技术领域
本发明涉及检测犬恶丝虫的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒。
背景技术
犬恶丝虫（Dirofilaria immitis）会引起血液寄生线虫病（Heartworm disease）,不仅 严重影响养犬业的发展，同时也给人类健康带来严重威胁。犬恶丝虫的检测方法主要有:1） 微丝蚴检查。主要通过血检微丝蚴，即可确认犬体有成虫寄生。但是，由于在犬恶丝虫感染 的早期，血液中不能检测到微丝蚴，且在自然感染犬恶丝虫的犬中有10%-67%为单性感染， 不能产生微丝蚴，导致该法容易出现假阴性。同时，成虫寄生数量较少或采血时间、采血位 置不当等也会影响微丝蚴的检出率。并且在实际检测中约有20%以上感染犬用此法检测会出 现假阴性；2）可以采用血液学检查、心血管检查和X线检查进行辅助检测。此方法对设备仪 器有较高的要求，对于广泛使用有一定的困难；3）免疫学方法。通过检测犬恶丝虫抗原或抗 犬恶丝虫抗体，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）和商 品化诊断试剂盒等在内的免疫学技术已经被逐渐应用于检测犬恶丝虫;4）分子生物学诊断。 主要通过PCR方法检测，该方法具有较高的灵敏性和特异性。然而现有的PCR方法的灵敏度 不够,不能对犬恶丝虫进行快速、有效和准确的分子检测。尤其重要的是，犬恶丝虫病的感染 潜伏期较长且多为隐性感染，而现有的市场监测方法因灵敏度不够,而出现较高的假阴性率。
发明内容
鉴于犬恶丝虫引起的感染潜伏期较长且多为隐性感染，而现有检测犬恶丝虫的方法的假 阴性率较高，急建立一种能够敏感、特异、快速、准确地检测犬恶丝虫（Dirofilaria immitis） 核酸的分子诊断方法。为解决此技术问题，本发明提供了一种检测犬恶丝虫的荧光定量PCR 引物、探针及试剂盒。
本发明通过在病原5.8S rRNA上选择了一个相对保守的区域作为目的片段设计相关引物 和探针，发明一种高度灵敏可特异性扩增犬恶丝虫核酸的PCR系统，且该系统不扩增恶丝虫 属的其他种属的核酸，如D.repens,D.tenuis,D.ursi等。优化试验保证此发明技术的 特异性和敏感性。
从GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）获取如下相关的rRNA基因的序列后（AF217800， EU087700），用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行比对，设计 了一对引物和一对探针。
本发明所述一种检测犬恶丝虫的荧光定量PCR引物和探针，其序列如下：
上游引物：5’-TTCAATAACTCTAAGCGGGGGATCACCT-3’（SEQ ID NO.1）
下游引物：5’-TCTGATCGATATTGACCCTCAACCAGA C-3’（SEQ ID NO.2）
6-FAM探针：5’-TGCAGACGCATTGAGCACAAAGATTTC-(6-FAM)-3’（SEQ ID NO.3）
LCRed640探针：5’-LCRED640-AATGCACATTGCACCATCGGGTTG A-磷酸-3‘（SEQ ID NO.4）
本发明还提供了检测犬恶丝虫的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括5x FRET-qPCR Stock 22微升,22微升的5x的寡核苷酸混合物（含浓度为5μM的上游引物、5μM下游引物、 1μM的6-FAM探针、1μM的LCRed640探针，以及5个单位的高保真DNA聚合酶）。
采用上述引物和探针可通过FRET-PCR技术对犬恶丝虫进行检测可特异扩增引起犬恶丝 虫病的唯一病原体-犬恶丝虫的核酸，而不扩增其它类似但不引起犬恶丝虫病的丝虫的核酸 （如D.repens,D.tebuis等）。
FRET-PCR特异性的确定。设计的引物和探针经过GenBank的BLAST搜索，确认本发明设 计的引物能特异地扩增犬恶丝虫5.8s rRNA基因片段，而不扩增其它类似而不导致犬恶丝虫 病的种属的基因片段。此外，观察以上扩增对象在PCR过程中荧光强度（640nm）的变化，以 及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中条带的大小。荧光在640nm波长出现或增强，显示阳性； PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示预期的172bp的条带；对扩增的PCR产物进行测序，测 序的结果和GenBank的犬恶丝虫标准序列进行比对。
