技术领域
本发明涉及基因工程和疫苗学领域，具体地，本发明涉及抗人乳头瘤病毒 的三价疫苗及其制法和用途。
背景技术
宫颈癌是常见的妇科恶性疾病，在最常见的妇女癌症中，宫颈癌的发病率 高居第二。HPV（乳头瘤病毒）病毒感染与宫颈癌的发生密切相关，人类至今 已经分离到了至少118种乳头瘤病毒。目前已证实，在肛生殖系统癌症中，由 HPV感染所诱发的癌症占3.7%。
在已被分离出的HPV病毒亚型中，已发现有15种具有诱导生殖系统癌症的 发生，因而被归为高危性HPV病毒亚型(如HPV16,18,31,33,52和58)，其中 HPV16和HPV18两种亚型在全世界占所有由HPV感染诱发宫颈癌的70%。继 HPV16和HPV18之后，HPV58和HPV52在亚洲和非洲具有高患病率，占全世界 宫颈癌发病率的2-3%。大规模中国妇女HPV病毒亚型分布分析表明，整体上 HPV的患病率(包括高危和低危HPV病毒亚型)在侵入性子宫颈癌(ICC)为 82.7%，在高度鳞状上皮内病变(HSIL)中为88.5%，在低度鳞状上皮内病变(LSIL) 为69.3%。
HPV是一种DNA病毒，直径约为45-55nm，呈球形，无包膜，衣壳为72个 壳微粒组成对称偏斜的20面体，其病毒颗粒衣壳由主要衣壳蛋白(L1)和次要衣 壳蛋白(L2)组成。主要衣壳蛋白L1在细胞中表达后能自动组装成衣壳颗粒，称 为病毒样颗粒(VLPs)，该颗粒与天然病毒有相似的空间构象、免疫特性和生物 学活性，并可以大规模制备和纯化。
含不同亚型或混合型HPV的VLPs/L1蛋白预防性疫苗已相继被成功研制 并开始在临床实验上使用。美国默克公司研究出了含有HPV6、HPV11、HPV16 和HPV18的四价疫苗(商品名Gardasil)，已获FDA批准并在美国上市，英国的 葛兰素史克公司也研究出了含有HPV16和HPV18的两价疫苗。
但是，就目前的HPV疫苗的生产工艺而言，大多采用大肠杆菌、酿酒酵 母（如Merk公司）或昆虫细胞（如葛兰素史克公司）作为反应器进行生产。 大肠杆菌表达的L1蛋白不能被正确折叠和修饰，并以包涵体的形式表达，因 此要组装成病毒样颗粒L1蛋白需要经过变性和复性的过程，纯化工艺复杂， 同时体外组装的病毒样颗粒的免疫原性低于真核表达并自主组装的病毒样颗 粒。用酿酒酵母生产HPV的VLP也存在一些明显的缺点，例如，酿酒酵母中 的外源HPVL1基因存在于质粒而非染色体上，导致分泌效率差、表达菌株不 够稳定、在生产过程中易发生质粒丢失等现象。此外，酿酒酵母的分泌蛋白平 均每条侧链有50-150个甘露糖残基，这种过度的糖基化导致所生产的VLP在 某些个体中产生不利的过敏反应；酿酒酵母无法采用高密度发酵，发酵成本很 高。
目前为止，还没有人体对具有不同基因型的各HPV病毒亚型之间存在交 叉反应的报道，因此针对某一病毒亚型的特异性疫苗通常只能使得接种者对该 特定病毒亚型有预防效果。为使易感人群或患者具有针对抗一种以上病毒亚型 (尤其是多种高危HPV)的预防免疫功能或治疗效果，迫切需要对该人群联合施 用针对几种相应的不同病毒亚型疫苗。
总之，本领域目前尚缺乏低成本、高效率的多种HPV L1蛋白或VLP的制 备方法，因此迫切需要开发新的高效、简便、低成本地制备HPV的L1蛋白或 VLP的方法，尤其是制备同时含有HPV16、HPV18和HPV58的L1蛋白或VLP 的方法，以便能够开发针对多种特定亚型的疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供非常适于在毕赤酵母中表达HPVL1蛋白的kozak序列 以及HPVL1表达盒。
本发明的另一目的是提供一种优化的人乳头瘤状病毒16、18和58L1蛋白的 核酸序列。
本发明的另一目的是提供一种制备抗人乳头瘤状病毒的疫苗的制备方法。
在本发明的第一方面，提供了一种编码人乳头瘤病毒HPV的主要衣壳蛋白L1 的核酸分子，所述的核酸分子选自下组：
(1)核酸分子的序列如SEQ ID NO.:3所示，或与SEQ ID NO.:3所示序列的同源 性≥95%（较佳地≥98%，更佳地≥99%），且编码的氨基酸序列与SEQ ID NO.:2 相同或基本相同；
(2)核酸分子的序列如SEQ ID NO.:6所示或，或与SEQ ID NO.:6所示序列的同 源性≥95%（较佳地≥98%，更佳地≥99%），且编码的氨基酸序列与SEQ ID NO.:5 相同或基本相同；
(3)核酸分子的序列如SEQ ID NO.:9所示，或与SEQ ID NO.:9所示序列的同源 性≥95%（较佳地≥98%，更佳地≥99%），且编码的氨基酸序列与SEQ ID NO.:8 相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的基本相同为氨基酸序列的同源性≥98%，较佳地≥ 99%。
在另一优选例中，序列如SEQ ID NO.:3所示的核酸分子编码野生型人乳头瘤 病毒HPV16L1蛋白。
在另一优选例中，序列如SEQ ID NO.:6所示的核酸分子编码野生型人乳头瘤 病毒HPV18L1蛋白。
在另一优选例中，序列如SEQ ID NO.:9所示的核酸分子编码野生型人乳头瘤 病毒HPV58L1蛋白。
在本发明的第二方面，提供了一种人乳头瘤病毒HPV的主要衣壳蛋白HPVL1 的表达盒，所述表达盒的5’-3’依次具有下述元件：kozak序列、HPVL1编码序列、 和终止子。
在另一优选例中，所述的kozak序列为：5’-(A/T)A(A/C)AA(A/C)ATGTC(T/C) -3’。
在另一优选例中，所述的kozak序列任选自SEQ ID NO.:10-25，较佳地任选 自SEQ ID NO：10、12、14或22，更佳地为SEQ ID NO：10。
在另一优选例中，所述HPVL1编码序列选自下组：
(1)序列如SEQ ID NO.:3所示，或与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥95%（较 佳地≥98%），且编码的氨基酸序列与SEQ ID NO.:2相同或基本相同；
(2)序列如SEQ ID NO.:6所示，或与SEQ ID NO.:6所示序列的同源性≥95%（较 佳地≥98%），且编码的氨基酸序列与SEQ ID NO.:5相同或基本相同；
