技术领域
本发明涉及一种获自功能型苹果的花青苷调控蛋白MsMYB16及其编码基因和应用。
背景技术
“医食同源”是发展方向。苹果耐贮性好，供应周期长，是世界性果品，尤其果实 含有较高比例的、人体比较容易吸收的游离多酚，具有很好的抗氧化、抗肿瘤、预防 心脑血管疾病及保肝等作用，营养保健价值高，有“一天一苹果，医生远离我”(Anapple adaykeepsthedoctoraway！)的美誉，世界上相当多的国家都将其列为主要消费 果品而大力推荐。但近几年的调研结果表明，一方面，在过去几十年国内外育成的1000 多个苹果品种，80％是‘金帅’等品种的杂交、实生或芽选后代，这种“近亲繁殖”往 往带来品种的遗传基础狭窄及抗逆性减退等问题；另一方面，特色、多抗和多样性果 品成为产业发展的重要方向。
新疆野苹果及其红肉变型(Malussieversiif.neidzwetzkyana)是世界栽培苹 果的祖先种，不仅遗传多样性极为丰富，而且富含类黄酮等功能、保健成分，是进行 抗逆与品质育种的珍贵基因库。但因农田开垦等原因，新疆野苹果的遗传多样性正遭 到严重破坏，濒临灭绝；我国是世界上最大的苹果生产和消费国，其中2012年生产苹 果3950万吨，主要用于鲜食，且近70％是类黄酮含量较低的富士品种。
因此，围绕“新疆野苹果资源的科学保护与持续高效利用、栽培品种遗传基础拓 展、苹果产业转型升级与共给侧结构改革和农民持续增收以及人类健康水平提升”，进 行联合攻关与集成示范，本发明的发明人与美国康奈尔大学的教授合作，对新疆野苹 果及欧洲森林苹果等世界范围内的97份苹果资源进行了基因组重测序与生物信息学 分析，构建了新疆红肉苹果与苹果品种杂种一代及回交一、二代分离群体，研究明确 了新疆野苹果群体遗传结构与遗传多样性特征、核心种质构建的技术参数、类黄酮含 量等性状的遗传变异特点及发育机理，提出了“功能型苹果”的概念及“宽行高干、 行间生草、给草施肥、肥田养根”的现代果园管理理念，创建了常规杂交与生物技术 有机结合的苹果高效育种技术体系，创制了一批新品种及优异种质，研发了苹果新品 种配套高效栽培技术体系。目前，已授权和申报发明专利10余项，定植杂种实生苗4 万余株，育成新品种(系)16个；发表相关研究论文120篇，其中SCI论文20余篇， 这些研究成果总体处在国际同类研究的领先水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种获自功能型苹果的花青苷调控蛋白MsMYB16及其编码基 因和应用。
本发明提供的蛋白质，获自苹果，命名为MsMYB16蛋白，是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与植物花青苷含量相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的MsMYB16蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)中的MsMYB16蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表 达得到。上述(b)中的MsMYB16蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA 序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述MsMYB16蛋白的基因(MsMYB16基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因为如下(1)或(2)或(3)：
(1)编码区序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码与植物花青苷含量相关的 蛋白质的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物花青苷含量相关 的蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有所述MsMYB16基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组 织或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有MsMYB16基因的重组表达载体。所述植物表达 载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用MsMYB16基因构建重 组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型 或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用 MsMYB16基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列 的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源 是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或 结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载 体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗 性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加 任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。所述重组表达载体的出发载体可为 pRI101载体。所述重组表达载体具体可为在pRI101载体的SalI和BamHI酶切位点之 间插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒pRI101-MsMYB16。
所述植物组织具体可为植物愈伤组织，更具体可为植物幼叶愈伤组织。所述植物 可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为蔷薇科植物。所述蔷薇科植 物具体可为苹果属植物。所述苹果属植物具体可为苹果，更具体可为苹果‘紫红1号’。
