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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310591779.4 (22)申请日 2013.11.22 C12Q 1/68(2006.01) G01N 1/30(2006.01) (73)专利权人 武汉艾迪康医学检验所有限公司 地址 430023 湖北省武汉市江汉经济开发区 江旺路 8 号汉口创业中心爱帝楼五楼 (72)发明人 程建兵 夏成青 陈红梅 郭福晓 生帅 (74)专利代理机构 杭州裕阳专利事务所 ( 普通 合伙 ) 33221 代理人 江助菊 (54) 发明名称 骨髓细胞培养终止液及应用 (57) 摘要 本发明公开了一种医学检验领域中用于染色 体核型分析的骨髓细胞。
2、培养终止液及应用。其中 培养终止液包括溴化乙锭和秋水仙胺。在终止细 胞培养时加入一定量的溴化乙锭可以使分裂相中 染色体的长度更长， 带纹更加清晰， 具有省时、 省 力的优势， 且准确性更高， 在医学检验领域具有更 广泛的应用前景。 (51)Int.Cl. 审查员 江涵 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 CN 103667458 B 2016.05.25 CN 103667458 B 1.一种骨髓细胞培养终止液， 由溴化乙锭和秋水仙胺组成， 其中， 所述溴化乙锭在骨髓 细胞培养基中的终浓度为1555 g/ml， 所述秋水仙胺在骨髓细胞培。
3、养基中的终浓度为 0.040.075 g/ml。 2.根据权利要求1所述的细胞培养终止液， 其特征在于， 所述溴化乙锭在骨髓细胞培养 基中的终浓度为30 g/ml， 所述秋水仙胺在骨髓细胞培养基中的终浓度为0.06 g/ml。 3.权利要求1至2之一所述的骨髓细胞培养终止液在骨髓染色体标本制作中的应用， 其 特征在于， 在终止培养时， 向骨髓细胞培养基中加入溴化乙锭和秋水仙胺， 其中所述溴化乙 锭在骨髓细胞培养基中的终浓度为1555 g/ml， 所述秋水仙胺在骨髓细胞培养基中的终 浓度为0.040.075 g/ml， 摇晃均匀后37， 5.0CO2培养箱孵育1小时。 4.根据权利要求3所述的应。
4、用， 其特征在于， 所述骨髓染色体标本制作包括染色体标本 制片， 其步骤如下： a.玻片的准备： 提前将玻片用1HCl浸泡过夜， 用大量的清水进行冲洗后浸于95乙 醇中备用， 使用前将浸泡的玻片取出， 用大量清水清洗后放置于2-8冰箱中待用； b.滴片： 吸取细胞悬液后， 将滴管置于一定的高度， 滴4-5滴细胞悬液于玻片上， 使细胞 向玻片标记端远侧流动， 适当过火， 帮助染色体分散； c.烤片老化： 置于60烤箱中烘烤过夜或80烘烤1小时； d.配制胰酶:新鲜配制50ml0.3胰蛋白酶溶液置于染片缸中， 37水浴箱中预热半 小时以上， 其中所述胰蛋白酶用HANKS缓冲液稀释， 胰蛋白酶和HA。
5、NKS缓冲液均购自 Invitrogen公司； e.配制Giemsa染液:临用时将Gimesa原液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混合使用， 具 体的配制方法可以按下列步骤的a和b， a.制备贮备液 Giemsa粉1g 纯甘油66ml 甲醇66ml 先将Giemsa粉置于研钵中加少量甘油， 充分研磨， 呈无颗粒的糊状， 再将全部甘油加 入， 放入56温箱中2小时， 然后加入甲醇， 保存于棕色瓶中； 一般两周后使用为好； b.制备工作液 临用时将a步骤中的贮备液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混合； f.用胰酶消化染色后用于染色体核型分析。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103667。
