技术领域
本发明涉及成相聚合物技术领域，更具体地，涉及光敏感可逆溶解成相聚合物技术 领域，特别是指两种光敏感可逆溶解成相聚合物及其制备方法，以及形成的光敏性再生 型两水相体系。
背景技术
两水相体系一般是指高聚物-高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓 度溶解所形成的互不相溶的两个水相体系。两水相体系在生物产品的分离与相转移生物 催化反应中有广阔的应用前景。然而，由于现有的两水相体系成相聚合物存在着难以回 收的问题，从而阻碍了两水相体系的应用。如何制备溶解可逆的高聚物，使其适用于两 水相萃取或生物转化便成为两水相分离技术的关键。解决两水相体系成相聚合物循环使 用问题成为研究热点。
目前关于可回收的两水相体系中，热促相分离的聚合物环氧乙烷(EO)和环氧丙烷 (PO)的无规共聚物EOPO具有一定的代表性。Tjerneld等人将EO-PO两端用憎水基团 (C14H29)修饰，单独用这种修饰过的共聚物(HM-EO-PO)就可形成两水相体系。成 相高聚物可通过温度诱导来回收(Johansson H.O.，Persson J.，Tjeneld F，Biotechnol.Bioeng. 1999，66(4)：247-257)。之后，Tjerneld等人又将这种修饰的HM-EO-PO与EO-PO组成两 水相体系，则可使两种高聚物均得到回收，其中，EO-PO在两相中的回收率是73％， HM-EO-PO的回收率是97.5％(Persson J，Johansson H.O.，Tjerneld F.，J.Chromatogr.A， 1999，864：31-48)。由于生物分子大都不耐热，这样通过加温来实现高聚物的回收只适 用于热稳定的生物产品。
关于pH敏感型的可回收两水相体系，Patrickios等人利用甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲 酯，甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯，甲基丙烯酸苯乙酯为单体通过接枝聚合得到ABC 三聚体，与聚乙烯醇(PVA)形成两水相体系(Patrickios C.S.，Hertler W.R.，Hatton T.A. Fluid Phase Equilibria，1995，108：243-245)。Asorf等人则以N，N-dially-N-carboethoxy- methylammonium Chloride为单体，用常规的方法合成了聚阴离子高聚物，这种聚合物可 与PEG35000组成两水相体系，通过pH调节实现这种聚合物的回收。但聚合物回收需在强 酸下进行(Hasan A.，Muallem A.，Mohamed I.M.W.，Asrof A.S.K.Polymer，2002，43： 1041-1050)。
Berlo等利用挥发性盐类进行相体系回收(Mos V.B.，Karel C.A.M.L.，Lunk A.M.V.D.W.，J.Chromatogr.B.，1998，711：61-68)。通过CO2和NH3在含蛋白质的PEG的水 溶液形成氨基甲酸铵(NH4NH2CO2)，达一定浓度时可形成两水相体系。之后，解除压 力使NH4NH2CO2挥发分解并加以重新回收。但这种两水相体系在操作上并不方便，且另 一相高聚物仍无法回收。
上述方法是解决聚合物的回收问题的各种尝试。但由于生物活性物质对热、极端pH 敏感，剧烈改变这些条件，对生物活性物质造成破坏。因此，研发能保持生物质活性与 稳定性、可用较为温和的方法回收再利用两相聚合物的两水相体系成为本领域亟待解决 的问题。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供两种光敏感可逆溶解成相 聚合物及其制备方法和形成的光敏性再生型两水相体系，该两种成相聚合物光敏感可逆 溶解，由此形成的再生型两水相体系为光敏性，两成相聚合物可以高效回收，大大降低 了使用成本，且回收简便，操作条件温和，可以保持生物质活性与稳定性。