FRET-PCR灵敏度的确定：由IDT合成本发明PCR的扩增产物的代表序列,依据合成物的 分子量和绝对重量，计算合成物所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制 备每10μl合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝、1个拷贝的基 因。用本发明系统扩增含不同基因浓度的代表序列，来确定本发明检测此基因的灵敏度。结 果显示，此发明的单个反应系统可以扩单拷贝的5.8S rRNA基因。选择一个含犬恶丝虫的血 样(200μl)经核酸提纯后，5倍梯度连续稀释（从左向右）后用于PCR扩增。随着样品的稀 释，样品的cp值按照比例增加，表明此系统的高扩增效率（图1）。
现有检测犬恶丝虫方法的特异性和敏感性不够，不能对快速、准确的检测犬的恶丝虫。 尤其重要的是，犬恶丝虫感染的潜伏期较长且多为隐性感染，现有的市场检测方法的假阴性 率较高。该方法具有较高的灵敏度和特异性、所需样品量少等优点，为犬恶丝虫的体外快速 检测提供了强大的技术支持。
附图说明
图1.犬恶丝虫核酸PCR扩增曲线。含犬恶丝虫的血样(200μl)经核酸提纯后，5倍梯度稀释 （从左向右）后用于PCR扩增。随着样品的稀释，样品的cp值按比例增加，体现此系统的高 效扩增。横坐标：PCR的循环数；纵坐标：反应系统的荧光值（640/498）。
图2.来自哥斯达黎加的犬全血核酸经犬恶丝虫PCR扩增曲线。来自哥斯达黎加的40份犬全 血样品，经核酸提纯后用于本发明的犬恶丝虫PCR。其中9个样品为阳性,其余的阴性样品的 荧光线完全水平。横坐标：PCR的循环数；纵坐标：反应系统的荧光值（640/498）。
图3.来自哥斯达黎加的犬全血核酸经犬恶丝虫PCR的熔解曲线。来自哥斯达黎加的40份狗 全血样品，经核酸提纯后用于犬恶丝虫病PCR。其中的9个阳性样品出现特征性的约62摄氏 度的熔解温度（Tm）。横坐标：熔解的温度；纵坐标：根据软件计算的50%探针退火后形成的 荧光负对数峰[-(d/dT)荧光（498-640）]。
具体实施方式
1.FRET-PCR检测方法所用引物和探针的核苷酸序列如下：
上游引物：5’-TTC AAT AAC TCT AAG CGG GGG ATC ACC T-3’
下游引物：5’-TCT GAT CGA TAT TGA CCC TCA ACC AGA C-3’
6-FAM探针：5’-TGC AGA CGC ATT GAG CAC AAA GAT TTC-(6-FAM)-3’
LCRed640探针：5’-LCRED640-AAT GCA CAT TGC ACC ATC GGG TTG A-磷酸-3’
2.制备PCR用的标准定量试剂。由IDT合成5.8S rRNA基因的核酸序列，此序列涵盖此PCR 的扩增区域。依据合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含的5.8Sr RNA基因拷贝 数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10μl合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000 拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷贝的5.8S rRNA基因，作为PCR用的标准定量试剂；
3.制备待检样品的DNA模板。本发明所用的检测模板包括共169份，分别来自中国（广州、 昆明、郑州各30份，共90份）、哥斯达黎加（40份）、尼加拉瓜（39份）三个国家的犬 的全血样本。收集的全血样品保存于含EDTA的试管，用商业化试剂盒提纯核酸，最后洗 脱在200μl T10E0.1洗脱液，作为PCR的扩增模板；
具体的提取步骤：
3.1吸取20微升蛋白酶K加入到1.5ml离心管中。
3.2加入200微升全血到上述离心管中。
3.3加入200微升AL缓冲液到上述离心管中，在涡旋混匀仪上混匀15秒。
3.456℃孵育10分钟，600rpm.瞬离（除去盖子上的液滴）
3.5加入200微升乙醇（96%-100%）到样本中，涡旋混匀仪上混匀15秒。瞬离