6、458 B 2 骨髓细胞培养终止液及应用 技术领域 0001 本发明属生物技术领域， 特别涉及一种医学检验领域中用于染色体核型分析的骨 髓细胞培养终止液及应用。 背景技术 0002 G显带因为染色体主要是被Giemsa染料染色后而显带， 故称之为G显带技术， 其所 显示的带纹分布在整个染色体上。 人们将用各种不同的方法， 以及用不同的染料处理染色 体标本后， 使每条染色体上出现明暗相间， 或深浅不同带纹的技术称为显带技术 （banding technique） 。 本世纪70年代以来， 显带技术得到了很大发展， 且在众多的显带技术中 （Q带、 G 带、 C带、 R带、 T带） ， G带是目前被。
7、广泛应用的一种带型。 0003 研究发现， 人染色体标本经胰蛋白酶、 Na0H、 柠檬酸盐或尿素等试剂处理后， 再用 Giemsa染色， 可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹， 这就是染色体的G带。 每条染色体 都有其较为恒定的带纹特征， 所以G显带后， 可以较为准确的识别每条染色体， 并可发现染 色体上较细微的结构畸变。 0004 近年来， 随着分子生物学与细胞遗传学的发展， 骨髓染色体核型分析在血液系统 疾病的诊断、 治疗和预后中发挥了越来越重要的作用。 骨髓染色体的制备因骨髓中有大量 脂肪颗粒的干扰,骨髓中各种细胞系的细胞周期不固定,不统一,难以区别对待而使得 骨髓染色体分裂指数低,染色。
8、体短粗,分散度差， 且成本较高。 0005 因此， 建立一种具有分裂相多、 分散度好、 带纹清晰、 长度适中等特征的骨髓G带制 作方法尤为重要。 发明内容 0006 为了克服现有技术中的存在的问题， 本发明提供了一种骨髓细胞培养终止液， 包 括溴化乙锭和秋水仙胺， 其中， 溴化乙锭浓度为1.55.5mg/ml， 秋水仙胺浓度为815 g/ ml。 0007 进一步地， 溴化乙锭浓度为3mg/ml， 秋水仙胺浓度为12 g/ml。 0008 进一步地， 溴化乙锭的配制方法如下： 0009 a.配制储藏液 （9mg/ml） 0010 在100ml蒸馏水中加入0.9g溴化乙锭， 磁力搅拌数小时以确保。
9、其完全溶解， 然后用 铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中， 保存于室温； 0011 b.配制工作液 （3mg/ml） 0012 储藏液以1： 2 （EB:ddH2O） 的比例稀释成浓度为3mg/ml的工作液。 0013 进一步地， 秋水仙胺的配制方法如下： 0014 a.配制储藏液 （120 g/ml） 0015 称取12mg秋水仙胺， 加入8.5g/LNaCl溶液100mL， 待完全溶解后， 经5.516 104Pa （81bf/in2） 15min高压蒸汽灭菌后避光保存于4冰箱中； 说明书 1/4 页 3 CN 103667458 B 3 0016 b.配制工作液 （12 g/ml） 0017 。
10、取120 g/ml秋水仙胺溶液1mL加入8.5g/LNaCl溶液9mL即为12 g/ml的工作液。 0018 本发明还提供了所述的骨髓细胞培养终止液在骨髓染色体标本制作中的应用， 以 培养基用量为5ml计， 向培养基中加入50 l的溴化乙锭和25 l的秋水仙胺。 0019 进一步地， 将溴化乙锭和秋水仙胺加入培养基， 摇晃均匀后37， 5.0%CO2培养箱 孵育1小时。 0020 本发明的有益效果是： 在终止细胞培养时加入一定量的溴化乙锭 （EB） 可以使染色 体长度增加， 使分裂相中染色体的长度更长， 带纹更加清晰， 具有省时、 省力的优势， 且准确 性更高， 在医学检验领域具有更广泛的应用。