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种光敏感可逆溶解成相聚合物I， 其特点是，所述光敏感可逆溶解成相聚合物I的粘均分子量为105～106，由式(1)所示单 体化合物、式(2)所示单体化合物、式(3)所示单体化合物和式(4)所示单体化合物 经无规共聚而得到，其中所述式(1)所示单体化合物、所述式(2)所示单体化合物、 所述式(3)所示单体化合物和所述式(4)所示单体化合物的摩尔比为100～80:4～2: 1:6～10，
其中，R1、R2分别选自H或C1～C6的烷基；R3为H或C1～C4的烷基；R4为CH3或CHO； R5为COOH、COONa或COOK。
较佳的，所述R1、所述R2分别选自H或C1～C3的烷基；所述R3为H或C1～C2的烷基。
更佳的，所述R1为异丙基，所述R2为亚甲基，所述R3为H。
较佳的，所述式(1)所示单体化合物、所述式(2)所示单体化合物、所述式(3) 所示单体化合物和所述式(4)所示单体化合物的摩尔比为82:4:1:10。
在本发明的第二方面，提供了一种制备上述的光敏感可逆溶解成相聚合物I的方法， 其特点是，将所述式(1)所示单体化合物、所述式(2)所示单体化合物、所述式(3) 所示单体化合物和所述式(4)所示单体化合物按摩尔比100～80:4～2:1:6～10加入 溶剂中，以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在惰性气体存在下，于50℃～80℃进行聚 合反应得到。
较佳的，所述溶剂为苯、无水乙醚、四氢呋喃或乙醇，所述惰性气体为氮气。
较佳的，所述式(1)所示单体化合物、所述式(2)所示单体化合物、所述式(3) 所示单体化合物和所述式(4)所示单体化合物按摩尔比82:4:1:10，引发剂占四种单 体总质量0.5％-2％，溶剂为四种单体总体积10-40倍，聚合反应进行12～36小时。
反应结束后，将所得物倒入正己烷中(比如可以：先除去溶剂，然后产物以少量丙 酮溶解将溶液倾入搅拌的15-20倍的正己烷中)，有沉淀析出，过滤，所得固体物经干燥 后即为本发明所说的一对可构成全回用两水相体系的成相聚合物I，简记为共聚物PNBAC。 共聚物PNBAC为一种光敏感型共聚物，即通过光照可将其从两水相体系中回收。
在本发明的第三方面，提供了一种光敏感可逆溶解成相聚合物II，其特点是，所述 光敏感可逆溶解成相聚合物II的粘均分子量为104～105，由式(5)所示单体化合物、式 (6)所示单体化合物、式(7)所示单体化合物和式(8)所示单体化合物经无规共聚而 得到，其中所述式(5)所示单体化合物、所述式(6)所示单体化合物、所述式(7)所 示单体化合物和所述式(8)所示单体化合物的摩尔比为15～20:4～2:1:4～2，
其中：R6、R7分别选自H或C1～C6的烷基；R8为H或C1～C4的烷基；R4为CH3或CHO； R5为COOH、COONa或COOK。
较佳的，所述R6为H或C1～C3的烷基，R7为H或C1～C3的烷基，R8为C3～C6的烷基。
更佳的，所述R6为甲基，所述R7为乙基，所述R8为二甲氨基。
较佳的，所述式(5)所示单体化合物、所述式(6)所示单体化合物、所述式(7) 所示单体化合物和所述式(8)所示单体化合物的摩尔比为16:3:1:4。
在本发明的第四方面，提供了一种制备上述的光敏感可逆溶解成相聚合物II的方法， 其特点是，将所述式(5)所示单体化合物、所述式(6)所示单体化合物、所述式(7) 所示单体化合物和所述式(8)所示单体化合物按摩尔比15～20:4～2:1:4～2加入溶 剂中，以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在惰性气体存在下，于50℃～80℃进行聚合 反应得到。
较佳的，所述溶剂为苯、无水乙醚、四氢呋喃或乙醇，所述惰性气体为氮气。