(3)序列如SEQ ID NO.:9所示，或与SEQ ID NO.:9所示序列的同源性≥95%（较 佳地≥98%），且编码的氨基酸序列与SEQ ID NO.:8相同或基本相同。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述 的核酸分子或本发明第二方面所述的表达盒。
在另一优选例中，所述载体为pPIC3.5和pPIC3.5K，较佳地为pPIC3.5K。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第三 方面所述的载体或染色体整合有本发明第一方面所述的核酸分子或本发明第二方 面所述的表达盒。
在另一优选例中，所述宿主细胞为毕赤酵母。
在另一优选例中，所述宿主细胞的染色体具有1-50个拷贝的本发明第一方面所 述的核酸分子或本发明第二方面所述的表达盒。
在另一优选例中，所述宿主细胞的染色体具有2-10个拷贝，较佳地3-7个拷贝 的本发明第一方面所述的核酸分子或本发明第二方面所述的HPVL1基因表达盒。
在本发明的第五方面，提供了一种制备人乳头瘤病毒HPVL1蛋白的方法，包 括步骤：
(i)在适合的条件下，培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，所述宿主细胞 为毕赤酵母，从而表达出人乳头瘤病毒HPVL1蛋白；和
(ii)分离所述蛋白。
在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒HPVL1蛋白选自下组：HPV16L1； HPV18L1；或HPV58L1。
在本发明的第六方面，提供了一种制备人乳头瘤病毒HPVL1病毒样颗粒的方 法，包括步骤：
(a)在适合的条件下，培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，所述宿主细胞 为毕赤酵母，从而产生人乳头瘤病毒HPVL1病毒样颗粒；和
(b)分离所述病毒样颗粒。
在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒HPVL1病毒样颗粒选自下组：HPV16L1 病毒样颗粒；HPV18L1病毒样颗粒；或HPV58L1病毒样颗粒。
在本发明的第七方面，提供了一种制备疫苗组合物的方法，包括步骤：
将本发明的第五方面所述方法制备的人乳头瘤病毒HPVL1蛋白或本发明的第 六方面所述方法制备的人乳头瘤病毒HPVL1病毒样颗粒与药学上可接受的疫苗佐 剂混合，从而形成疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒L1蛋白为HPV16L1；HPV18L1；或 HPV58L1。
在另一优选例中，所述的HPVL1病毒样颗粒为：HPV16L1病毒样颗粒； HPV18L1病毒样颗粒；或HPV58L1病毒样颗粒。
在另一优选例中，所述的佐剂为铝佐剂、GLA佐剂，更佳的为GLA佐剂。
在本发明的第八方面，提供了一种制备人乳头瘤三价疫苗的方法，包括步骤：
(a)在适合的条件下，培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，所述宿主细胞 为毕赤酵母，从而分别产生HPV16L1病毒样颗粒、HPV18L1病毒样颗粒和HPV58L1 病毒样颗粒；和
(b)分离所述HPV16L1病毒样颗粒、HPV18L1病毒样颗粒和HPV58L1病毒样颗 粒，将所述病毒样颗粒与药学上可接受的疫苗佐剂混合，从而形成三价疫苗。
在另一优选例中，所述的疫苗佐剂为铝佐剂、GLA佐剂，更佳的为GLA佐剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示kozak序列优化结果，其中，图1A为16个kozak序列对目的蛋 白产量的提高效果，其中，第1个、第3个、第5个和第13个的kozak序列 的效果最明显，分别提高了1.5倍-2.2倍，最优的kozak序列是第1个kozak 序列；图1B为相应的Western Blot实验结果。
图2显示了宿主细胞的染色体中HPV16L1基因拷贝数对目的蛋白产量的 影响，其中，图2A显示，拷贝数越多，HPV16L1蛋白的产量越高；图2B为 基因拷贝数对目的蛋白产量Western Blot实验结果。
图3显示了宿主细胞的染色体中多拷贝HPV18L1基因鉴定结果见，图3A 显示不同的基因拷贝数对目的蛋白产量的影响，结果表明，在不同的宿主中， HPV18L1基因的拷贝数为1-3，拷贝数越多，HPV18L1蛋白的产量越高；图 3B为基因拷贝数对目的蛋白产量的Western Blot实验结果。
图4显示了宿主细胞的染色体中多拷贝HPV58L1基因鉴定结果，图4A 显示，不同的基因拷贝数对目的蛋白产量的影响，在不同的宿主中，HPV18L1 基因的拷贝数为1-3，拷贝数越多，HPV18L1蛋白的产量越高；图4B为基因 拷贝数对目的蛋白产量的Western Blot实验结果。
图5显示体外重组蛋白的表达结果；图5A表明，目的蛋白在12h开始表 达，到48h达到高峰，在48-96h表达稳定；图5B显示优化后的HPV16L1的 表达体系在各个时间点其目的蛋白的Western Blot实验结果。
图6显示HPV16L1表达蛋白电泳结果，泳道1-9分别代表不同洗脱组分， 目的蛋白约56kD，其纯度约为90.0%。
