技术领域
本发明涉及一种融合蛋白及其用途。具体而言，本发明涉及的融合蛋白由人 的白细胞介素2、白细胞介素7、富含阳性氨基酸的DNA结合蛋白SON以及与 gp120和/或gp41特异性结合并中和游离HIV病毒的辅助受体CXCR4多肽组成， 以作为非病毒载体。该非病毒载体融合蛋白和限制性表达的毒素基因重组体DNA 组装成复合药物，其中所述限制性表达的毒素基因重组体DNA是HIV 5’LTR控制 下的毒素基因表达重组体；所述毒素基因是编码对细胞具有杀伤作用的毒素蛋白 质的毒素基因。本发明还涉及所述融合蛋白以及所述复合药物在清除艾滋病患者 体内HIV的用途。
背景技术
由HIV感染引起的艾滋病是世界上危害最严重的一种传染病，造成了广泛的 社会和经济问题。HIV是艾滋病的病原。HIV存在于受感染的细胞中，也游离于 患者的血循环中。清除这两种存在形式的HIV，可望使艾滋病得到治疗。
目前艾滋病的治疗方法以鸡尾酒疗法(HAART，Highly Active[triple-drug] Antiretroviral Therapy)为主，但是此类药物存在毒副作用大，易形成耐药抗性突 变株，易形成潜伏病毒，及用药程序繁琐、价格昂贵等缺点，现有的科学研究结 果表明，该方法虽然可以显著降低患者体内的病毒滴度，但是不能根治艾滋病。
面对现有治疗方法的诸多缺陷，人们纷纷将目光投向了其他具有广泛潜力的 治疗方法上，其中基因治疗尤其引人注目。基因治疗是一种将外源DNA分子导入 人体的特定细胞的方法，通过该DNA分子的表达或者调节作用修正或者清除有害 的细胞，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗首先面临的就是载体问题，它能将 功能DNA分子特异性地输入到目的细胞，目前常用的载体有两种：一种是病毒载 体，一种是非病毒载体。病毒载体由于存在一些难以克服的技术困难，如滴度太 低、逆转录病毒能够整合破坏宿主细胞基因组而存在致癌的可能性、病毒载体感 染的细胞需要分裂、病毒引起的免疫排斥反应导致功能蛋白质失效、接受治疗的 患者的过敏反应、甚至引起休克或死亡等。相对而言，非病毒载体具有许多优点： 方便、安全、无毒副作用，可以选择特定的导向装置特异性地将效应分子导入到 靶细胞，从而实现治疗疾病的目的；而且相应蛋白质片段的DNA编码序列取自人 源基因组，将不会有免疫原性及其继发的问题出现。
靶向治疗是基因治疗的有力补充和合理延伸，它是通过受体与配体、抗体与 抗原等分子间特异性的相互识别与结合作用将药物分子输送到特定的细胞和组织 的治疗方法。具体而言，就是利用呈现在感染细胞或者组织表面上的与病原相关 的特定表型，将药物绑定在能特异性地识别这些表型的分子上，通过它们的相互 作用与结合将药物携带到目标细胞，从而抑制病原的扩展或者以受体介导的药物 内化的方式将药物输送到细胞内部发挥作用。目前的研究表明，靶向治疗具有针 对性强、毒副作用低和效果显著的特点。目前靶向治疗的研究和尝试主要集中在 癌症的治疗方面，相关的靶向分子包括细胞因子受体位点，例如具有靶向性的表 皮生长因子受体(EGFR)阻断剂；针对某些特定的细胞标志物，如能结合特定表 位的单克隆抗体；以及针对某些癌基因和癌的细胞遗传学标志的药物，抗肿瘤血 管生成的药物，抗肿瘤疫苗等。癌症靶向治疗的尝试提供了许多有价值的经验， 但同时也提出了一些具体的问题，例如利用受体与配体的关系，未能精确地把具 有杀伤功能的药物导入目标细胞，部分此类药物被导入正常细胞从而杀伤之，造 成毒副作用。这是因为客观的情况往往是，某种在肿瘤细胞表面富集的受体，往 往也存在于某些类型的正常细胞表面。再如治疗基因在肿瘤细胞中无法高效表达， 不足以消灭肿瘤细胞；在药物输送的过程中，靶向药物可能被降解、稀释；由于 所使用的人体异源蛋白质药物或鼠源抗体存在免疫原性问题，导致抗体或抗抗体 形成，中和了药物或抗体的生物活性而迅速失效；而且引起病人的免疫过敏反应 等。这些问题给应用靶向治疗的方法提出了挑战，同时也指出了未来靶向治疗技 术路线设计所必须进一步解决的问题。
由此看来，在艾滋病治疗领域存在着对既能有效杀灭被HIV感染的细胞又能 清除游离的HIV病毒，还能避免基因治疗中病毒载体的各种问题并实现对受HIV 感染细胞的准确靶向清除作用的药物的迫切需求。
本领域科技人员熟知，HIV是通过其糖蛋白gp120与细胞表面的受体CD4或 辅助受体CXCR4、CCR5等的结合而实现对细胞的感染的。HIV在细胞内复制与 繁殖的末期，随着其出芽过程，新HIV的gp120糖蛋白将出现在细胞的表面。对 于新药设计而言，它将是一个可被利用的特异性的靶点。如运用基因工程技术方 法克隆、表达并研制CD4、CXCR4、CCR5等受体或辅助受体等蛋白，原则上说， 它们既能结合受感染细胞表面的gp120、也可结合游离病毒表面的gp120，从而封 闭中和之，进而使之失去感染力。再者，HIV的感染与繁殖可分为T细胞嗜好型 (T-tropic)，主要结合CXCR4，与巨噬细胞嗜好型(M-tropic)，主要结合CCR5。但 在繁殖的进程中，M-tropic最终也要转变为T-tropic。因此，在新药设计中，在CD4 受体与CXCR4、CCR5辅助受体中，抓住CXCR4为靶点，则是关键的举措。如 将CXCE4(或也能同gp120完全结合的其第二胞外域XE)同其他蛋白融合，使之可 能携带杀伤因子(如毒素)的编码基因的限制性表达DNA重组体(限制其只在受HIV 感染细胞内表达)，可形成复合物。当辅助受体CXCR4(或XE)同受感染细胞表面 的gp120结合后，该复合物则可进入受HIV感染细胞，并表达出杀伤因子蛋白从 而杀灭该受感染细胞。即使该复合物也进入未受HIV感染的细胞，但杀伤基因将 不表达，细胞将不被杀伤(详见下文)。
再者，据报导，现国内外流行的HIV计有12种突变亚型。除2种HIV亚型 可分别经由CXCR4或CCR5的独立介导而实现其感染之外，其余突变亚型均须经 结合细胞表面的CD4与另一种辅助受体而实现其感染。这样，就本新药设计而言， 上述试图利用CXCR4为靶点的设计方案，对其他突变亚型的清除将可能无效。因 此，寻找新的攻击靶点是必要的。而且，采用不以HIV的受体或主要辅助受体为 靶点的策略，应是一个好的应对突变亚型的策略选择。
发明内容
本发明的技术目的是寻求一种既能特异杀灭被HIV及其突变亚型感染的细胞 又可能结合与封闭游离的HIV病毒使之失去感染力的复合药物。
