罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102796829 B (45)授权公告日 2014.04.16 CN 102796829 B (21)申请号 201210304572.X (22)申请日 2012.08.24 C12Q 1/70(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (73)专利权人 浙江省淡水水产研究所 地址 313001 浙江省湖州市杭长桥南路 999 号 (72)发明人 潘晓艺 沈锦玉 蔺凌云 姚嘉赟 徐洋 袁雪梅 郝贵杰 尹文林 (74)专利代理机构 杭州浙科专利事务所 ( 普通 合伙 ) 33213 代理人 吴秉中 CN 102140512 A,2011.08.03, 。

2、权利要求 1-4， 说明书第 4-61 段 . CN 102277453 A,2011.12.14, 全文 . Pan X Y et al.GenBank ： JQ804993.1.GenBank ： JQ804993.1 .2012, 全 文 . (54) 发明名称 罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 检测试剂盒及其 检测方法 (57) 摘要 罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 检测试剂盒及其 检测方法， 属于靶 DNA 片断的检测技术领域。该 LAMP 检测试剂盒包括病毒 DNA 提取试剂和 LAMP 反应试剂， 所述的 LAMP 反应试剂中含有用于检测 罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 扩增用核酸引物组。

3、， 该 引物组包含引物 MRNuV-FIP、 引物 MRNuV-BIP、 引 物 MRNuV-F3、 引物 MRNuV-B3、 引物 MRNuV-LF 和引 物 MRNuV-LB。发明的试剂盒特异性强， 敏感性高 ； 本发明罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 检测方法利用 所述试剂盒检测， 该方法方便、 灵敏、 准确、 快速。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孙永福 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102796829 。

4、B CN 102796829 B 1/1 页 2 1. 罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 检测试剂盒， 包括病毒 DNA 提取试剂和 LAMP 反应试剂， 其特征在于所述的LAMP反应试剂中含有用于检测罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增用核酸引 物组， 该引物组包含引物 MRNuV-FIP、 引物 MRNuV-BIP、 引物 MRNuV-F3、 引物 MRNuV-B3、 引物 MRNuV-LF 和引物 MRNuV-LB ； 所述的引物 MRNuV-FIP 序列如 SEQ ID NO ： 1 所示 ； 所述的引物 MRNuV-BIP 序列如 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 所述的引物 MRNuV-。

5、F3 序列如 SEQ ID NO ： 3 所示 ； 所述的引物 MRNuV-B3 序列如 SEQ ID NO ： 4 所示 ； 所述的引物 MRNuV-LF 序列如 SEQ ID NO ： 5 所示 ； 所述的引物 MRNuV-LB 序列如 SEQ ID NO ： 6 所示 ； 所述的 LAMP 反应试剂包括以下组分 ： 1） LAMP 预反应液 ： 20 25mM pH 为 8.2 9.0 的 Tris-HC1、 5 10mM 硫酸镁、 10 12mM 氯化钾、 6 12mM 硫酸铵、 0.l 0.2% Triton X-100、 1 1.6 mM dNTP、 0.5 1.0 M 甜菜碱、 。

6、1.5 2.2M 引物 MRNuV-FIP、 1.5 2.2M 引物 MRNuV-BIP、 0.15 0.3M 引物 MRNuV-F3、 0.15 0.3M 引物 MRNuV-B3、 0.6 1.2M 引物 MRNuV-LF 和 0.6 1.2M 引 物 MRNuV-LB ； 2） 聚合酶 ： 每微升含 8 个活性单位的 Bst DNA 聚合酶 ； 3） LAMP 反应稳定液 ： 由矿物油或液体石蜡油组成 ； 4） LAMP 反应显色液 ： 含有 10 % SYBR Green I 的荧光染料。 2.如权利要求1所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒， 其特征在于所述的病毒 DNA 提取试。

7、剂包含以下组分 ： 含有 5 15 mM Tris、 0.5 1.5 mM EDTA ， pH 8. 0 的 TE 缓 冲液 ； RNase A， 浓度10 mg/mL ； 蛋白酶K溶液， 浓度20 mg/mL， pH8.0 ； Tris饱和酚， pH8.0 ； 乙酸钠水溶液， 浓度 3 mol/L ； 乙醇， 浓度 95%。 权 利 要 求 书 CN 102796829 B 2 1/5 页 3 罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 检测试剂盒及其检测方法 技术领域 0001 本发明涉及靶 DNA 片断的检测技术领域， 具体涉及一种利用环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal。