图7显示自组装HPV16L1病毒样颗粒鉴定结果，组装HPV16L1病毒样颗粒 大小不均一，颗粒直径分布在25nm至65nm之间，平均粒径45nm，与基因序列 未优化HPV的VLP的颗粒直径分布相同。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，筛选并优化了大量的kozak序列，意外 地发现了可以在毕赤酵母中极大促进HPVL1蛋白表达的kozak序列，并据此构 建了含有kozak序列的HPVL1基因表达盒；本发明人还对人乳头瘤状病毒 HPV16L1、HPV18L1和HPV58L1的基因序列进行了针对性地优化设计，从 而大大提高了目的蛋白产量；本发明还提供了具有高拷贝HPVL1基因的宿主 细胞，所述宿主细胞生产HPVL1目的蛋白的能力可以提高16倍以上。在此基 础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“病毒样颗粒”或“VLP”或“VLPs”指通过体外基因重组技 术获得的病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)，它具有天然病毒的外部结构， 但不包含病毒DNA/RNA，因此VLP在体内不会复制，提高了疫苗应用的安全 性，同时，VLP具有极好的免疫原性。
如本文所用，术语“HPVL1”指人乳头瘤状病毒HPV的主要衣壳蛋白L1。
如本文所用，术语“HPV VLP”指由人乳头瘤状病毒HPV的主要衣壳蛋白 自组装形成的病毒样颗粒。
如本文所用，术语“HPV16L1”和“HPV16L1VLP”分别指人乳头瘤状病毒 HPV16的主要衣壳蛋白L1和由该L1蛋白自组装形成的病毒样颗粒。
如本文所用，术语“HPV18L1”和“HPV18L1VLP”分别指人乳头瘤病毒 HPV18的主要衣壳蛋白L1和由该L1蛋白自组装形成的病毒样颗粒。
如本文所用，术语“HPV58L1”和“HPV58L1VLP”分别指人乳头瘤病毒 HPV58的主要衣壳蛋白L1和由该L1蛋白自组装形成的病毒样颗粒。
kozak序列筛选及优化
如本文所用，术语kozak序列（kozak consensus sequence）是指存在于起始 密码子AUG附近的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。在真核细胞中， 翻译的起始位点大多在5′端的AUG密码子位点。当与mRNA的5′端帽子结构结 合后，核糖体的40S小亚基对mRNA进行扫描，直到遇到第一个AUG密码子。 核糖体的40S小亚基对AUG周围核酸序列的识别在很大程度上引发翻译的起 始，并影响翻译效率。
本发明提供了一类特别适合在毕赤酵母中调控HPV L1蛋白表达的kozak序 列，所述的kozak序列为：5’-(A/T)A(A/C)AA(A/C)ATGTC(T/C)3’。
本发明人筛选并优化了大量的kozak序列，各个kozak序列的信息见表1。 并将所述kozak序列与编码HPV16L1、HPV18L1、或HPV58L1的核苷酸序 列连接。
测试所优化和筛选的kozak序列在毕赤酵母中对基因表达的影响，发现其 中有4个经优化的kozak序列能够大幅度提高目的蛋白的表达效率（最高可以达 到2倍以上）。4个经优化的kozak序列为：第1个kozak序列（SEQ ID NO.10）、 第3个kozak序列（SEQ ID NO.12）、第5个kozak序列（SEQ ID NO.14）、 和第13个kozak序列（SEQ ID NO.22）。
表1
kozak序号 SEQ ID NO.: 序列 1 10 AAAAAAATGTCT 2 11 AAAAAAATGTCC 3 12 TAAAAAATGTCT 4 13 TAAAAAATGTCC 5 14 AACAAAATGTCT 6 15 AACAAAATGTCC 7 16 AAAACAATGTCT 8 17 AAAACAATGTCC 9 18 TACAAAATGTCT 10 19 TACAAAATGTCC 11 20 AACACAATGTCT 12 21 AACACAATGTCC 13 22 TAAACAATGTCT 14 23 TAAACAATGTCC 15 24 TACACAATGTCT 16 25 TACACAATGTCC
本发明还提供了一种适用于在酵母细胞（更佳地在毕赤酵母）中表达的 HPVL1基因表达盒，所述表达盒从5’-3’依次具有下述元件：kozak序列，HPVL1 基因，和终止子。
在本发明的一个优选例中，所述kozak序列选自SEQ ID NO.:10-25；更佳 地选自SEQ ID NO.10、12、14或22，更佳地为SEQ ID NO.10。
在本发明的一个优选例中，所述HPVL1基因的序列选自下组：
(1)序列如SEQ ID NO.:3所示，或与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥95%；
(2)序列如SEQ ID NO.:6所示；或与SEQ ID NO.:6所示序列的同源性≥95%；
(3)序列如SEQ ID NO.:9所示；或与SEQ ID NO.:9所示序列的同源性≥95%。
HPVL1基因序列优化
在本发明中，提供了优化的、特别适合在毕赤酵母细胞中表达的HPV16L1、 HPV18L1以及HPV58L1蛋白的核酸编码序列。
在酵母细胞中，HPV16L1的天然核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，其编 码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；HPV18L1的天然核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；HPV58L1的 天然核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明人选用毕氏酵母偏好密码子，在不改变其氨基酸序列的前提下对 HPV16L1、HPV18L1及HPV58L1的DNA序列进行了优化。然而，本发明人 发现，仅依据密码子频率获得的优化序列并不完全适合在毕赤酵母中表达。因 此本发明人进行了二次优化，其中包括消除不利于表达的二级结构(如发夹结 构)，改变基因中A+T组成、改变G+C含量等。
经过大量测试和筛选，本发明人在众多优化序列中获得了一个特别优化的 HPV16L1编码序列。所述优化的HPV16L1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示， 与HPV16L1天然核酸序列的同源性约为77%，其编码的HPV16L1蛋白的氨基 酸序列依然如SEQ ID NO:2所示。