本发明还保护所述MsMYB16蛋白的应用，为如下(b1)或(b2)：
(b1)调控植物的花青苷含量；
(b2)降低植物的花青苷含量。
所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为蔷薇科植物。 所述蔷薇科植物具体可为苹果属植物。所述苹果属植物具体可为苹果，更具体可为苹 果‘紫红1号’。
本发明还保护所述MsMYB16基因在培育花青苷含量降低的转基因植物中的应用。 所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为蔷薇科植物。所述 蔷薇科植物具体可为苹果属植物。所述苹果属植物具体可为苹果，更具体可为苹果‘紫 红1号’。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将所述MsMYB16基因 导入出发植物，得到花青苷含量低于所述出发植物的转基因植物。所述出发植物可为 单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为蔷薇科植物。所述蔷薇科植物具 体可为苹果属植物。所述苹果属植物具体可为苹果，更具体可为苹果‘紫红1号’。所 述MsMYB16基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植物。所述方法 中，具体可将所述MsMYB16基因导入出发植物的愈伤组织，然后将愈伤组织培育为植 株。所述愈伤组织具体可为幼叶愈伤组织。携带有所述MsMYB16基因的重组表达载体 可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌 介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
本发明还保护一种获得转基因植物组织的方法，包括如下步骤：将所述MsMYB16 基因导入出发植物组织，得到花青苷含量低于所述出发植物组织的转基因植物组织。 所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为蔷薇科植物。 所述蔷薇科植物具体可为苹果属植物。所述苹果属植物具体可为苹果，更具体可为苹 果‘紫红1号’。所述MsMYB16基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出 发植物组织。所述植物组织具体可为植物愈伤组织。所述愈伤组织具体可为幼叶愈伤 组织。
本发明还保护所述MsMYB16蛋白或所述所述MsMYB16基因或以上任一所述方法在 植物育种中的应用。所述植物育种的目的为培育花青苷含量降低的植物。
本发明发现了MsMYB16蛋白及其功能，可用于培育花青苷含量改变的转基因植物， 在植物育种中具有重大应用前景。
附图说明
图1为表型鉴定的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。
pRI101载体(又称“pRI101-ANDNA”)：Takala公司，CodeNo.3262。农杆菌LBA4404： Tiangen公司，产品目录号：CC2901。苹果‘紫红1号’(又称‘紫红1号’红肉苹果)： 参考文献：《‘紫红1号’红肉苹果果肉抗氧化性及花色苷分析》。
制备幼叶愈伤组织的方法具体参见文献：JiXH,ZhangR,WangN,YangL&Chen XS.Transcriptomeprofilingrevealsauxinsuppressedanthocyaninbiosynthesis inred-fleshedapplecallus(Malussieversiif.niedzwetzkyana).PlantCellTiss OrganCult,2015,123:389–404.。1％盐酸甲醇溶液的制备方法：97.2ml甲醇中加入 2.8ml浓盐酸。0.025MKCl缓冲液(pH＝1.0)的制备方法：1.86gKCl用980ml蒸馏水溶 解，用浓盐酸调pH到1.0，转入1L容量瓶中，用蒸馏水定容。0.4MNaAc缓冲液(pH＝4.5) 的制备方法：称54.43gNaAC用960ml蒸馏水溶解，用浓盐酸调pH到4.5，转移到1L容量 瓶，用蒸馏水定容。
实施例1、MsMYB16蛋白及其编码基因的发现
从‘红脆1号’苹果中发现了一个新蛋白，如序列表的序列1所示，将其命名为 MsMYB16蛋白。将编码MsMYB16蛋白的基因命名为MsMYB16基因，其开放阅读框如序 列表的序列2所示。
GENBANK中，与序列1同源性最高的蛋白如序列表的序列3所示。将序列表的序 列3所示的蛋白质命名为对照蛋白，其编码基因命名为对照基因，如序列表的序列4 所示。
实施例2、MsMYB16蛋白的功能鉴定
一、构建重组质粒
1、构建重组质粒pRI101-MsMYB16
(1)人工合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
(2)以步骤(1)得到的DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-GTCGACATGGGAAGATCTCCTTGCTG-3’；
R1：5’-GGATCCTCATTTCATCTCCAAGCTTCTG-3’。
(3)用限制性内切酶SalI和BamHI双酶切步骤(2)得到的PCR扩增产物，回收 酶切产物。
(4)用限制性内切酶SalI和BamHI双酶切pRI101载体，回收约10kb的载体骨架。
(5)将步骤(3)的酶切产物与步骤(4)的载体骨架连接，得到重组质粒 pRI101-MsMYB16。根据测序结果，对重组质粒pRI101-MsMYB16进行结构描述如下：在 pRI101载体的SalI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、构建重组质粒pRI101-△MsMYB16
(1)人工合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
(2)以步骤(1)得到的DNA分子为模板，采用F2和R2组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。
F2：5’-GTCGACATGGGAAGATCTCCTTGCTG-3’；
R2：5’-TGGCAGGGAGGGCACCTTTCCTGAACTGG-3’。