8、 amplification, LAMP) 技术快速检测罗氏沼虾诺蒂病毒所 用的试剂盒及检测方法。 背景技术 0002 罗氏沼虾诺蒂病毒 （Macrobrachium rosenbergii Nudivirus， MRNuV） 是引起罗氏 沼虾幼体变态障碍综合症的主要病原之一， 对罗氏沼虾育苗产业危害极大。MRNuV 为双链 DNA病毒， 属于诺蒂病毒属， 国际上对该属病毒并为明确其科分类地位。 该病毒于2010年从 患罗氏沼虾幼体变态障碍综合症的罗氏沼虾幼体中发现， 其造成罗氏沼虾在幼体期出现大 量死亡， 特别是在幼体后期和变态为仔虾过程中尤为严重， 死亡率一般为 70 80%， 严重的 达。

9、到 90% 以上， 近 2 年造成的经济损失无法估量。被发现以来， 因缺少检测方法， 严重阻碍 了该病毒引起疾病的预防工作， 因此该病毒检测试剂盒的开发和检测技术的研究显得尤为 重要。 0003 因此， 本发明采用环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 技术， 通过检测罗氏沼虾诺蒂病毒的 PIF-2 基因， 来检测罗氏沼虾诺蒂病毒， 这是目 前国内外首次建立的 MRNuV 检测方法。该方法的建立为罗氏沼虾幼体变态障碍综合症的预 防奠定基础。 发明内容 0004 针对现有技术存在的问题， 本发明的目的在于设计提供一种罗氏沼虾诺。

10、蒂病毒的 LAMP 检测试剂盒及其检测方法的技术方案。本发明的试剂盒特异性强， 敏感性高 ； 本发明 罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 检测方法利用所述试剂盒检测， 该方法方便、 灵敏、 准确、 快速。 0005 所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 检测试剂盒， 包括病毒 DNA 提取试剂和 LAMP 反应试剂， 其特征在于所述的 LAMP 反应试剂中含有用于检测罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 扩增用核酸引物组， 该引物组包含引物 MRNuV-FIP、 引物 MRNuV-BIP、 引物 MRNuV-F3、 引物 MRNuV-B3、 引物 MRNuV-LF 和引物 MRNuV-LB ； 0006 所述。

11、的引物 MRNuV-FIP 序列如 SEQ ID NO ： 1 所示 ； 0007 所述的引物 MRNuV-BIP 序列如 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 0008 所述的引物 MRNuV-F3 序列如 SEQ ID NO ： 3 所示 ； 0009 所述的引物 MRNuV-B3 序列如 SEQ ID NO ： 4 所示 ； 0010 所述的引物 MRNuV-LF 序列如 SEQ ID NO ： 5 所示 ； 0011 所述的引物 MRNuV-LB 序列如 SEQ ID NO ： 6 所示。 0012 所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒， 其特征在于所述的病毒DNA提取试 剂包含。

12、以下组分 ： 含有 5 15 mM Tris、 0.5 1.5 mM EDTA ， pH 8.0 的 TE 缓冲液 ； RNase A， 浓度 10 mg/mL ； 蛋白酶 K 溶液， 浓度 20 mg/mL， pH8.0 ； Tris 饱和酚， pH8.0 ； 乙酸钠水溶 说 明 书 CN 102796829 B 3 2/5 页 4 液， 浓度 3 mol/L ； 乙醇， 浓度 95%。 0013 所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 检测试剂盒， 其特征在于所述的 LAMP 反应试剂 包括以下组分 ： 0014 1） LAMP预反应液 ： 2025mM pH为8.29.0的Tris-HC1、。

13、 510mM硫酸镁、 10 12mM 氯化钾、 6 12mM 硫酸按、 0.l 0.2% Triton X-100、 1 1.6 mM dNTP、 0.5 1.0 M 甜菜碱、 1.5 2.2M 引物 MRNuV-FIP、 1.5 2.2M 引物 MRNuV-BIP、 0.15 0.3M 引物 MRNuV-F3、 0.15 0.3M 引物 MRNuV-B3、 0.6 1.2M 引物 MRNuV-LF 和 0.6 1.2M 引 物 MRNuV-LB ； 0015 2） 聚合酶 ： 每微升含 8 个活性单位的 Bst DNA 聚合酶 ； 0016 3） LAMP 反应稳定液 ： 由矿物油或液体石蜡。