本发明的第一方面涉及一种融合蛋白，其特征在于其由人的细胞因子多肽 IL2、IL7、富含阳性氨基酸的DNA结合蛋白SON以及与gp120和/或gp41特异性 结合并中和游离HIV病毒的辅助受体CXCR4多肽组成，优选地，所述IL2是刺 激细胞增生能力被消除但结合受体能力基本不变的突变改型IL2分子，最优选地， 所述突变IL2分子具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，所述IL7具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，和/或优选地，所述富含阳性氨基酸的DNA结合蛋白 是SON或其片段，更优选地，所述富含阳性氨基酸的DNA结合蛋白是SON的 1803-2023位氨基酸片段，最优选地，所述富含阳性氨基酸的DNA结合蛋白是 SON2，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，和/或优选地，所述与gp120和 /或gp41特异性结合并中和游离HIV病毒的辅助受体多肽是CXCR4或其片段，更 优选地，所述与gp120和/或gp41特异性结合并中和游离HIV病毒的辅助受体多 肽是CXCR4的第二胞外环区XE片段，最优选地，所述XE具有SEQ ID NO：7 所示的氨基酸序列。最优选地，所述融合蛋白是IL2-IL7-SON2-XE，其具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面涉及如上所述的融合蛋白作为非病毒载体的用途，其中所 述非病毒载体的用途是指所述融合蛋白利用其自身阳性氨基酸所带的正电荷与正 常条件下携带负电荷的核苷酸序列相互结合并利用融合蛋白中与细胞表面特异性 受体或HIV的gp120结合的成分将所述核苷酸序列投递至特定的靶细胞，从而起 到靶向性运输工具的作用。
本发明的第三方面涉及编码如上所述的融合蛋白的DNA核苷酸序列，其特征 在于，在不改变所述融合蛋白氨基酸序列的情况下，根据密码子简并性和/或使用 的宿主细胞的密码子偏爱性相应调整所述核苷酸序列的密码子。
本发明的第四方面涉及包括如上所述的融合蛋白和限制性表达毒素基因的重 组体DNA的复合药物，其中包含限制性表达毒素基因的重组体DNA是HIV 5’LTR 控制下的表达毒素基因的重组体，所述毒素基因是编码对细胞具有杀伤作用的毒 素蛋白质的毒素基因，优选地，所述HIV 5’LTR控制下的表达毒素基因的重组体 是以HIV-1和HIV-2的5’LTR为启动子并基于pGL3-Basic而构建的表达型重组体 p5’LTR-毒素基因。
优选地，所述毒素基因是编码商陆抗病毒蛋白(PAP)、突变改型的绿脓杆菌 毒素第III结构域(PEIIImut)、白喉毒素、蓖麻毒素或其活性功能区域的毒素基因， 优选地，所述毒素基因是编码PAP、PEIIImut或其活性功能区域的毒素基因，更 优选地，所述PAP具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，最优选地，所述PEIIImut 具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。优选地，所述p5’LTR-毒素基因是 p5’LTR-PAP或p5’LTR-PEIIImut。最优选地，所述融合蛋白是IL2-IL7-SON2-XE， 所述p5’LTR-毒素基因是p5’LTR-PAP或p5’LTR-PEIIImut。
优选地，组成所述融合蛋白的相邻的片段间进一步加入了具有柔性特征的连 接序列，所述柔性特征是指加入此连接序列后其前后的融合蛋白片段均可形成有 功能的结构域而互不影响，优选地，所述具有柔性特征的连接序列选自SEQ ID 15 或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
本发明的第五方面涉及上述复合药物在制备清除人艾滋病HIV的药物中的用 途。
本发明还涉及本发明第一方面所述的药物组合物的制备方法，所述方法是将 融合蛋白非病毒载体与限制性毒素基因表达的重组体DNA在适当条件下混合、装 配成的复合药物。
换言之，已知易受HIV/SIV感染的细胞如T细胞等其表面富集IL2受体与IL7 受体。这样，根据采用不以HIV的受体或主要辅助受体为靶点的策略考虑，在多 数可被HIV感染的细胞表面有白细胞介素2受体(IL2R)和白细胞介素7受体(IL-7R) 的表达。与IL-2相似，IL-7的信号转导也是通过普遍细胞因子受体γ链(γc)实 现的。但是除此之外，还需要IL-7受体α链(IL-7Rα)，后者决定了IL-7信号转 导的特异性。IL-7R被发现存在于前期未成熟的B细胞上；在T细胞上，IL-7R的 表达虽然在激活后有瞬间的下降，但是在多数成熟的T细胞上都发现了它的存在。 在IL-7的信号转导过程中，IL-7分子首先结合到IL-7Rα上，诱导γ链形成二聚体， 同时γ链也能结合到IL-7上，此后，Jak3使IL-7Rα的胞内部位的酪氨酸(Tyrosine) 磷酸化，并进一步募集Jak1和STAT(Signal Transducer and Activator of Transcription-信号转导因子与转录的活化因子)分子以实现下游的信号转导并最终 引起细胞的特异性反应。需要进一步指出的是，当细胞受到HIV的感染后，该细 胞将被活化，IL2R与IL7R将高表达并富集，在数量上将远多于一般未受HIV感 染的相应细胞。就旨在清除HIV新药设计而言，IL2R与IL7R同为可被利用的靶 点。运用IL2与IL7同其他可携带杀伤因子编码基因的蛋白融合，则可将杀伤因子 经IL2或IL7同其受体IL2R或IL7R的结合，把杀伤因子的编码基因靶向导入受 HIV感染细胞并只在受感染细胞内表达，由此可望准确特异杀灭受感染细胞，而 不伤及正常细胞。而且，不管流行的HIV发生怎么样的突变，均不妨碍上述以IL2 与IL7为配体设计的非病毒载体携带毒素杀伤基因重组体结合受HIV感染细胞表 面的IL2R与IL7R并进入细胞内的进程。
上述作为限制杀伤因子如毒素的编码基因的表达的设计，可采用HIV-1或 HIV-2的5’LTR序列。该序列含特异性启动子Tar。它在一般情况下无启动活性。 它必须在HIV的Tat转录因子的激活下才有启动子的活性。受HIV感染的细胞内， 当然有Tat蛋白，后者必然会结合到Tar上使之被激活。之后，被激活的Tar启动 子将驱动其下游毒素基因的表达，从而杀灭被HIV感染的细胞。而在未受HIV感 染的细胞内，既无HIV、亦无Tat转录因子。这样，即使这一毒素基因重组体进入 正常细胞，毒素基因不会表达，正常细胞也不会被杀伤。这就是毒素基因的限制 性表达的设计。
再者，采用IL7作为非病毒载体的组成部分，还有一个潜在的好处，就是激 活潜伏的HIV。关于这一点，国外在基础研究方面已给予了证明。本申请将不深 入再证明这一点，只留在今后的工作进一步的深入观察。本申请只把IL7作为非 病毒载体的组成部分，并用以引导复合药物进入受HIV感染细胞，具有首创性。
