(3)往消化后混合物中加入磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)至充满50ml离心管，混匀，600g离心15min；
(4)弃上清，加入20ml磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)，重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，450g离心10min，重复两次，即制备出建库所需人脐带间充质干细胞。
(5)干细胞入库前，按2×10⁴/cm²接种于塑料培养皿，用含10％FBS(Gibco BRL，USA)的LG-DMEM(Gibco，USA)培养基，置37℃、5％CO₂培养箱培养，2d后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3d后换液，待细胞80％汇合，0.25％胰酶(Sigma，USA)消化，按1∶3传代，扩增后得到大量间充质干细胞，将所获得细胞用10％DMSO、10％右旋糖苷和80％LG-DMEM冷冻保护剂预处理，分装放入2ml冻存管，-196℃液氮保存。留取小部分细胞储存在-80℃冰箱，作为库存产品的复查样品。将其详细信息(供者姓名、供者父母姓名、地址、联系方式、干细胞的配型信息等)输入电脑数据库，建立完善的数据档案。
如图1所示，为人脐带来源的MSC细胞形态观察图：(A)采用本发明方法获得的MSC原代培养第1d细胞形态，细胞成短梭形；(B)MSC原代培养第5d细胞形态，细胞成梭形；(C)P1代MSC培养5d细胞形态，细胞成梭形；(D)P3代MSC培养5d细胞形态，细胞成梭形；(E)P6代MSC培养5d细胞形态，细胞成梭形；(F)P9代MSC培养5d细胞形态，细胞成梭形。
如图2所示，人脐带间充质干细胞P3代细胞表面标志性抗原检测：取P3代MSC消化，收集细胞，流式检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD106、CD152、CD166、CD271，流式结果显示CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD106-、CD152+、CD166+、CD271-。
上述操作均在无菌环境内进行，为保证细胞不受污染，所有使用的磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)均加入了1％青霉素和链霉素。
上述实施例所选用的胶原酶和胰蛋白酶来源如下：
胶原酶II型：Gibco公司，1000mg包装，溶液500ml HBSS中制成质量体积比为0.2％酶溶液；
胰蛋白酶(1∶250)：Gibco公司，1000mg包装，溶液400ml磷酸缓冲液(PH＝7.2-7.4)中制成质量体积比为0.25％。