较佳的，所述式(5)所示单体化合物、所述式(6)所示单体化合物、所述式(7) 所示单体化合物和所述式(8)所示单体化合物按摩尔比16:3:1:4，引发剂占四种单 体总质量0.5％-2％，溶剂为四种单体总体积10-40倍，聚合反应进行12～24小时。
反应结束后，将所得物倒入正己烷中(比如可以：先除去溶剂，然后产物以少量丙 酮溶解将溶液倾入搅拌的15-20倍的正己烷中)，有沉淀析出，过滤，所得固体物经干燥 后即为本发明所说的一对可构成全回用两水相体系的成相聚合物II，简记为共聚物PNDBC。 共聚物PNDBC为另外一种光敏感型共聚物，即通过光照可将其从两水相体系中回收。
在本发明的第五方面，提供了一种光敏性再生型两水相体系，其特点是，由上述的 或上述方法制备的光敏感可逆溶解成相聚合物I和上述的或上述方法制备的光敏感可逆 溶解成相聚合物II配制而成。
也就是，将上述的聚合物PNBAC或由上述方法制备的聚合物PNBAC与上述的聚合物 PNDBC或由上述方法制备的聚合物PNDBC在水或缓冲溶液中以一定的浓度配伍即可构成全 回用两水相体系，即上述的光敏性再生型两水相体系。
在本发明的第六方面，提供了上述光敏性再生型两水相体系在分离生物产品中的应 用。
在本发明中：式(1)所示化合物和式(5)所示化合物是以丙烯酸为起始原料，首 先经酰氯化试剂酰氯化获得丙烯酰氯，然后再与相应胺反应后制得；式(6)所示化合物 是由丙烯酸与相应的醇经酯化反应制得；式(2)所示化合物、式(3)所示化合物、式 (7)所示化合物、式(4)所示化合物以及式(8)所示化合物为市售品。
本发明的有益效果具体为：本发明的设计并合成的可用于两水相分离系统的两种共 聚物：聚合物I和聚合物II，均为光敏感型共聚物，光敏感可逆溶解，由此形成的再生型 两水相体系为光敏性，两成相聚合物可以在光照条件下可高效回收，回收率均高达95％ 以上，大大降低了两水相体系分离生物产品或进行相转移生物催化反应的使用成本；并 且只用一个光源条件就能回收两个成相聚合物，回收操作简便，并可以保持生物质活性 与稳定性。
附图说明
图1是聚合物PNBAC与聚合物PNDBC的相图。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。其他未标明试剂 均是上海凌峰化学试剂有限公司产品，化学纯。
实施例1 光敏感型共聚物PNBAC制备
在具塞三角烧瓶中加入5.0g(0.04mol)异丙基丙烯酰胺(自制，性质同上海物竞科 技有限公司)、甲基丙烯酸丁酯(上海凌峰化学试剂有限公司，化学纯)、丙烯酸(上 海菲达工贸有限公司，分析纯)、叶绿酸铜钠(SIGMA，化学纯)，以50ml苯(上海菲 达工贸有限公司，化学纯)搅拌下充分溶解，1.0％molAIBN(偶氮二异丁腈，上海试四 赫维化工有限公司，化学纯)作为引发剂，充氮气10～15分钟，以充分去除氧气。塞子 封住三角烧瓶口，60℃水浴摇床，120rpm转速下，反应24小时。反应结束，产物以丙酮 溶解，并经正己烷沉淀，沉淀物干燥至恒重，得到最终产物，其粘均分子量为3.29×105。 因为叶绿酸铜钠单体可吸收可见光，故测定该聚合物最大吸收波长为406nm。
实施例2 光敏感型共聚物PNDBC制备
在具塞三角烧瓶中加入5.0(0.04mol)异丙基丙烯酰胺(自制，性质同上海物竞科技 有限公司)、甲基丙烯酸丁酯(上海凌峰化学试剂有限公司，化学纯)、甲基丙烯酸二 甲氨基乙酯(上海凌峰化学试剂有限公司，化学纯)、叶绿酸铜钠(SIGMA，化学纯)， 以150ml四氢呋喃(上海菲达工贸有限公司，化学纯)搅拌下充分溶解，1.0％moIAIBN (偶氮二异丁腈，上海试四赫维化工有限公司，化学纯)作为引发剂，充氮气10～15分 钟，以充分去除氧气。塞子封住三角烧瓶口，65℃水浴摇床，180rpm转速下，反应24小 时。反应结束，产物以丙酮溶解，并经正己烷沉淀，沉淀物干燥至恒重，得到最终产物， 其粘均分子量为5.4×104。该聚合物最大吸收波长近似，经测在405nm处；故两相均用吸 光值测定时，该聚合物采用次大吸收波长470nm处。