因此，本发明通过将细胞因子IL2与IL7、DNA结合蛋白和HIV感染细胞所 必需的辅助受体片段融合得到融合蛋白IL2-IL7-SON2-XE，其作为非病毒载体， 将其与带有限制性表达的毒素基因的重组体p5’LTR-PAP DNA在一定条件下混合， 从而成为IL2-IL7-SON2-XE/p5’LTR-PAP复合药物。如上所述，该复合药物只杀灭 受HIV感染的细胞、但不杀伤正常细胞。而且含有XE蛋白质片段的非病毒载体 还具有封闭、中和和失活游离HIV/SIV病毒的功能。而且，避免了脂质体对细胞 显著的毒性。
下面对所述药物组合物中的具体组成成分和组件做进一步的描述。
细胞因子是一类能调节机体免疫细胞功能的分子，它们在艾滋病发生的各个 阶段都发挥着重要的作用，利用这一类分子和它们的受体间的相互作用来介导基 因药物的准确输送是本发明的基本特点之一。在本发明中所用到的细胞因子有白 细胞介素2(IL2，Interleukin-2)和白细胞介素7(IL7，Interleukin-7)。它们在维 持T细胞的动态平衡(Homeostasis)以及B细胞和T细胞发育分化方面具有调节 作用。针对它们的特异性受体广泛分布在各种免疫细胞表面，为利用这两种细胞 因子设计药物的靶向输送提供了重要的理论基础。
本发明的一个具体实施方案中用到的是IL2的一种突变体(氨基酸序列见SEQ ID NO：14，其编码核苷酸序列见SEQ ID NO：13)。野生型的IL2分子具有很强的 结合受体组合物的能力，Kd值达到了10E-15，但是这种分子同时能激活下游的信 号转导通路，从而引起一系列细胞反应，导致细胞增生，对细胞正常繁殖产生不 利影响。有鉴于此，本发明利用了激活能力基本消失，但是结合受体能力变化不 大的突变IL2分子，考虑到野生型IL2极高的结合受体的能力，突变后的IL2对受体 分子依然具有足够强的结合力，其Kd仍能达到10E-10数量级。其激活能力基本消 失而结合能力变化不大的突变IL2分子更符合本发明的需求。除此之外，通过IL2 实现受体介导的作用，从而高效地将基因药物输送到细胞内也是本发明利用该细 胞因子的重要原因。总而言之，IL2突变体在艾滋病细胞的靶向杀伤的复合药物的 设计中是一个非常有利的因素。
本发明中利用到的第二种细胞因子是IL7(原始DNA编码序列见SEQ ID NO： 3，密码子改造的DNA编码序列见SEQ ID NO：4，氨基酸序列见SEQ ID NO：5)， 它在机体免疫系统的发育和分化中扮演重要角色。其功能主要体现在它能刺激B细 胞和T细胞的扩增和成熟方面。同时，IL7受体广泛分布在多数成熟的T细胞上，这 为基因药物准确靶向导入这些在艾滋病发病过程中起重要作用的细胞提供了保 障。正是利用这一点，本发明通过IL7及其受体介导的识别作用，成功地将基因药 物输送到了目的细胞表面，再通过进一步的转运和导向，实现了毒素基因的靶向 转运设计。除此之外，许多研究发现，IL7能有效的对抗HIV在体内的某些特定的 效应，例如，在艾滋病患者体内，胞质IL7的水平明显高于正常人体，这是一种可 逆的效应，而且和CD4+T细胞的水平有关，这可能反映了机体试图恢复CD4+T细 胞水平的努力，因为当患者接受了抗病毒治疗(ART，Antiretroviral Therapy)而 使CD4+T细胞水平恢复后，IL7的浓度会自然降低。体内试验的结果进一步表明， IL7能够刺激SIV感染的猴子体内中心和外周免疫系统T细胞的更新而并不使SIV复 制水平增加。IL7和其受体间的特异性相互作用为本发明提供了导向开关。
此外，本发明的靶向性融合蛋白还包括来自于HIV感染目的细胞所必须的辅助 受体CXCR4及其能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的片段。本发明的一个具体实 施方案中用到的片段是CXCR4的片段XE，该片段是CXCR4的第二胞外环区，是 CXCR4结合HIV/SIV的gp120的核心序列，含27个氨基酸(SEQ ID NO：7，其编 码核苷酸序列见SEQ ID NO：6)。在本发明中，利用该片段实现了两个目的：首先， 受HIV感染的细胞表面必定有HIV在入侵过程中起关键作用的糖蛋白gp120，在融 合蛋白中加入能结合gp120的XE片段增强了融合蛋白的靶向能力；其次，该融合蛋 白还能结合游离病毒表面的gp120，从而封闭、中和失活游离病毒，达到阻止病毒 入侵，降低病毒滴度的目的。
以上靶向性融合蛋白能通过对应的受体准确定位到免疫系统的多种细胞上， 包括不同发育阶段的T细胞、天然杀伤细胞、天然杀伤T细胞、CD8+记忆T细胞和 大多数造血细胞起源的细胞。这也是本发明所追求的一个目标。
在本发明的一个具体实施方案中用到的融合蛋白是IL2-IL7-SON2-XE，其是 一个双功能的分子，靶向性只是其功能的一部分，其另外一个功能是其SON2能 够和毒素表达重组体结合，并将其输送到靶细胞内部，从而实现毒素重组体的限 制性表达，准确地杀死被HIV/SIV感染的细胞。融合蛋白的这种功能是通过其中 的SON2肽段实现的。SON2肽段来自人源的DNA结合蛋白SON，是一段包含53 个氨基酸的片段(SEQ ID NO：2，其核苷酸编码序列见SEQ ID NO：1)，其中包 括30个阳性氨基酸和明确的核定位序列，试验结果显示，该片段可以结合本发明 构建的毒素表达重组体质粒。这样，在靶向融合蛋白的作用下，毒素表达重组体 就能被准确输送到靶细胞中。
本发明的另外一个重要的原理就是将毒素基因构建到HIV 5’LTR的下游，通 过HIV特异的反式作用因子Tat蛋白对HIV 5’LTR启动子Tar的准确调控来实现 毒素蛋白的限制性表达，从而清除受感染细胞。HIV的5’LTR可以划分为3个区 域，U3、R和U5区，其中包含了4个HIV-1转录调节有关的位点：位于R区(+ 1到+60)的转录激活反应元件(TAR，Transcription Activation Response)和位于 U3区的核心启动子序列(-87到-1)、核心增强子序列(-105到-79)和调节 序列(-454到-104)。在调节序列的-340到-184之间，又存在一个负调节元 件(NRE，Negative Regulatory Element)。该元件的缺失可以导致LTR介导的转录 和病毒复制的增强。当HIV整合进入宿主基因组后，病毒唯一的转录产物就起始 自病毒前体的5’末端的LTR而终止于3’末端LTR的poly A位点。该转录产物 既是病毒的基因组RNA，又是表达产物gag和pol的mRNA，而下游基因的进一 步表达有赖于对该初始转录产物的复杂剪切，从而产生一系列复杂的编码单个或 者多个不同蛋白的成熟mRNA。