11、前景。 附图说明 0021 图1是利用实验组1所得染色体标本镜检结果。 0022 图2是利用实验组2所得染色体标本镜检结果。 0023 图3是利用实验组3所得染色体标本镜检结果。 0024 图4是利用对照组所得染色体标本镜检结果。 具体实施方式 0025 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 0026 实施例1配制骨髓细胞培养终止液 0027 骨髓细胞培养终止液包括1.55.5mg/ml的溴化乙锭和815 g/ml的秋水仙胺。 0028 其中所述溴化乙锭和秋水仙胺的配制方法可以采用本实施例所述的方法， 也可以 采用本领域其它的方法配制。 0029 A配制溴化乙锭 0030 a.配制储藏液 。
12、（浓度为9mg/ml） 0031 在100ml蒸馏水中加入0.9g溴化乙锭， 磁力搅拌数小时以确保其完全溶解， 然后用 铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中， 保存于室温。 0032 b.配制工作液 （浓度为3mg/ml） 0033 储藏液以1： 2 （EB:ddH2O） 的比例稀释成浓度为3mg/ml的工作液。 0034 B配制秋水仙胺 0035 a.配制储藏液 （浓度为120 g/ml） 0036 称取12mg秋水仙胺， 加入8.5g/LNaCl溶液100mL， 待完全溶解后， 经5.516 104Pa （81bf/in2） 15min高压蒸汽灭菌后避光保存于4冰箱中。 0037 b.配制工作液 。
13、（浓度为12 g/ml） 0038 取120 g/ml秋水仙胺溶液1mL加入8.5g/LNaCl溶液9mL即为12g/mL的秋水仙胺。 0039 实施例2制备骨髓染色体标本 0040 本实施例按如下方法制备骨髓细胞染色体标本。 包括以下步骤： 0041 (A)接种： 将骨髓细胞接种到骨髓细胞培养基中； 0042 (B)终止培养： 将实施例1中所述的终止液加入到步骤 （A） 培养基中； 0043 (C)收取骨髓细胞培养物， 用于染色体制片； 说明书 2/4 页 4 CN 103667458 B 4 0044 (D)染色体标本制片： 利用染料染色后获得具有G显带的染色体标本。 0045 在本实施例。
14、中以培养基用量为5ml计， 加入50 l浓度为1.55.5mg/ml的溴化乙锭 和25 l浓度为815 g/ml的秋水仙胺。 0046 在本实施例中终止培养时， 将溴化乙锭和秋水仙胺加入培养基， 摇晃均匀后37， 5.0%CO2培养箱孵育1小时。 0047 其中将骨髓细胞以13106个/ml的密度接种到骨髓培养基中， 放入37， 5.0% CO2培养箱培养24小时。 所得骨髓培养物可用于骨髓染色体制片。 0048 其中， 收取骨髓细胞培养物可按如下方法收集， 也可按本领域常用的其它方法收 集。 0049 (1)温和的摇晃培养瓶， 并将培养物转入相应的15ml离心管中。 拧紧培养瓶盖， 并 确保。
15、样品没有相混。 1,000rpm离心10min。 吸去上清液， 留下约0.5到1.0ml涡旋混匀。 0050 (2)低渗： 加入10ml37温箱预热的0.075MKCl溶液。 涡旋或反复颠倒几次使其 与样品混匀， 37水浴孵育2030min， 期间将离心管左右摇晃三次以使细胞低渗均匀。 0051 (3)预固定： 低渗结束后加入1ml的固定液 （甲醇： 冰醋酸=3： 1） ， 拧紧盖子并反复 颠倒三次。 1,000rpm离心10min。 吸去上清液， 留下约0.5到1.0ml。 0052 (4)将沉淀物涡旋混匀后， 逐滴加入8ml新鲜固定液。 0053 (5)涡旋混匀后1,000rpm离心10m。