14、油组成 ； 0017 4） LAMP 反应显色液 ： 含有 10 % SYBR Green I 的荧光染料。 0018 所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 检测试剂盒进行 LAMP 检测的方法， 其特征在于 包括以下工艺步骤 ： 0019 1） DNA 抽提 ： 取罗氏沼虾幼体去眼后的头胸部或是成虾鳃组织抽提出待检测 DNA 的数目 ； 0020 2） 罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 扩增 ： 0021 根据待检测 DNA 的数目， 设置所需 LAMP 反应管数 N， N= 样品数 +2， 其中 l 管为 阳性对照， l 管为阴性对照 ； 0022 吸取所述的 LAMP 预反应液的体积为 N23。

15、L， 加入一洁净的 1.5mL 离心管中， 然后加入NL Bst DNA聚合酶， 混合均匀， 15002000转/分钟离心10秒， 取上清之混合 液 ； 0023 向设定的 N 个 LAMP 反应管数中分别加入 24uL 步骤得到的混合液， 得到 N 个 PCR 反应管， 向上述 N 个 PCR 反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、 待检 DNA 模板和阳性 对照各 luL ； 0024 在上述步骤得到的反应管中再分别加入 30uL LAMP 反应稳定液， 盖紧管盖并 做好标记， 2000 转 / 分钟离心 5 秒 ； 0025 在 63下恒温反应 30 分钟 ； 0026 3） 显色检测 ：。

16、 0027 取出经步骤 2） 的反应管， 冷却至室温， 2000 转 / 分钟离心 5 秒， 按照阴性对照、 待 检样品和阳性对照的顺序依次分别加入l uL LAMP反应显色液， 轻轻混匀， 直接用肉眼观察 颜色变化或 1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色后进行观察。 0028 所述的 LAMP 检测试剂盒还具有阳性对照试样和阴性对照试样， 所述阳性对照试 样为含有罗氏沼虾诺蒂病毒 PIF-2 基因的质颗， 所述的阴性对照试样为无核酸去离子水。 0029 本 发 明 所 述 的 引 物 是 根 据 在 线 软 件 PrimerExplorer V4(http:/ primerexplo。

17、rer.jp/e/) 设计和手工修改而得， 本发明涉及的六条引物能特异识别靶序列 的八个不同位点， 增加了扩增的特异性， 并在反应中产生茎环结构。 0030 本发明中罗氏沼虾诺蒂病毒 PIF-2 基因序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 该序列为现有 序列。 0031 与现有技术相比， 本发明具有如下优点 : 说 明 书 CN 102796829 B 4 3/5 页 5 0032 （1） 本发明根据靶基因序列设计了罗氏沼虾诺蒂病毒检测用引物组， 能特异性识 别靶序列上的八个独立区域， 在 BstDNA 聚合酶的作用下启动循环链置换反应， 在靶标 DNA 区启动互补链合成， 在同一链上互补。

18、序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环 DNA 混合物， 由于 LAMP 技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利 进行， 所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响， 大大增强了罗氏沼 虾诺蒂病毒检测的特异性 ； 0033 （2） 采用本发明的引物组对罗氏沼虾诺蒂病毒进行检测， 因为特异性高， 所以可以 根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否 ； 0034 （3） 本发明的快速诊断试剂盒是利用环介导等温扩增技术快速检测罗氏沼虾诺蒂 病毒， 检测灵敏度高， 扩增模板仅需 12 拷贝 ； 0035 （4） 本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和， 且所需仪器简。

19、单， 也不需要特殊 试剂， 克服了传统 PCR 固有的检测时间长、 容易污染及检测成本高等缺点 ； 0036 （5） 本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效， 在不到 1h 即可完成扩增， 且产率 高 ； 0037 （6） 本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便， 从 dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的 Mg2+结合， 产生副产物焦磷酸镁沉淀， 可通过肉眼观察鉴定， 并且加入显色液后， 阴阳性结果显色差异显著， 验证率高， 更加明显可靠 ； 0038 （7） 本发明的快速诊断试剂盒操作简单， 对检测人员的技术素质要求较低， 可建立 成本低廉的快速筛选体系， 实现现场高通量快速检测 ； 0039。

20、 （8） 本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的环介导等温扩增反应体系， 不但使得罗氏沼虾诺蒂病毒定性检测更加简便快速、 特异性高、 灵敏度高， 而且该试剂盒是 检测罗氏沼虾诺蒂病毒的第一个试剂盒， 填补了罗氏沼虾诺蒂病毒无检测方法的缺口， 具 有很高的科研和经济价值。 附图说明 0040 图 1 引物特异性测试图 ； 0041 M ： DL 1000 DNA Marker ； 1 ： 罗氏沼虾诺蒂病毒 ； 2 ： 正常罗氏沼虾 DNA ； 3 ： 嗜 水气单胞菌 ； 4 ： 对虾白斑综合症病毒 ； 5 ： 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 ； 6 ： 阴性对 照。 0042 图 2 灵敏。