在以上原理的指导下，本发明构建了以HIV5’LTR启动子(Tar)为基础的毒素基 因限制性表达系统，该系统只能被HIV特异的反式因子Tat所激活。所以只有当它 们进入受HIV感染的细胞后，毒素基因才会被表达出来进而杀死携带HIV的宿主细 胞，从而阻止HIV的繁殖，达到保护整个个体的目的。而在正常细胞中，由于不存 在HIV特异的反式因子Tat，HIV5’LTR启动子(Tar)不会被激活，毒素不会表达出来。 这样的设计实现了对毒素基因的准确严格调控，最大限度的消除了毒素基因的毒 副作用，提高了基因药物的安全性，同时，毒素蛋白是以被变换为其编码序列DNA 的形式进入人体的，避免了异源蛋白药物的免疫原性及其所引发的一系列问题， 而且药物不会被机体的免疫系统所清除。
本发明的一个具体实施方案中用到的毒素基因是商陆抗病毒蛋白(PAP， Pokeweed Antiviral Protein)，其是从美洲商陆Pokeweed(Phytolacca Americana)不 同组织和发育的不同时期分离出来的一种29kDa的核糖体失活蛋白 (Ribosomeinactivating protein，RIP)，其cDNA全长1249bp，编码262个氨基酸(SEQ ID NO：10，其DNA编码序列见SEQ ID NO：9)，为一种位点特异的RNA N-糖苷 酶。PAP的表达能够催化去除真核生物28S rRNA以及原核生物23S rRNA核糖体中 高度保守的α-sarcin/ricin(SR：α-八叠球菌/蓖麻蛋白)大沟中单个的腺嘌呤，这种脱 嘌呤作用可以造成蛋白合成的不可逆抑制。具体地讲，脱嘌呤可以破坏依赖延伸 因子-1(EF-1)的氨酰-tRNA与核糖体的结合，也破坏了依赖三磷酸鸟苷GTP的延伸 因子-2(EF-2)与核糖体的结合，从而抑制蛋白合成。肽键转移酶活性中心高度保守 的核糖体蛋白L3能够提供PAP结合位点，从而使PAP发挥脱嘌呤作用，将其底物 rRNA脱嘌呤。最近的研究也表明PAP能够高效地对含腺嘌呤的多聚核苷酸、单链 DNA以及病毒RNA、双链DNA脱嘌呤，从而表明其脱嘌呤活性不仅仅局限在rRNA 的SR环处。值得注意的是，本发明中采用的毒素基因编码的蛋白质均能通过诱导 靶细胞的凋亡发挥作用。这为本基因药物的安全性提供了重要的保障。
本发明使用的另外一种毒素蛋白为绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin， PE)，其对应的编码基因有三个主要的结构域：Domain Ia(氨基酸1-252)，Domain Ib(氨基酸365-404)，DomainII(氨基酸253-364)和DomainIII(氨基酸405-613)， 其中Domain Ia能结合细胞受体负责细胞定位，Domain II负责把37KD的毒素C端片 段转移到细胞质中，Domain III和Domain Ib能催化细胞正常蛋白合成延伸因子2 (EF2，Elongation Factor2)的ADP核糖基化(ADP-ribosylation)，阻止蛋白质合 成而导致细胞调亡。PE的C末端残基序列RDELK与内质网滞留序列KDEL功能相 似，将其突变为KDEL后可增强其毒性-杀伤力。这就是本发明的一个具体实施方 案中使用的突变改型的绿脓杆菌毒素第III结构域(PEIIImut)，其DNA序列见SEQ ID NO：11，氨基酸序列见SEQ ID NO：12。
在本发明使用的毒素基因还可以是编码白喉毒素、蓖麻毒素或其他对细胞具 有杀伤能力的来自人体、动植物或者微生物的或人工合成的蛋白质或其活性功能 区域的毒素基因。
在将上述融合蛋白非病毒载体和毒素基因限制性表达重组体组合后，本发明 进而验证了所述药物组合物在清除HIV方面的功能，特别是组合物 IL2-IL7-SON2-XE/p5’LTR-PAP在清除HIV方面的功能，本发明还同时构建和验证了 延伸毒素基因表达重组体p5’LTR-PEIIImut与融合蛋白系统组成的组合物 IL2-IL7-SON2-XE/p5’LTR--PEIIImut在清除HIV方面的功能。
作为阳性对照，本发明还应用构成型启动子SV40驱动毒素基因的表达，并组 装成蛋白质/DNA组合物IL2-IL7-SON2-XE/pSV40-PAP和 IL2-IL7-SON2-XE/pSV40-PEIIImut。此类组合物在进入正常细胞后毒素基因被表 达，正常细胞被杀灭。
本发明所述的药物组合物中还可以包括药学上可接受的赋形剂、防腐剂、pH 调节剂、缓冲剂等物质。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是注射剂等适于包含蛋白质和非病毒表 达载体的药物使用的剂型，优选注射剂。
本发明所述的药物组合物可以经静脉、经皮下、经肌肉、经腹腔、经髓鞘内 等胃肠外途径予以使用。
实验数据表明，本发明所述的包含细胞因子、DNA结合蛋白和HIV感染细胞 必需的辅助受体片段融合得到融合蛋白非病毒载体及带有限制性毒素基因表达的 重组体DNA的药物组合物。它既能有效杀灭受HIV/SIV感染的细胞并封闭、中和 失活游离在血液中的HIV/SIV病毒，但不杀伤正常细胞，实现了HIV/SIV感染细 胞的高特异性(准确靶向性)清除，毒副作用已被最小化，为清除艾滋病的病原 HIV提供了一种全新机理的药物。
附图说明
图1：载体pCW-IL-2-IL-7-SON2表达重组体的构建流程图。
图2：pET30a-IL-2-IL-7-SON2-XE克隆酶切鉴定。1：分子量标准DL2, 000；2～7：pET30a-IL-2-IL-7-SON2-XE NdeI BamHI双酶切结果，两条带 分别为载体和插入片段；8：载体pET30a NdeI BamHI双酶切结果；9：分子量标 准DL15,000。
图3：融合蛋白IL-2-IL-7-SON2-XE温控诱导。
(1)ET27S2X未诱导样品1
(2)ET27S2X诱导样品1
(3)ET27S2X未诱导样品2
(4)ET27S2X诱导样品2
(5)MBI蛋白中分子量标准(自上而下分别为116kD、66.2kD、45.0 kD、35.0kD、18.4kD、14.4kD)
(6)CW27S21 42℃诱导样品
图4：蛋白纯化流程示意图。
图5：IL-2-IL-7-SON2-XE纯化后样品检测。1.中分子量蛋白marker(自 上而下分别为116.0KD、66.2KD、45.0KD、35.0KD、25.0KD、14.4KD)；2. ET27S2X纯化后样品；3.ET27S2X纯化后样品。
图6：重组质粒pGL3-5’LTR的构建流程图。
图7：重组质粒pSV40-PAP的构建示意图。
图8：p5’LTR-PAP毒素基因表达重组体的构建流程图。
图9：CW27S21/DNA药物组合物对感染细胞的杀伤效果。
图10：ET27S2X/DNA药物组合物对感染细胞的杀伤效果。
图11：脂质体转染基因药物对感染细胞的杀伤效果.