16、in。 吸去上清液， 留下约0.5到1.0ml。 0054 (6)混匀细胞沉淀后加入8ml新鲜固定液。 0055 (7)同5和6。 0056 (8)涡旋混匀后1,000rpm离心10min。 吸去上清液， 留适量固定液， 并加入数滴冰 醋酸以制成浓度合适的细胞悬液， 静置15min后制片。 0057 其中本实施例中的染色体标本制片方法如下： 0058 a.玻片的准备： 提前将玻片用1%HCl浸泡过夜， 用大量的清水进行冲洗后浸于95% 乙醇中备用。 使用前将浸泡的玻片取出， 用大量清水清洗后放置于2-8冰箱中待用。 0059 b.滴片： 吸取细胞悬液后， 将滴管置于一定的高度， 滴4-5滴细胞。
17、悬液于玻片上， 使 细胞向玻片标记端远侧流动。 适当过火， 帮助染色体分散。 一般一个病人滴片1-2张。 0060 c.烤片老化： 置于60烤箱中烘烤过夜或80烘烤1小时。 0061 d.配制胰酶:新鲜配制50ml0.3%胰蛋白酶 （用HANKS缓冲液稀释） 溶液置于染片 缸中， 37水浴箱中预热半小时以上。 胰蛋白酶和HANKS缓冲液均购自Invitrogen公司。 0062 e.配制Giemsa染液:临用时将Gimesa原液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混合使 用。 具体的配制方法可以按下列步骤的a和b， 也可按本领域常用的其它方法配制。 0063 a 制备贮备液 0064 Giem。
18、sa粉1g 0065 纯甘油 66ml 0066 甲醇 66ml 0067 先将Giemsa粉置于研钵中加少量甘油， 充分研磨， 呈无颗粒的糊状， 再将全部甘油 加入， 放入56温箱中2小时， 然后加入甲醇， 保存于棕色瓶中； 一般两周后使用为好； 0068 b 制备工作液 0069 临用时将a步骤中的贮备液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混合。 说明书 3/4 页 5 CN 103667458 B 5 0070 f.用胰酶消化染色后用于染色体核型分析。 0071 实施例3对比实验 0072 取同一样本经培养后的骨髓细胞， 进行对比实验。 采用实施例1和实施例2的方法 设立实验组1、 实验。
19、组2和实验组3， 三组实验组分别采用不同浓度的细胞培养终止液， 其中： 0073 实验组1的终止液配方为： 0074 溴化乙锭1.5mg/ml 0075 秋水仙胺8 g/ml 0076 实验组2的终止液配方为： 0077 溴化乙锭5.5mg/ml 0078 秋水仙胺15 g/ml 0079 实验组3的终止液配方为： 0080 溴化乙锭3mg/ml 0081 秋水仙胺12 g/ml 0082 设立对照组， 其中： 0083 对照组的终止液配方为： 0084 秋水仙胺12 g/ml 0085 对照组制备骨髓细胞染色体标本的步骤包括： (A)接种： 将骨髓细胞接种到骨髓细 胞培养基中； (B)终止培。
20、养： 将终止液加入到步骤 （A） 培养基中， 以培养基用量为5ml计， 加入 25 l的秋水仙胺； (C)收取骨髓细胞培养物， 用于染色体制片； (D)染色体标本制片： 利用染 料染色后获得具有G显带的染色体标本。 0086 在镜下观察制片结果。 使用的显微镜型号为： LeicaDM2500。 图1至图4分别是实验 组1、 实验组2、 实验组3和对照组的镜检结果图。 从图1至3的镜检照片中很清晰地看到， 使用 本发明方法进行G带显色， 分裂相中染色体的长度更长， 带纹更加清晰， 因而诊断时， 更加省 时省力， 诊断结果更加准确。 说明书 4/4 页 6 CN 103667458 B 6 图1 说明书附图 1/4 页 7 CN 103667458 B 7 图2 说明书附图 2/4 页 8 CN 103667458 B 8 图3 说明书附图 3/4 页 9 CN 103667458 B 9 图4 说明书附图 4/4 页 10 CN 103667458 B 10 。