经过大量测试和筛选，本发明人在众多优化序列中获得了一个特别优化的 HPV18L1编码序列。所述优化的HPV18L1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示， 与HPV18L1天然序列的同源性约为75%，其编码的HPV18L1蛋白的氨基酸序 列依然如SEQ ID NO:5所示。
经过大量测试和筛选，本发明人在众多优化序列中获得了一个特别优化的 HPV58L1编码序列。所述优化的HPV58L1的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示， 与HPV58L1天然序列的同源性为77%，其编码的HPV58L1蛋白的氨基酸序列 依然如SEQ ID NO:8所示。
高拷贝HPVL1基因插入
本发明还提供了一种高拷贝HPVL1基因插入的宿主细胞。
在本发明的一个优选例中，所述高拷贝基因插入的方法包括步骤：
①将多个重组质粒转化导入毕赤酵母细胞，然后筛选阳性克隆；挑取阳 性克隆培养；获得潜在的高拷贝重组子阳性克隆；
②通过荧光定量PCR分析高拷贝重组子的实际拷贝数：抽提酵母基因组 DNA，以单拷贝的酵母持家基因GAP作为对照，通过荧光定量PCR仪扩增GAP 和L1基因，比较GAP基因和L1基因的Ct值，通过公式2CtGAP-CtL1计算出L1 基因的实际拷贝数。
在本发明的一个优选例中，所述重组质粒具有一个HPVL1基因表达盒， 所述表达盒从5’-3’依次具有下述元件：kozak序列，HPVL1基因，和终止子。
在本发明的一个优选例中，所述kozak序列选自SEQ ID NO.:10-25，较佳 地选自SEQ ID NO.10、12、14或22，更佳地为SEQ ID NO.10。
在本发明的一个优选例中，所述HPVL1基因的序列选自下组：
(1)序列如SEQ ID NO.:3所示，或与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥95%；
(2)序列如SEQ ID NO.:6所示；或与SEQ ID NO.:6所示序列的同源性≥95%；
(3)序列如SEQ ID NO.:9所示；或与SEQ ID NO.:9所示序列的同源性≥95%。
在本发明的一个优选例中，宿主细胞中HPV16L1基因的拷贝数是1-7。
在本发明的一个优选例中，宿主细胞中HPV18L1基因的拷贝数是1-3。
在本发明的一个优选例中，宿主细胞中HPV58L1基因的拷贝数是1-3。
载体和宿主细胞
本发明还提供了一种包含本发明的优化kozak序列以及HPVL1基因的载 体，以及含所述载体的宿主细胞。
在本发明的一个优选例中，所述述载体具有在酵母细胞（更佳地在毕赤酵 母）中表达的HPVL1基因表达盒，所述表达盒从5’-3’依次具有下述元件：kozak 序列，HPVL1基因，和终止子。
在本发明的一个优选例中，所述kozak序列选自SEQ ID NO.:10-25；更佳 地选自SEQ ID NO.10、12、14或22。
在本发明的一个优选例中，所述HPVL1基因为HPV16LI基因、HPV18LI 基因、或HPV58LI基因，更佳地，所述HPVL1基因序列选自下组：
(1)序列如SEQ ID NO.:3所示，或与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥95%（较 佳地≥98%）；
(2)序列如SEQ ID NO.:6所示；或与SEQ ID NO.:6所示序列的同源性≥95%（较 佳地≥98%）；
(3)序列如SEQ ID NO.:9所示；或与SEQ ID NO.:9所示序列的同源性≥95%（较 佳地≥98%）。
本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得优化的kozak序列和HPV L1基因序列，例如全人成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。 不对称PCR法是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链 DNA(SSDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为 50-100∶1。在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA， 但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR 就会产生大量的单链DNA。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列 信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和 纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明的多核苷酸序列可以通过常规的重组DNA技术，表达或生产目的蛋 白，包括步骤：
(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组 表达载体转化或转导合适的宿主细胞，较佳地毕赤酵母细胞；
(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和 合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pPIC3.5K。这些方法 包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可 有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻 译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多 个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