图12：不同组合在感染细胞杀伤试验SIV后的病毒滴度。其中从左到右依次为：
1.SIV+正常CEMx-174细胞；
2.SIV+CEMX-174细胞+融合蛋白CW27S21组；
3.SIV+CEMx-17细胞+ET27S2X组；
4.SIV+CEMx-174细胞+脂质体单独组；
5.SIV+CEMx-174细胞+CW27S21/p5′LTR-PEIIImut；
6.SIV+CEMx-174细胞+CW27S21/p5′LTR-PEIIImut；
7.SIV+CEMx-174细胞+CW27S21/pSV40-PAP组合；
8.SIV+CEMx-174细胞+CW27S21/p5′LTR-PAP；
9.SIV+CEMx-174细胞+ET27S2X/pSV40-PEIIImut组；
10.SIV+CEMx-174细胞+ET27S2X/p5′LTR-PEIIImut；
11.SIV+CEMx-174细胞+ET27S2X/pSV40-PAP组合；
12.SIV+CEMx-174细胞+ET27S2X/p5′LTR-PAP组合；
13.SIV+CEMx-174细胞+脂质体/pSV40-PEIIImut组；
14.SIV+CEMx-174细胞+脂质体/p5′LTR-PEIIImut；
15.SIV+CEMx-174细胞+脂质体/pSV40-PAP组合；
16.SIV+CEMx-174细胞+脂质体/p5′LTR-PAP组合。(纵坐标代表滴度如200 代表1∶200)。
图13：CW27S21/DNA药物组合物对正常细胞的杀伤效果。
图14：ET27S2X/DNA药物组合物对正常细胞的杀伤效果。
图15：脂质体/DNA组合物对正常细胞的杀伤效果。
图16：中和试验结果。
图17：不同组合中和试验后的病毒滴度试验(纵坐标代表滴度如200代表 1∶200)。
图18：pET30a-IL-2-IL-7-SON2-XE构建流程图。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知， 在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入 本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说 明，均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例1编码重组靶向融合蛋白的基因IL2片段的获得
以含有C58S和C126S突变的重组人IL2基因(运用PCR技术把人IL2第58位的半 胱氨酸Cysteine的DNA编码序列改为丝氨酸Serine的编码序列；把其第126位的半胱 氨酸Cysteine的DNA编码序列也改为丝氨酸Serine的编码序列。这样，经重组质粒 的表达，从而获得IL2的衍生物，其第58位与第126位则均为丝氨酸。这样的IL2衍 生物只有结合其受体IL2R的能力、而无其他生物活性。)为模板，用如下引物扩增 突变的IL2基因片段：
(1)引物IL2L：gga ggt cga cca tat ggc acc tac ttc aag ttc，共33mer，含 限制性内切酶SalI和NdeI切点；(SEQ ID NO：21)
(2)引物IL2R：tca aga att cag acc cac cac cgc ccg atc cac cgc cac cag tta gtg ttg aga tg，共56mer，含限制性内切酶EcoRI切点。(SEQ ID NO：22)
此外，为了方便融合蛋白的复性和折叠，本发明的非病毒融合蛋白载体的各 个融合蛋白中间由编码柔性氨基酸的Linker(接头)连接起来，并且在Linker的下 游加入了酶切位点，所用到的linker分为两种：Linker1和Linker2，相应的氨基酸序 列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示，其编码序列如SEQ ID NO.：19和SEQ ID NO.：20所示。在IL2PCR扩增的引物中，本发明加入了Linker1，Linker1下游的酶切 位点为EcoRI。另外，所用的上游引物中还引入了SalI和NdeI，用以酶切克隆PCR 反应后的片段。PCR反应条件为：预变性94℃4min；变性94℃0.5min；复性55 ℃1min；延伸72℃1min；到第2步，28个循环；延伸72℃6min；保存于4℃。 本发明后续PCR反应均参照此反应进行，各参数可能需要根据情况调整，不再一一 列出。PCR使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)高保真的Pfu， 以琼脂糖凝胶电泳，玻璃奶法回收PCR产物中447bp的目的条带，所得产物再经SalI 和EcoRI酶切回收得到可用于克隆的片段，琼脂糖凝胶电泳证实获得了目的片段。
实施例2编码重组靶向融合蛋白的基因IL7片段的获得
本发明使用的IL7基因来自于人类基因组(其DNA编码序列见SEQ ID NO：3)， 其中的密码子主要是根据真核生物偏爱的密码子使用频率来编码，要在原核生物 中表达IL7需要对其密码子进行改造。根据IL7基因中的密码子使用频率特点，本发 明使用了全基因合成的方法来改造IL7的密码子，使其符合宿主大肠杆菌的密码子 偏爱性，改造的IL7的核苷酸序列见SEQ ID NO：4，氨基酸序列见SEQ ID NO：5，。 此外，在合成时还在IL7的3’端融合了Linker2的编码序列以及HindIII酶切位点，并 置于载体pMD18-T中。在该实施例中用到的引物序列如下：
pL1：ggggcatatggattgtgatattgaaggtaaagatg 35bp(含NdeI位点)(SEQ ID NO：23)
pL2：ttaggtaccgtgttctttagtgcccatc 28bp(含KpnI位点)(SEQ ID NO：24)
pL3：gtgttctttagtgcccatcaaaattttattccaacaagtttttatctcttgtaatag 57bp(SEQ ID NO： 25)。
实施例3编码重组靶向融合蛋白的基因IL7-SON2片段的获得
本发明以包含酶切位点EcoRI的newIL7L为上游引物(SEQ ID NO：26)， pSON1(SEQ ID NO：27)、pSON2(SEQ ID NO：28)、pSON3(SEQ ID NO：29)、 pSON4(SEQ ID NO：30)、pSON5(SEQ ID NO：31)(包含酶切位点BamHI)为 下游引物，经过5轮扩增得到含IL7编码序列、SON2编码序列以及Linker2共684bp 的融合片段，琼脂糖凝胶电泳结果表明获得了目的产物。此融合片段的上、下游 分别引入了酶切位点EcoRI、BamHI。将该融合片段TA克隆至pGEM-T测序。测序 结果显示克隆片段正确，阳性克隆命名为pT-IL7-SON2。
实施例4编码重组靶向融合蛋白的基因IL2-IL7-SON2片段的获得
以EcoRI和BamHI酶切实施例3中的质粒pT-IL7-SON2，回收酶切片段。以SalI 和BamHI双酶切pBSSK载体，回收3.0kb的长载体片段。将上述两片段和实例1中的 SalI和EcoRI酶切回收得到的片段按酶连比例混合，加入相应的缓冲液(buffer)和 连接酶，16℃过夜连接，转化，得到克隆pBS-IL2-IL7-SON2，筛选阳性克隆并酶 切鉴定得到质粒DNA。用NdeI和BamHI酶切该阳性克隆质粒DNA，进行凝胶电泳， 回收1110bp的片段。以NdeI和BamHI酶切质粒pCW111-XRSON，电泳后回收4.8kb 的载体片段，最终将上述两片段连接转化，获得阳性克隆质粒pCW-IL2-IL7-SON2。 琼脂糖凝胶电泳和测序结果证实获得了序列完全正确的重组质粒。质粒构建示意 图见图1。