实施例3 光敏性再生型两水相体系的配制
将分别由实施例1和2制得的聚合物PNBAC与聚合物PNDBC按图1所示的相图进行配制， 聚合物PNBAC和聚合物PNDBC在水中浓度达到图1中双结线以上时，可形成两水相。PNBAC在两相中的浓度可通过测定406nm处PNBAC的吸光度，通过与已知浓度的PNBAC标准曲线 的计算中求得。而PNDBC在两相中的浓度可通过测定470nm处PNDBC的吸光度，通过与已知 浓度的PNDBC标准曲线的计算中求得。PNBAC-PNDBC的回收率可通配制时加入的聚合物量 减去两相中经过光回收聚合物后残留的聚合物量而获得。残留聚合物量可通过上述分光 光度法求得浓度，再乘以相体积或相重量而得。PNBAC-PNDBC的回收率也可用光回收的沉 淀蒸干至恒重而得。通过上述方法计算得聚合物PNBAC的回收率可达95.8％以上，聚合物 PNDBC的回收率分别为96.0％以上，因此，理论上可以循环使用至少60次。
实施例4 聚合物PNBAC与聚合物PNDBC的光照回收
分别配制0.2ml、0.5ml、1ml的10wt％和15wt％的PNBAC(由实施例1制得)，以及 0.3ml、0.5ml、1ml的10wt％和15wt％的PNDBC(由实施例2制得)，在激光照射面积 为1.77×10-6m2，设备输出功率大于300mW，功率密度为1.70×105W/m2时，上述不同体 积聚合物的沉淀时间分别为4.2min、10.2min、16.5min和8.2min、13.5min、21.5min， 以及5.3min、8.2min、10.0min和6.4min、9.8min、12.3min，回收率分别为95.8％、96.2％、、 97.1％和96.1％、96.5％、97.5％，以及96.7％、97.8％、98.1％和96.8％、97.6％、98.5％。 根据聚合物质量与光照沉淀时间线性关系，计算得要使1g聚合物PNBAC沉淀需要大约 127min，1g PNDBC沉淀需要大约57min。通过公式(1)，计算得1g聚合物PNBAC和PNDBC沉淀所需激光能量为3.81kJ和1.71kJ。
Q＝W×T (1)
公式(1)中，Q为吸收的激光能量，T为照射所需的时间，W为吸收激光的功率。
实施例5 光敏性再生型两水相体系I的配制
配制两水相体系I，上相为1ml 10wt％的PNBAC(由实施例1制得)，下相为2ml 10wt ％的PNDBC(由实施例2制得)，加入Na4P2O7，分配溶质苯丙氨酸，初始浓度为8.0mg/mL， 混匀后低速离心以促进两相形成，在257nm处分别测定苯丙氨酸在上、下相中的吸光度， 计算得分配系数为0.52。聚合物的回收方法同实施例4。上下相聚合物通过光照沉淀回收， 回收率在95％以上。证明该聚合物应用于两水相萃取可以实行。
实施例6 光敏性再生型两水相体系II的配制
配制两水相体系II，上相为1ml 10wt％的PNBAC(由实施例1制得)，下相为2ml 10wt ％的PNDBC(由实施例2制得)，加入Na4P2O7，分配溶质牛血清蛋白，初始浓度为0.8mg/mL， 混匀后低速离心以促进两相形成，最后用考玛斯亮蓝法分别测定牛血清蛋白在上、下相 中的分配，计算得分配系数为2.1。聚合物的回收方法同实施例4。
综上所述，本发明的两种光敏感可逆溶解成相聚合物光敏感可逆溶解，由此形成的 再生型两水相体系为光敏性，两成相聚合物可以高效回收，大大降低了使用成本，且回 收简便，并可以保持生物质活性与稳定性。
需要说明的是，在本发明中提及的所有文献在本申请中引用作为参考，就如同每一 篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所 运用的技术原理，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各 种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。