包含上述DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，表达目的蛋白质。能够表达HPV L1蛋白的宿主细胞可以是原核 细胞，如大肠杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞（毕赤酵母、酿酒酵母）； 或是高等真核细胞，如昆虫细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人 员熟知的常规技术进行。工程细胞可以是快速利用甲醇型(Mut+)或慢速利用甲 醇型(Muts)。
工程菌的培养和目的蛋白发酵生产
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基 因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种 常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当 的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细 胞再培养一段时间。工程细胞可以是快速利用甲醇型(Mut+)或慢速利用甲醇型 (Muts)。
在一个优选例中，适合毕赤酵母的培养基可以是表2(但并不限于)所述的 培养基。
表2
此外，对于大规模生产HPV L1，可选择无机盐培养基，也可在无机盐培 养基基础上进行一定更改，但所含离子成份宜与无机盐培养基相似。无机盐培 养基的成分见表3。
表3
在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：
(a)就温度而言，HPV L1的发酵及诱导温度保持在28-30℃；
(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；
(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在20-90%，溶氧的维持可以用氧气/空气混 合气体的通入来解决；
(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补 料或混合补料；
(e)就诱导期甲醇浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常甲醇浓 度控制在0.5-5%；
(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为12-160小时，较佳地为24-48 小时。
本发明的目的蛋白HPVL1存在酵母细胞胞内，通过离心机收集酵母细胞， 然后通过高压、机器力、酶解细胞被或其他细胞破碎方法破碎酵母细胞，释放 重组蛋白，优选的是高压法。酵母细胞裂解液可通过盐析、超滤等方法进行初 步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。
层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层 析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：
1．阴离子交换层析：
阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如 果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层 析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行 平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进 行盐浓度或pH的梯度洗脱。
2．疏水层析：
疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、 Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH4)2SO4等方式提高盐浓度，然后上 样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。
3．凝胶过滤层析
疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过 凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。
4.亲和层析
亲和层析介质包括（但不限于）：HiTrapTMHeparin HP Columns。
经过上述纯化可得到HPVL1纯品，纯化得率通常为20%以上，纯度95% 以上，纯品得率约2-5mg/L培液，远高于现有技术中采用酿酒酵母表达HPV 的水平(提高至少2-5倍)。此外，对于本发明毕赤酵母高水平表达的HPV L1， 大多已经自组装形成病毒样颗粒(VLP)，因此不需复性。
HPVL1病毒样颗粒的生产方法
本发明还提供了一种生产HPVL1病毒样颗粒的生产方法，具体地，包括步骤：
(a)在适合的条件下，培养本发明的宿主细胞，所述宿主细胞为毕赤酵母细 胞，从而产生人乳头瘤病毒HPVL1病毒样颗粒；和
(b)分离所述病毒样颗粒。
在另一优选例中，所述的HPVL1病毒样颗粒选自下组：HPV16L1病毒样颗粒； HPVL118病毒样颗粒；HPV58L1病毒样颗粒；或其组合。
制备疫苗组合物
本发明还提供了一种制备疫苗组合物的方法，具体地，包括步骤：
将本发明制备的人乳头瘤病毒L1蛋白或人乳头瘤病毒样颗粒与药学上可接受 的疫苗佐剂混合，从而形成疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒L1蛋白为HPVL116；HPVL118； HPVL158；或其组合。
在另一优选例中，所述的HPVL1病毒样颗粒为HPVL116病毒样颗粒；HPVL118 病毒样颗粒；HPVL188病毒样颗粒；或其组合。
在另一优选例中，所述的佐剂为铝佐剂、GLA佐剂，较佳的GLA佐剂。