实施例5编码重组靶向融合蛋白的基因XE片段的获得以及原核表达质粒 pET30a-IL2-IL7-SON2-XE的构建
设计扩增XE的引物XEU、XED，序列如下：
引物XEU：tta tct cga gaa cgt ttc cga agc tg 26bp(SEQ ID NO：32)
引物XED：aac ggg atc ctt atc act gga act gga aaa c 31bp (SEQ ID NO：33)
其中上游引物XEU中包含限制性酶切位点XhoI，下游引物XED中包含了强终 止密码子(TGATAA)和限制性内切酶BamHI的酶切位点。以XEU、XED为引物 从质粒pCWXRS(即重组质粒pCW-XE-RN-SON，请构建方法参见中国专利 ZL200310115629.2。)中的XE模版扩增出XE，得到大小为100bp的小片段。小片段 回收后以XhoI、BamHI双酶切，回收酶切产物。同时设计扩增IL2-IL7-SON2的下 游引物IL27SXD(SEQ ID NO：34)，该引物中含有XhoI的酶切位点，并删除了原 先序列中存在的终止密码子。以引物IL2L、IL27SXD扩增pCW-IL2-IL7-SON2上 的IL2-IL7-SON2片段，扩增片段回收后以NdeI、XhoI双酶切，电泳切胶回收目的 条带11kb。同时以NdeI、BamHI双酶切表达载体pET30a，回收载体片段5.3kb。将 所回收的3个片段按照酶连比例以10μl体系连接，连接产物转化大肠杆菌(DH5α)， 在含卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上筛选阳性克隆。小量制备抗性克隆的质 粒DNA，双酶切证实插入片段IL2-IL7-SON2-XE共1.2kb，大小与融合基因相符， 阳性克隆命名为pET30a-IL2-IL7-SON2-XE。琼脂糖凝胶电泳(见图2)和测序结果 证实获得了序列完全正确的重组体。构建流程图见图18。
实施例6重组蛋白IL2-IL7-SON2-XE的表达及初步鉴定
将经鉴定后的阳性重组表达质粒pET30a-IL2-IL7-SON2-XE转化宿主菌BL21 (DE3)，涂布于卡那霉素的LB培养板上，37℃培养10-16h。挑取单菌落到5ml含 卡那霉素(50μg/ml)的LB培养液中，37℃、200rpm，培养12-14小时。按1∶100 的比例分别转接上述培养物各于两个5ml卡那抗性的LB管，37℃、200rpm，培养 3-4小时，使菌液的OD600值达到0.4-0.6。将上述其中一个转接管加入1mM IPTG进 行诱导，另一管不诱导作为对照。两管继续于37℃、200rpm培养3-4小时。诱导完 毕后，取1ml菌液离心，去上清，在菌体沉淀中加入20μl 5×上样缓冲液，80μl ddH2O，充分悬浮菌体后100℃水浴中煮5min，12,000rpm离心2min，取上清进行 SDS-PAGE电泳。电泳先以8-12mA进行，待上样缓冲液进入分离胶后调整为 15-20mA，电泳约3小时后以0.25％考马斯亮蓝R250染液染胶4小时。染色完毕后脱 色至蛋白带型清晰可见，分析蛋白表达结果见图3。
IL2-IL7-SON2-XE融合基因共1197bp(SEQ ID NO：17)，编码397个氨 基酸(SEQ ID NO：18)，其分子量预测为45.3kDa，根据该融合基因的特点，在 本发明中，其编码的蛋白又被命名为融合蛋白ET27S2X(ET代表表达载体pET30a， 27分别代表IL2和IL7，S2代表SON2基因，X代表XE片段)。经过激光扫描测 定，该融合蛋白表达的目的条带为菌体蛋白总量的20.1％。
实施例6重组蛋白IL2-IL7-SON2-XE的大量制备
融合蛋白IL2-IL7-SON2-XE的诱导过程如下：将工程菌接种于5ml带卡那抗性 的LB培养基中，37℃振摇培养过夜。按5％接种量将过夜培养物接种于100ml LB抗 性培养基中，37℃培养2-4小时。再以1-2％接种于有500ml LB(含相应抗生素)的 2L三角瓶中，在37℃下振摇培养至OD600约为0.4。加入终浓度1mM的IPTG，37℃ 继续振摇诱导3-4小时。4000g离心、收集菌体，称重湿菌体。
收获菌体后，马上裂解菌体，提取包涵体。首先，用200-300ml 3％TritonX-100 溶液洗涤菌体，搅拌器上搅拌30分钟，6000gX15分钟离心收集菌体。然后用缓冲 液I将菌体悬浮，10ml-50ml缓冲液/1g湿菌体，缓冲液I为：50mmol/LTris.Cl (pH8.5-9.0)、2mmol/LEDTA、100mmol/LNaCl、0.5％TritonX-100、溶菌酶1mg/ml。 随即用搅拌器在室温下搅拌，使得悬浮液因溶菌酶的作用而粘稠。将粘稠的悬浮 液置于冰上超声破菌。为防止炭化，超声功率不宜过大，在玻璃烧杯中进行较好， 超声波探头深入液面大于3厘米，距杯底2厘米左右。每次超打10秒，间隔15秒， 重复20-50次(视菌体浓度而定)至菌体不再粘稠为止。6000g离心15分钟，收集沉 淀。接着用缓冲液II彻底搅拌悬浮沉淀，缓冲液II为：50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)、 2mmol/L EDTA、5％TritonX-100。超声处理悬浮液30次。6000g离心15分钟收集沉 淀，沉淀即为包涵体。取少量包涵体用少量8M尿素或7M盐酸胍溶解，进行 SDS-PAGE电泳分析。其余包涵体可冻存于-20℃或溶解后进行切胶回收。
实施例7融合蛋白IL2-IL7-SON2-XE的纯化、复性和定量
完成包涵体提取后，通过凝胶切割法将包涵体样品中的目的蛋白进行初步纯 化回收。经过电洗脱、酸性丙酮沉淀，氮气吹干蛋白沉淀，得到蛋白干粉。用2M 尿素溶解干粉，装入透析袋内用复性透析液透析，去除样品中的尿素及甘氨酸等 小分子，得到初步纯化复性的蛋白。整个纯化步骤流程如图4，融合蛋白 IL2-IL7-SON2-XE，纯化后的检测结果见图5。
蛋白纯化后的冻干粉以含2M尿素的透析缓冲液溶解后，装入处理过的透析袋 中，置于4度复性24小时，每隔8个小时换一次透析液。复性所用的透析缓冲液配 方如下：50mM Tris、0.5mM EDTA、50mM Nacl、10％甘油、1％精氨酸、pH8.5。
透析复性完毕后，使用超滤的方法对蛋白进行浓缩。然后用紫外吸收法和BCA 法测定了两种融合蛋白的浓度，见表1：
表1，非病毒载体融合蛋白浓度测定
并预测了两种融合蛋白的相关理化特性的理论数据，见表2：
表2，非病毒载体融合蛋白理化性质
此外，本发明测定了纯化后蛋白N端15个氨基酸序列，并对融合蛋白纯化后 等电点进行了分析，结果证实氨基酸序列正确，等电点与理论等电点无显著差异。
实施例7受HIV 5’LTR启动子驱动毒素PAP基因重组体构建
1)HIV5’LTR启动子的扩增和克隆
本发明扩增了HIV 5’LTR中包含有与各种重要正转录调节因子，如Tat、Sp1、 NFκB、AP-1、USF和NF-AT等作用的U3、R区域共536bp的片段作为本试验中调控 商陆抗病毒基因PAP表达的限制性启动子。所用重组质粒为pNL43E-L+。(该质粒为 含HIVNL43病毒株全基因组的质粒pcDNA3.0，其Env[E]基因读码框移码，luc+[L] 插入Env基因。)它被用于扩增HIV的5’LTR启动子。
以特异性上游引物LTRU06112(含KpnI酶切位点)(SEQ IDNO：35)、下游引 物LTRD(SEQ ID NO：36)扩增质粒模板pNL43E-L+(含HIVNL43病毒株全基因 组)，引物序列如下：