21、性检测图 ； 0043 M ： 1000 bp DNA Marker ； 1 ： 1.2104 copies ； 2 ： 1.2103 copies ； 3 ： 1.2102 copies ； 4 ： 1.210 copies ； 5 ： 1.2 copies ； 6 ： 阴性对照。 具体实施方式 0044 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 0045 （1） DNA 抽提 ： 0046 取罗氏沼虾幼体去眼后的头胸部或是成虾鳃组织 0.1 0.2g， 于冰上用研磨棒研 磨， 加 400L TE 缓冲液 （含有 5 15 mM Tris、 0.5 1.5 mM EDTA ， pH 8.。

22、0） 和 1L 浓 度为 10mg/mL 的 RNase A 后， 继续研磨充分后加浓度为 20mg/mL、 pH 值 8.0 的蛋白酶 K 溶 说 明 书 CN 102796829 B 5 4/5 页 6 液 20L ， 旋涡震荡 1 分钟后， 56水浴 30min， 加同体积 pH 值 8.0 的 Tris 饱和酚， 强烈振 荡， 11000g 离心 3 分钟， 取上清液， 重复酚抽提 ； 取上清液， 加入 0.1 倍体积的浓度为 3mo1/ L 的乙酸钠， 混匀， 再加等体积的冰冷乙醇， 混匀后低温静置 10 分钟， 15000g 离心 5 分钟， 弃 上清， 沉淀用 70乙醇洗涤 2 。

23、次， 室温干燥 5 10min 后以 30L 去离子水重悬。 0047 （2） 罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 扩增 ： 0048 根据待检测样品的数目， 设置所需 LAMP 反应管数 N， N= 样品数 +2， 其中 l 管为阳 性对照 （含有罗氏沼虾诺蒂病毒 PIF-2 基因的质粒） ， l 管为阴性对照 （无核酸去离子水） ； 吸 取 LAMP 预反应液的体积为 N23 L， 加入一洁净的 1. 5mL 离心管中， 然后加入 N L 每 微升含 8 个活性单位的 Bst DNA 聚合酶， 混合均匀， 1500 2000 转 / 分钟离心 10 秒， 向设 定的 N 个反应管中分别加入 24。

24、 u L 混合液， 并向 N 个 PCR 反应管内按顺序依次分别加入阴 性对照、 待检 DNA 模板和阳性对照各 luL ； 然后在每个反应管中再分别加入 30 u L 由矿物 油或液体石蜡油组成的 LAMP 反应稳定液， 盖紧管盖并做好标记， 2000 转 / 分钟离心 5 秒 ； 在 63下恒温反应 30 分钟。 0049 （3） 显色检测 ： 0050 取出经步骤 （2） 的反应管， 冷却至室温， 2000 转 / 分钟离心 5 秒， 按照阴性对照、 待 检样品和阳性对照的顺序依次分别加入 l uL 含有 10 % SYBR Green I 的荧光染料的 LAMP 反应显色液， 轻轻混匀。

25、， 直接用肉眼观察颜色变化， 绿色为阳性， 橙色为阴性。 也可以用1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察， 如果发现有阶梯 状的扩增特征条带， 说明样品中有罗氏沼虾诺蒂病毒。 0051 上述 LAMP 预反应液含有 ： 20 25mM pH 为 8.2 9.0 的 Tris-HC1、 5 10mM 硫 酸镁、 10 12mM 氯化钾、 6 12mM 硫酸按、 0.l 0.2% Triton X-100、 1 1.6 mM dNTP、 0.51.0 M甜菜碱、 1.52.2M引物MRNuV-FIP、 1.52.2M引物MRNuV-BIP、 0.15 0.3M引物。

26、MRNuV-F3、 0.150.3M引物MRNuV-B3、 0.61.2M引物MRNuV-LF和0.6 1.2M 引物 MRNuV-LB， 其中所述的引物 MRNuV-FIP 序列如 SEQ ID NO ： 1 所示 ； 所述的引物 MRNuV-BIP 序列如 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 所述的引物 MRNuV-F3 序列如 SEQ ID NO ： 3 所示 ； 所 述的引物 MRNuV-B3 序列如 SEQ ID NO ： 4 所示 ； 所述的引物 MRNuV-LF 序列如 SEQ ID NO ： 5 所示 ； 所述的引物 MRNuV-LB 序列如 SEQ ID NO ： 6 所示。