组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物，所述组合物含有：(i)用本发明方法制备的重 组HPVL1蛋白或用本发明方法制备的HPVL1蛋白自组装的病毒样颗粒，以及 (ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。本发明中，术语“含有”表示各种 成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和 “由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。本发明的组合物可以是单价 的，也可以是多价的。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不 限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
(i)药物组合物
本发明的药物组合物包括有效量的用本发明方法制备的HPVL1蛋白或由 其自组装的病毒样颗粒(VLP)，所述VLP可以是单价的，也可以是多价的。
本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量， 或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检 测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该 对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗 剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况 而言，可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.2微克/千克至2微克/千克。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指 用于治疗剂(例如蛋白质、VLP或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些 药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后 没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多 糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所 熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可 找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另 外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。 通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适 合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受 的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的疫苗组合物可以是预防性的(即预防感染)，也可以是治疗性的。 所述的疫苗组合物包含免疫性抗原(包括本发明蛋白或自组装的病毒样颗粒)， 并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受 该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的 大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、 脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。 另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒 素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化 铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO 90/14837)，(b)SAF，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton， MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5) 细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰 素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6) 细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定 毒素LT)的脱毒变异体，参见例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作为 免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受 的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助 性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原 性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分 给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和 生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的 保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。 预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或 悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制 剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的，但优选是多价疫苗，即含有其 他HPV亚型的L1蛋白或VLP。