引物LTRU06112：ccg tat ggt acc tgg aag ggc taa ttt ggt ccc 33bp(含KpnI位点)
引物LTRD：tgg cgg atc ctg cta gag att ttc cac act gac 33bp(含BamHI位点)
PCR扩增得到大小为640bp的片段。扩增片段以KpnI、HindIII双酶切回收530bp 的目的片段，同时以KpnI、HindIII双酶切载体pGL3-Basic Vector(Promega)，回收 载体片段，将回收的大小片段按片段：载体的摩尔比为3∶1的比例在10μl的连接体 系连接，连接产物转化DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上筛选 抗性的阳性克隆。小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性酶切证实质粒插入片段 大小与5’LTR大小一致，阳性克隆命名为pGL3-5’LTR，pGL3-5’LTR的克隆构建过 程见图6。
2)商陆毒素(PAP)基因重组体克隆构建
商陆抗病毒蛋白(SEQ ID NO：10)对应的编码序列(SEQ ID NO：9)包括 起始密码子和终止密码子共792bp，翻译的蛋白产物为29kDa共262个氨基酸的单链 蛋白。以包含NcoI酶切位点的特异性引物PAPU(SEQ ID NO：37)和包含酶切位 点XbaI的特异性引物PAPD(SEQ ID NO：38)。运用含商陆毒素PAP编码序列的质 粒pET21a-PAP(含有适于原核表达PAP编码序列的pET21a质粒)。扩增PAP编码序 列。其的PCR产物为792bp的片段，PCR产物以NcoI、XbaI双酶切，回收酶切产物， 同时以两酶NcoI、XbaI酶切上述的阳性克隆pGL3-LTR以及pGL3-Control载体，将 两个载体中位于NcoI、XbaI酶切位点之间的荧光素酶编码序列去掉，分别回收两 个载体片段，将回收的载体片段分别与PCR双酶切回收产物酶连，转化，筛选阳性 克隆。小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性酶切证实质粒插入片段大小与PAP 编码基因的大小一致，与pGL3-LTR载体连接的PAP阳性克隆命名为p5’LTR-PAP， 与pGL3-Control载体连接的PAP阳性克隆命名为pSV40-PAP，酶切和测序结果证实 获得的序列完全正确。pSV40-PAP、p5’LTR-PAP的构建过程分别见图7、图8。
实施例8非病毒载体蛋白质/毒素基因DNA组合物的制备
1)非病毒载体蛋白质/毒素基因DNA的比例确定
本发明所用融合蛋白中的DNA结合部分为SON2片段(其编码序列见SEQ ID NO：1，氨基酸序列见SEQ ID NO：2)。所使用的融合蛋白为IL2-IL7-SON2-XE蛋 白质，其特点为既作为靶向介导蛋白，又作为DNA结合蛋白。所用质粒DNA为毒 素基因表达型重组体p5’LTR PAP和pSV40-PAP。在此根据DNA结合蛋白与质粒 DNA所带电荷摩尔数比为1∶1制备转染用组合物。蛋白质与DNA的电荷计算见表3。
表3，非病毒载体融合蛋白和DNA分子电荷计算表
*CW27S21为本发明所述融合蛋白质IL2-IL7-SON2-XE的中间体形式， 即融合蛋白IL2-IL7-SON2，(其中的CW代表表达载体pCW111，27分别代表 IL2和IL7，S2代表SON2基因，1为克隆编号)。
2)非病毒载体蛋白质/毒素基因DNA组合物的制备
根据上表蛋白质与质粒DNA所带电荷数推知，转染1μg毒素基因表达质粒 pSV40-PAP理论上所需的非病毒载体融合蛋白IL2-IL7-SON2--XE为5.56μg。转染 1μg毒素基因表达质粒p5’LTR-PAP，理论上所需的非病毒载体融合蛋白 IL2-IL7-SON2-XE为5.68μg。根据上述的理论比例，确定凝胶阻滞中DNA和融合蛋 白质的质量比例，从而确定试验中DNA和蛋白质的最佳比例和用量。取复性后的 蛋白产物溶于RPMI 1640培养基中，然后根据设定的比例缓慢滴加至含有质粒DNA 的RPMI 1640溶液中，使带正电荷的组分能均匀接近质粒DNA，同时蛋白质与 DNA的质量比覆盖几个比例范围，37℃保温60min，转移到4℃过夜后用于转染。 凝胶阻滞结果显示融合蛋白IL2-IL7-SON2-XE与DNA的质量比为7∶1或者是高于 7∶1时可以达到最佳的阻滞效果。
实施例9非病毒载体蛋白质/毒素基因DNA组合物对感染细胞的杀伤试验。
本发明所有生物学活性试验-对本药物组合物的药效学评价，均使用SIV以替 代HIV。这是因为，广泛的基础研究结果表明，SIV与HIV在基因组构成与生物学 行为两个方面都是十分相似的。因此，从SIV试验结果可以对所研究的药物做出药 效学评价。而且，当前国内外在动物体内进行的对治疗艾滋病新药的药效学评价， 绝大多数用的是受SIV感染的猴。
1)试验细胞株CEMx-174
本发明所用CEMx-174细胞株(由中国医学科学院实验动物研究所提供)用 RPMI 1640完全培养基进行培养，培养条件为5％的CO2，培养温度37℃。
(1).复苏：取出保存在液氮中的细胞，迅速放入37～42℃水浴中融化。1000rpm 离心5min后弃去上清，加入含有10％胎牛血清的完全培养基，轻轻吹打细胞，移 入25cm2培养瓶中，加入完全培养基5mL，在37℃、5％CO2的孵箱中培养12h 后细胞换液，继续培养。
(2).计数：用酒精冲洗细胞计数板，与盖玻片一起擦净。吸取细胞悬液，从盖 玻的边缘滴加1-2滴细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙。计算四个边 缘角的细胞数，压中线者只计左侧和上方细胞，右侧和下方细胞不计算在内，然 后按如下的公式计算：
细胞数/毫升悬液＝4大格细胞总数/4×104×稀释倍数
(3).传代：传代细胞培养2-3天后，细胞培养液颜色变成金黄色即可以传代。 将培养瓶竖立，弃去陈旧上层培养基，打散细胞，按1∶3～1∶4移入新培养瓶中，再 加入5mL培养基，在37℃、5％CO2的孵箱中培养。
(4).冻存：细胞状态好时要及时冻存。细胞冻存在-196℃的液氮中，储存的时 间几乎是无限的。通常都是采取慢冻速融的方法，选对数增长期的细胞，在收集 细胞前24小时前换液一次。按常规方法把细胞制备成悬液，计数，使细胞达到 5×106/ml左右密度，离心(500-1000RPM、10min)后去上清，先用等体积的含 10％DMSO的培养液与细胞悬液混合均匀后加入至细胞冻存管中，约1.5ml/管， 细胞冻存数应为107/ml左右。用专用的细胞冻存器或手动方法冻存制备好的细胞， 按-1℃/min的速度，在30-40min内将细胞温度下降到液氮表面温度，放置30min 后，浸入液氮中保存。
(5).感染CEMx-174细胞
取2ml SIV病毒液添加于已去溶液的1×106CEMx-174细胞内细胞内，混匀，置 4℃吸附1小时，离心去溶液，添加10ml新鲜RPMI1640营养液，置37℃CO2培养箱 内孵育，每天换一次液，3-4天后检测病变情况。检测采用、间接免疫荧光试验(IFA)， 细胞用PBS洗3次，常规涂片固定，用gp120单抗作间接免疫荧光试验，计算500个 细胞中SIV抗原阳性细胞百分率，反复感染使病变达50％左右。
2)感染细胞杀伤试验的分组与实施