3.6将上述混匀后的样本转移至带配备的有内置滤膜的离心柱上，避免液体污染离心柱 的边缘。盖紧盖子，8000rpm离心1分钟。弃去含有滤液的2ml收集管，换上新的收集 管。
3.7小心打开离心柱盖子，加入500微升AW1洗液，避免液体污染离心柱的边缘。盖紧 盖子，8000rpm离心1分钟。弃去含有滤液的2ml收集管，换上新的收集管。
3.8小心打开离心柱盖子，加入500微升AW2洗液，避免液体污染离心柱的边缘。盖紧盖 子，14000rpm离心3分钟。弃去含有滤液的2ml收集管，换上新的收集管。
3.914000rpm离心1分钟。弃去含有滤液的2ml收集管。将离心柱放置在1.5ml离心管 上。
3.10小心打开盖子，加入100微升洗脱液，置于恒温混匀仪上，56℃，600rpm孵育5分 钟。8000rpm离心1分钟。再重复一次该步骤。
3.11将洗脱下来的滤液吸取到新的1.5ml离心管中，-20℃或-80摄氏度保存。
4.PCR扩增体系。20μl的扩增体系包含10μl的样品DNA模板或者定量标准试剂、1xPCR 缓冲液、1μM上游引物-1、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640 探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP。
5.PCR扩增循环参数（以Roche公司LightCycler480荧光定量PCR仪为例）
PCR扩增包括18个温度递减的高严谨循环和40个欠严谨的荧光获得循环。18个温度递 减的高严谨循环：6x1sec@95℃，12sec@64℃，8sec@72℃；9x1sec @95℃，12sec@62℃，8sec@72℃；3x1sec@95℃，12sec@60℃， 8sec@72℃；40个欠严谨的荧光获得循环：40x1sec@95℃，8sec@58℃， 30sec@67℃，and30sec@72℃。
6.PCR结果的判定和定量分析。DNA模板的制备过程均设有DNA提取的阴性和阳性对照，随 后的PCR扩增对象包括待测样品的DNA模板、DNA提取的阴性和阳性对照、定量的标准试 剂（每10μl standard含104，103，102，101拷贝的5.8S rRNA基因）。结果显示，此发 明的单个反应系统可以扩增单拷贝的5.8S rRNA基因(图3)。
实施例1：检测来自哥斯达黎加40份狗全血核酸
40份采自哥斯达黎加的狗全血，每份取200微升全血经过商业核酸提取试剂盒提取后， 用200微升洗脱液洗脱核酸。使用本发明建立的PCR检测系统，检测该40份狗全血核酸， 根据实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线（图2；图3）判断，40份样本中，有9份 阳性样本。阳性率达到22.5%。9份阳性样品的PCR扩增产物经过商业试剂盒纯化后，送 至专门的测序公司进行测序。，在NCBI上比对测序结果。发现9个阳性样本均为犬恶丝 虫。每个PCR检测反应都伴随经测序确认的标准株作为阳性对照、和稀释液作为阴性对 照。稀释不同倍数的阳性对照显示阳性，阴性对照显示阴性，而表明次检测结果的正确 性。
实施例2：检测来自尼加拉瓜39份狗全血核酸
39份采自尼加拉瓜的狗全血，每份取200微升全血经过商业核酸提取试剂盒提取后，使 用本发明建立的PCR检测系统，根据实时荧光定量PCR的扩增曲线判断，此39份样本中 均为阴性。每个PCR检测反应都伴随经测序确认的标准株作为阳性对照、和稀释液作为 阴性对照。稀释不同倍数的阳性对照显示阳性，阴性对照显示阴性，而表明次检测结果 的正确性。
实施例3：检测来自中国三个地区共90份狗全血核酸
90份采自中国的广州、昆明、郑州三个地区（每个地区各30份）的狗全血，每份取200 微升全血经过商业核酸提取试剂盒提取后，用200微升洗脱液洗脱核酸，用于本发明建 立的PCR检测系统。根据实时荧光定量PCR的扩增曲线判断，此90份样品均为阴性。这 些狗均为来动物医院就诊的宠物狗，生长环境相对卫生和营养状况较好，并且许多狗还 会定期接种疫苗，接触病原体机会较少，也许这是出现全阴性结果的原因。这可能不同 地域的地理环境的差异和传播宿主的存在与否有关。每个PCR检测反应都伴随经测序确 认的标准株作为阳性对照、和稀释液作为阴性对照。稀释不同倍数的阳性对照显示阳性， 阴性对照显示阴性，而表明次检测结果的正确性。