(3)以步骤(1)得到的DNA分子为模板，采用F3和R3组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。
F3：5’-AAAGGTGCCCTCCCTGCCAGCCTCA-3’
R3：5’-GGATCCTCATTTCATCTCCAAGCTTCTG-3’。
(4)将步骤(2)的PCR扩增产物和步骤(3)的PCR扩增产物混合后作为模板， 采用F2和R3组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
(5)用限制性内切酶SalI和BamHI双酶切步骤(4)得到的PCR扩增产物，回收 酶切产物。
(6)用限制性内切酶SalI和BamHI双酶切pRI101载体，回收约10Kb的载体骨架。
(7)将步骤(5)的酶切产物与步骤(6)的载体骨架连接，得到重组质粒pRI101- △MsMYB16。根据测序结果，对重组质粒pRI101-△MsMYB16进行结构描述如下：在pRI101 载体的SalI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列5所示的双链DNA分子。
3、构建对照质粒
将人工合成的序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pRI101载体的SalI和 BamHI酶切位点之间，得到对照质粒。
二、转MsMYB16基因愈伤组织的获得
1、将重组质粒pRI101-MsMYB16导入农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌接种至30ml含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利 福平的YEP液体培养基，28℃振荡培养至OD600nm＝0.6，12000rpm离心收集菌体，用30ml ddH2O悬浮，加入乙酰丁香酮并使其浓度为100μM，得到侵染液。
3、取苹果‘紫红1号’的幼叶愈伤组织，浸没到步骤2得到的侵染液中，室温振荡 30min。
4、完成步骤3后，取愈伤组织，置于含1mg/L6-BA和0.3mg/LNAA的MS固体培 养基上，28℃暗培养2天，然后转移到含1mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、50mg/L卡那霉 素和50mg/L利福平的MS固体培养基上光暗交替(16h光照/8h黑暗)培养30天。
5、完成步骤4后，取愈伤组织，提取基因组DNA，采用F4和R4组成的引物对进 行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的即为转MsMYB16基因愈伤组织。
F4：5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’；
R4：5’-TCATTTCATCTCCAAGCTTCTG-3’。
F4对应载体骨架上的35S启动子部分序列，R4对应MsMYB16基因上的部分序列， 靶序列长度约为800bp。
6、完成步骤4后，取转MsMYB16基因愈伤组织，置于含1mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、 50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的MS固体培养基上继代培养。
三、对照组织的获得
将重组质粒pRI101-△MsMYB16代替重组质粒pRI101-MsMYB16进行步骤二，得到转 △MsMYB16基因愈伤组织。
将对照质粒代替重组质粒pRI101-MsMYB16进行步骤二，得到转对照基因愈伤组织。
将pRI101载体代替重组质粒pRI101-MsMYB16进行步骤二，得到转空载体愈伤组织。
四、表型鉴定
各个愈伤组织的照片见图1。图1中的各个愈伤组织分别为步骤二的6中培养30 天后的转MsMYB16基因愈伤组织、步骤三的6中培养30天后的转△MsMYB16基因愈伤 组织、步骤三的6中培养30天后的转对照基因愈伤组织、步骤三的6中培养30天后 的转空载体愈伤组织和处于同一时期的苹果‘紫红1号’幼叶愈伤组织(用WT表示)。 苹果‘紫红1号’的愈伤组织显示为深紫色，表明其中花青苷含量较高。转MsMYB16 基因愈伤组织显示为浅黄色，表明其花青苷含量相对‘紫红1号’大大降低。转△ MsMYB16基因愈伤组织与‘紫红1号’的愈伤组织颜色基本一致。转空载体愈伤组织 与‘紫红1号’的愈伤组织颜色基本一致。转对照基因愈伤组织显示为黄紫相间的颜 色，其中花青苷含量高于转MsMYB16基因愈伤组织且低于‘紫红1号’的愈伤组织。
五、含量鉴定
待测愈伤组织分别为：步骤二的6中培养30天后的转MsMYB16基因愈伤组织、步 骤三的6中培养30天后的转△MsMYB16基因愈伤组织、步骤三的6中培养30天后的 转对照基因愈伤组织、步骤三的6中培养30天后的转空载体愈伤组织和处于同一时期 的苹果‘紫红1号’幼叶愈伤组织(用WT表示)。
具体步骤如下：
1、称取0.5g待测愈伤组织，加入液氮并研磨成粉末，然后加入5ml4℃预冷的 1％盐酸甲醇溶液，然后4℃避光静置浸提24h，然后8000r/min离心10min，收集上清 液。
2、取1ml步骤1得到的上清液，加入4ml0.025MKCl缓冲液(pH＝1.0)并混匀， 然后4℃避光静置浸提15min，然后8000r/min离心10min，收集上清液。
3、取1ml步骤1得到的上清液，加入4ml0.4MNaAc缓冲液(pH＝4.5)并混匀， 然后4℃避光静置浸提15min，然后8000r/min离心10min，收集上清液。
4、分别取步骤2得到的上清液和步骤3得到的上清液，测定510nm和700nm下的 吸光值。
花青苷含量(mg/g)＝△A×5×0.005×1000×449.2/(26900×0.5)；
△A＝(A510nm-A700nm)(pH＝1.0)-(A510nm-A700nm)(PH＝4.5)。
花青苷含量单位“mg/g”中的“g”指的是愈伤组织的鲜重。
进行五次重复试验，每次重复试验中每个待测愈伤组织各取10份，结果取平均值。
结果见表2。转MsMYB16基因愈伤组织的花青苷含量显著低于转△MsMYB16基因愈 伤组织、转对照基因愈伤组织、转空载体愈伤组织以及处于同一时期的苹果‘紫红1 号’幼叶愈伤组织。结果表明，MsMYB16蛋白可以降低植物的花青苷含量。
表2各个待测愈伤组织中的花青苷含量