27、。 0052 MRNuV-FIP ： GTACCGGTAGTATTTTGTGGGATTAGAATTCCGTCATATTTACAGTT 0053 AAGGGGT ； 0054 MRNuV-BIP ： CAAGCCGTTATAGCGGTTGCGAATTCCTTGTCGTACGAAATATCCAA ； 0055 MRNuV-F3 ： CCGGTAATAATTCGTCTTCG ； 0056 MRNuV-B3 ： AGCTACGGTTAATAGCGTTA ； 0057 MRNuV-LB ： GGTTTCTCCACCAAACATAT ； 0058 MRNuV-LF ： CGCTAACAATGAAGCCGT。

28、AG。 0059 采用上述快速诊断试剂盒和方法进行 LAMP 检测罗氏沼虾诺蒂病毒特异性和灵敏 性试验结果如附图 1 和 2 所示。 0060 图 1 引物种特异性测试图， 如图所示， 仅罗氏沼虾诺蒂病毒能扩增出阶梯状的扩 增特征条带， 其它病毒无阶梯状的扩增特征条带， 表明对其它病毒无交叉扩增性。 0061 图2罗氏沼虾诺蒂病毒灵敏性检测图， 如图所示， 经Real-time PCR定量后的罗氏 说 明 书 CN 102796829 B 6 5/5 页 7 沼虾诺蒂病毒DNA系列稀释的扩增特征条带显示， 当反应体系中加入12个病毒拷贝的DNA， 就能扩增出特征条带。 0062 本发明利用环介。

29、导等温扩增技术快速检测罗氏沼虾诺蒂病毒的检测方法， 在已试 验的4种不同的病毒 （其中一个是诺蒂病毒） 进行了检测， 检测结果仅诺蒂病毒检测为阳性， 其它均为阴性， 说明该检测方法特异性高。 说 明 书 CN 102796829 B 7 1/3 页 8 SEQUENCE LISTING 浙江省淡水水产研究所 罗氏沼虾诺蒂病毒的 LAMP 检测试剂盒及其检测方法 11 7 PatentIn version 3.3 1 54 DNA 人工合成 1 gtaccggtag tattttgtgg gattagaatt ccgtcatatt tacagttaag gggt 54 2 47 DNA 人工合成。

30、 2 caagccgtta tagcggttgc gaattccttg tcgtacgaaa tatccaa 47 3 20 DNA 人工合成 3 ccggtaataa ttcgtcttcg 20 序 列 表 CN 102796829 B 8 2/3 页 9 4 20 DNA 人工合成 4 agctacggtt aatagcgtta 20 5 20 DNA 人工合成 5 cgctaacaat gaagccgtag 20 6 20 DNA 人工合成 6 ggtttctcca ccaaacatat 20 7 929 DNA 罗氏沼虾诺蒂病毒 7 aagcgaatct aaatgatcca tccg。

31、gtaata attcgtcttc gtgcgtcata tttacagtta 60 aggggtctac ggcttcattg ttagcgtaat cccacaaaat actaccggta cttgggtatt 120 tttcattatt acaagccgtt atagcggttg cggtttctcc accaaacata tttggatatt 180 序 列 表 CN 102796829 B 9 3/3 页 10 tcgtacgaca agtaacgcta ttaaccgtag ctactacgta accagtatta tgattacagt 240 ttacgggatc tacc。

32、gtacag tatacacctt ttttcacaaa tttattatca tatacaaaat 300 cattatcatt ttccaccact tgtaaattac cagcacctcc acatttgttt ttgcataaat 360 ttaagtaatt atccatttta ttttcatcta tgggccctaa atattttaat ttgtttttac 420 aatcaactaa agcgtctatt tgttcgttat cagtttttaa aattatattt ggcaaattag 480 cgatagtatt agcatttttt agattcatta tt。

33、ttatcatt aactacgtca actcgtaatt 540 tggtaagata tttttcgtat acttcgggat ttatctttaa gatagcaaaa tacgaaacta 600 aaactacgat gattataatc gataatacaa ggaagtaata tttcccaata gtatgttttt 660 taagttccat atcgaaaaat tattaatctt tttctgtttt agtttttttc cagtaaaatc 720 aattgtcgtt aagttcttaa aagttttaag ctctttataa tgttctttaa tcgcatcaaa 780 tttattttca attaactctt tacttttcgc gtaatcgtca atttcaactt tatacgaaga 840 attagtgtaa atatcacaag ctaatctaaa aactgtattt tgaacaaata cgtatctcct 900 agcataatat tcatcaaatt cataaccca 929 序 列 表 CN 102796829 B 10 1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102796829 B 11 。