一种优选的多价疫苗含有选自下组的HPV亚型的至少两种或多种L1蛋白或 VLP：HPV16、HPV18、HPV58、HPV31、HPV33和HPV6。
一种特别优选的疫苗是含有以下3种HPV亚型的三价疫苗：HPV16、HPV18 和HPV58。
(iii)给药途径和剂量
所述组合物可以直接给予对象。对象可以是人或非人哺乳动物，较佳地为 人。当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通 常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、 皮内、肺内、静脉内、经鼻、阴道内、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要， 可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量 给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予病毒样颗粒疫苗，即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径 中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗HPV感染。
在各疫苗剂份中所选用的病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无 明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约 1μg-1000μg，较佳地为1μg-100μg，更佳地10μg-50μg蛋白质或VLP。可用包括 观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用 量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清 中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂 就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径 通过注射给予免疫原性组合物。此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂 一起给予，或者与其他亚型的HPV的免疫原(如病毒样颗粒)一起给予。
本发明的主要优点：
（1）本发明获得的kozak序列能够大幅度提高HPVL1蛋白表达量；
（2）本发明分别对人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1(HPV L1)的16、18和58 基因进行重新设计和序列优化，排除影响翻译的mRNA的二级结构；
（3）本发明构建的HPVL1基因表达盒尤其适用于在毕赤酵母中表达，并 具有蛋白表达量高、稳定性好、能够高密度生长的特点；
（4）本发明提供了含多拷贝HPVL1基因生物宿主细胞表达稳定，不易丢 失；
（5）本发明方法培养成本低，适合工业化应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)；或按照制造厂商所建议的条件。除非另 外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
构建HPV16L1毕赤酵母高效表达系统
1．HPV16L1基因的优化
优化序列：根据天然HPV16L1的氨基酸序列，考虑下述因素进行优化设 计：毕赤酵母使用密码子频率、基因中G+C含量和mRNA的二级结构。
本实施例优化的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，该序列编码的HPV16L1 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
人工全合成该优化基因(SEQ ID NO:3)，在其5’端与3’端分别引入BamHI 和EcoRI酶切位点；对照序列1采用野生型的HPV16L1基因(SEQ ID NO:1)， 编码相同的HPV16L1蛋白，经比对，优化的核酸序列与对照的野生型基因序 列的同源性约为77.0%
2.kozak序列优化
优化kozak序列：发明人设计16个不同的Kozak序列，与经优化的HPV 基因连接，转入宿主细胞，发酵并检测kozak序列对目的蛋白HPV 16L1的产 量影响。
结果见图1，其中，图1A为16个kozak序列对目的蛋白产量的提高效果， 其中，kozak序列1、3、5和13的效果最明显，分别提高了1.5倍-2.2倍，最 优的kozak序列是序列1；图1B为相应的Western Blot实验结果。
kozak序列1如SEQ ID NO:10所示（AAAAAAATGTCT）。
kozak序列3如SEQ ID NO:12所示（TAAAAAATGTCT）。
kozak序列5如SEQ ID NO:14所示（AACAAAATGTCT）。
kozak序列13如SEQ ID NO:22所示（TAAACAATGTCT）。
3.多拷贝基因插入及鉴定
向宿主细胞中转入携带目的基因HPV16L1的载体，这些载体能与染色体 发生重组，由于所述载体有卡那霉素抗性，利用该特点对多插入基因的HIS+转化子进行鉴定，实时荧光定量PCR法检测宿主细胞基因组中外源基因的实际 拷贝数。步骤如下：
将多个含有kozak1-HPV16L1的载体pPIC3.5K转入毕赤酵母；得到的HIS+转化子在96孔板YPD液体培养基中培养24小时；取0.5μl菌液点加到96孔 板含2mg/ml G418YPD固体培养基中培养；用TIANamp酵母提取试剂盒（购 于天根）抽提阳性克隆的基因组DNA；用ABI7300序列检测仪对样品进行分 析（酵母管家基因GAP作为标准），每个样品重复3次；用Western Blot比较 不同拷贝数与目的蛋白产量之间的关系。
图2显示了宿主细胞染色体不同的目的基因拷贝数对目的蛋白产量的影 响，其中，图2A显示，拷贝数越多，HPV16L1蛋白的产量越高；图2B显示 不同的基因拷贝数对目的蛋白产量Western Blot实验结果。
实施例2
构建HPV18L1毕赤酵母高表达系统
1．目的基因的优化
优化序列：根据天然HPV18L1的氨基酸序列，考虑以下因素进行优化设 计：毕赤酵母使用密码子频率、基因中G+C含量、mRNA的二级结构。
本实施例优化的目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，该序列编码 的HPV18L1蛋白的氨基酸序列与天然序列相同（SEQ ID NO:5所示）。人工 全合成该优化基因(SEQ ID NO:6)，在其5’端与3’端分别引入BamHI和EcoRI 酶切位点；对照序列为野生型的HPV18L1基因(SEQ ID NO:4)，编码相同的 HPV18L1蛋白，经比对，优化序列与对照的野生型基因同源性约为75.5%。
2.kozak序列优化
选用实施例1筛选到的kozak序列1。
3.多拷贝基因插入及鉴定
鉴定方法与实施例1相同。
多拷贝基因鉴定结果见图3，图3A显示不同的基因拷贝数对目的蛋白产 量的影响，结果表明，在不同的宿主中，HPV18L1基因的拷贝数为1-3，拷贝 数越多，HPV18L1蛋白的产量越高；图3B显示不同的基因拷贝数对目的蛋白 产量的Western Blot实验结果。
实施例3
构建HPV58L1毕赤酵母高表达系统
优化序列：根据天然HPV58L1的氨基酸序列，考虑以下因素进行优化设 计：毕赤酵母使用密码子频率、基因中G+C含量、mRNA的二级结构。
本实施例优化的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，该基因编码HPV58L1 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。人工全合成该优化基因(SEQ ID NO: 9)，在其5’端与3’端分别引入BamHI和EcoRI酶切位点。
对照序列1：野生型的HPV58L1基因(SEQ ID NO:7)，编码相同的HPV58 L1蛋白；经比对，优化序列与对照的野生型基因同源性约为77.2%。
2.kozak序列优化
选用实施例1筛选到的优化的kozak序列1，鉴定方法与实施例1相同。
3.多拷贝基因插入及鉴定
多拷贝HPV58L1基因鉴定结果见图4。
图4A显示不同的基因拷贝数对目的蛋白产量的影响，在不同的宿主中， HPV18L1基因的拷贝数为1-3，拷贝数越多，HPV18L1蛋白的产量越高；图 4B显示不同的基因拷贝数对目的蛋白产量的Western Blot实验结果。
实施例4
构建表达质粒，获得工程细胞
分别用全合成方法获得如实施例1-3所示优化的HPV16L1、HPV18L1、 HPV58L1衣壳蛋白L1基因以及kozak序列。按照该优化合成的序列，设计并合 成不对称PCR引物，扩增HPV L1的编码序列，双酶切扩增产物，插入相同酶酶 切后的pPIC3.5K质粒(购自Invitrogen公司)，酶切鉴定，获得测序正确的构建质 粒pPIC3.5K-HPV16L1、pPIC3.5K-HPV18L1和pPIC3.5K-HPV58L1。
按照Invitrogen公司操作手册，将表达质粒转化到宿主细胞-毕赤酵母 （GS115）中，简要步骤如下：
选用限制性内切酶切开质粒，质粒经酚/氯仿抽提后浓缩至10μl，将80μl 毕赤酵母感受态细胞和10μl浓缩后的质粒混匀后加到预冷的电击杯中。电击杯 放置冰上5min，设置参数1500V/5ms电击，结束后加入1ml1M山梨醇溶液至 电击杯中。混匀后涂布至MD筛选平板上，置于28℃培养箱培养3天。生长良 好的单菌落作为转化成功的工程细胞。
实施例5
表达蛋白及生成病毒样颗粒
1.宿主细胞用甲醇进行诱导表达
发酵总量50L，诱导结束后，采用Western blot检测目的蛋白的表达。HPV16 L1的鉴定使用鼠单克隆抗体CamVir1（购于Abcam公司，USA）和抗鼠IgG-HRP （购于Promega公司，USA）。在发酵的不同时间点取样，检测HPV L1-16的表 达水平。
蛋白表达结果见图5。图5A表明，目的蛋白在12h开始表达，到48h达 到高峰，在48-96h表达稳定；图5B显示优化后的HPVL1-16的表达体系在各 个时间点其目的蛋白的Western Blot实验结果。
2.蛋白的纯化
离心收获发酵的酵母细胞，离心条件5000rpm，用PBS进行洗涤，弃去上 清，所得沉淀为酵母细胞，将其重悬于100ml冰冷的裂解液中，并加入玻璃珠 进行细胞破碎，破碎过程在Bead-Beater（购于Biospec Products公司，USA）。 仪器上进行。裂解液离心，并用硫酸铵进行沉淀，收集所得沉淀蛋白，并用PBS 重悬。将含有目的蛋白的溶液进行透析，并用Heparin（肝素）色谱柱进行纯 化，蛋白溶解于1M的NaCl溶液中，最后用SDS-PAGE电泳检测纯度。
HPV16L1表达蛋白电泳结果如图6所示，泳道1-9分别代表不同洗脱组 分，目的蛋白约56kD，其纯度约为90.0%。
3.验证病毒样颗粒
采用透射电镜观察分离纯化得到的病毒样颗粒HPV L1-16。
结果见图7，从电镜结果可以看出，分离纯化获得自组装HPVL1-16病毒样 颗粒大小不均一，颗粒直径分布在25nm至65nm之间，平均粒径45nm，与HPV 的VLP的颗粒直径分布相同。HPV18L1和HPV58L1的纯化和鉴定，以及VLP 的鉴定方法与HPVL116相同，最终也成功构建了HPV18L1和HPV58L1的病毒 样颗粒，其粒径符合要求。