细胞杀伤试验共分为20组，受试细胞为已被SIV感染的CEMx-174的细胞， 每组3个平行试验。测试药物包括单独融合蛋白、单独DNA以及DNA-蛋白质组 合物、脂质体、脂质体/DNA，每种药物各分3个剂量，以测试的DNA量计即2μg、 4μg、6μg，蛋白则为根据最佳比例计算出的相应量，融合蛋白ET27S2X分别为 14μg、28μg、42μg。此试验采用受SIV感染的CEMx-174细胞为对照组，用以观 察CEMx-174细胞在感染状态下的生长情况。除了论证ET27S2X和pSV40-PAP和 p5’LTR-PAP分别形成的组合物的功能外，本发明还对所述非病毒载体融合蛋白及 毒素表达系统的延伸形式，即，融合蛋白CW27S21和毒素表达重组体 pSV40-PEIIImut和p5’LTR-PEIIImut的生物学功能进行了研究，以期作为补充来显 示本发明所述组合物的功能。具体分组情况如下：
(1).对照组：不加任何药物处组的受感染细胞组，用作试验对照；
(2).CW27S21组：非病毒载体融合蛋白CW27S21单独作用于细胞的处理组；
(3).ET27S2X组：非病毒载体融合蛋白ET27S2X单独作用于细胞的处理组；
(4).脂质体组：各质粒所对应的脂质体量(按1μgDNA需2.5μl脂质体计算)， 作为脂质体转染细胞的对照组；
(5).pSV40-PEIIImut组：单独pSV40-PEIIImut，绿脓杆菌外毒素第III结构域突 变型的组成型表达质粒；
(6).p5’LTR-PEIIImut组：单独p5’LTR-PEIIImut，绿脓杆菌外毒素第III结构域 突变型的可控表达质粒；
(7).pSV40PAP组：单独pSV40-PAP，商陆毒素基因的组成型表达质粒；
(8).p5’LTR-PAP组：单独p5’LTR-PAP，商陆毒素基因的可控表达质粒；
(9).CW27S21/pSV40-PEIIImut组：非病毒载体CW27S21和绿脓杆菌外毒素第 III结构域突变型的组成型表达质粒组成的组合物；
(10).CW27S21/p5’LTR-PEIIImut组：融和蛋白CW27S21和绿脓杆菌外毒 素第III结构域突变型的可控表达质粒组成的组合物；
(11).CW27S21/pSV40-PAP：融和蛋白CW27S21和商陆毒素基因组成型表 达质粒组成的组合物；
(12).CW27S21/p5’LTR-PAP：融和蛋白CW27S21和商陆毒素基因可控表达 质粒组成的组合物；
(13).ET27S2X/pSV40-PEIIImut：非病毒载体融和蛋白ET27S2X和绿脓杆 菌外毒素第III结构域突变型的组成型表达质粒组成的组合物；
(14).ET27S2X/p5’LTR-PEIIImut：融和蛋白ET27S2X和绿脓杆菌外毒素第 III结构域的可控表达质粒组成的组合物；
(15).ET27S2X/pSV40-PAP：融和蛋白ET27S2X和商陆毒素基因组成型表达 质粒组成的组合物；
(16).ET27S2X/p5’LTR-PAP：融和蛋白ET27S2X和商陆毒素基因可控表达 质粒组成的DNA-蛋白组合物；
(17).脂质体/pSV40-PEIIImut组：脂质体和绿脓杆菌外毒素第III结构域突 变型的组成型表达质粒组成的组合物；
(18).脂质体/p5’LTR-PEIIImut组：脂质体和绿脓杆菌外毒素第III结构域突 变型的可调控表达质粒组成的组合物；
(19).脂质体/pSV40-PAP：脂质体和商陆毒素基因组成型表达质粒组成的组 合物；
(20).脂质体/p5’LTR-PAP：脂质体和商陆毒素基因可控表达质粒组成的组合 物。
本试验所使用的培养板为灭菌的一次性24孔细胞培养板(Costar公司产品)， 每孔加入的细胞数为2.0×105个，即浓度为4.0×105个/ml的细胞悬浮液0.5ml。 在所用的SIV感染的CEMx-174细胞中，感染率为76.8％，因此体系中仍然含有 部分未感染的正常细胞，但是这些未感染的细胞仍然可以在试验进行中被SIV感 染，也可以与已被感染的细胞形成合胞体。48小时后，于显微镜下观察细胞生长 情况。吸取100μL上清进行病毒滴度检测。同时取少量细胞涂片作荧光染色，观 察计算各组被感染细胞的感染率。然后转移200μL至96孔板中，利用MTT法检 测剩余活细胞的数目，各组结果均以OD值表示，计算平行试验的平均值，并以 标准差的形式反应数值的波动范围。所得OD值和感染率结果记录如表4。
表4：20种被试样品对受SIV感染的CEMx-174细胞的杀伤作用的试验结果
说明：
(1)对照为被SIV感染的CEMx-174细胞；
(2)每组有3个平行孔，以减少孔间误差；
(3)感染率即为荧光计数百分比。
根据本试验的设计，最终的结果需要用杀伤率来评估各药物组合的有效性， 因此本发明权衡了各因素对试验结果的影响，得出了计算各药物组的杀伤率的方 法(不包括脂质体转染的4个处理组)：首先以对照组存活感染细胞数(由对照 OD均值乘以对应的感染率表示)减去各组3个平行试验的存活感染细胞平均数(由 OD均值乘以对应的感染率表示)，由此得出被杀死的感染细胞数(以OD差值表 示)，再将上述被药物杀死的细胞数与所用细胞总数(由对照组OD减去调零组OD 表示)比较，最终得到各药物组的杀伤率(图9，图10)。
对于以脂质体处理的4个组，则以单独脂质体处理的处理组作为公式中的对 照，从而计算出相应的杀伤率(图11)。此外，本发明还利用统计学的方法，计算 了不同药物组的各个剂量和对照组相比的P值，以衡量各剂量的结果在统计学上 的可靠程度。
试验结果显示，单独的非病毒载体融合蛋白和单独的毒素基因表达型重组体 对受SIV感染的细胞均无杀伤作用(P＞0.20，未列出)。同时，单独使用脂质体2000 (Invitrogen)处理受SIV感染的细胞的结果表明脂质体有一定的杀伤细胞的功能。 这说明脂质体有毒副作用。本发明在使用自行研制的蛋白质非病毒载体/DNA组合 物时，不使用脂质体，排除了脂质体的毒副作用。这是使用工程化的融合蛋白作 为非病毒载体的一个好处。
同时，各非病毒载体融合蛋白/毒素基因组合物均对受SIV感染的细胞有很强 的杀伤作用。其中ET27S2X/pSV40-PEIIImut和ET27S2X/pSV40-PAP的杀伤效果尤 其显著。但这两个运用组成型启动子pSV40的组合物均同时对未受SIV感染的正 常细胞也具有强烈的杀伤作用。这就是毒副作用，因此是不可取的。
重要的是，运用细胞特异性启动子HIV 5’LTR驱动毒素基因表达的新型重组 体的试验结果。在ET27S2X/p5’LTR-PEIIImut和ET27S2X/p5’LTR-PAP这两个组合 中，含6μg/mlDNA的组合物，杀伤效率分别为54.97％和54.46％。杀伤率与组合 物的剂量有依赖关系。两种毒素蛋白(PEIIImut和PAP)的杀伤效果非常类似。 而且这两种组合物对未受感染的正常细胞无杀伤作用。这就实现了毒素基因限制 性准确靶向表达的设计的目的。这是本发明所追求的最主要的目标。
3)杀伤试验后的病毒滴度试验
融合蛋白处理后培养48h的细胞混匀(中和试验的细胞要在7天以后再进行滴度 试验)，吸取500μl于一96孔板中，用以计数取样。剩下的培养液置37℃、CO2培养 箱中40min，细胞沉于底部后，吸取20μl培养上清液于一无菌的96孔板中，以180μl 培养基进行10倍稀释。分别取稀释液100μl于新的无菌96孔板中，加等量的 2.0×105/ml CEMx-174细胞100μl，依次倍比稀释，使稀释比例最终分别为分别为10、 20、40、80、160、320、640、1280、2560、5120、10240、20480倍，置37℃、CO2培养箱(95％空气、5％CO2)中孵育，每48小时更换一半新鲜培养基。7天后观察 结果，以细胞融合形成的多核大细胞为指标确定滴度。
感染细胞杀伤试验的病毒滴度试验结果见图12。
实施例10靶向基因药物对正常细胞的杀伤试验
基因药物的安全性是各方面广泛关注的话题，为了评估基因药物对正常细胞 是否安全，本发明设计了上述药物组合物对未受SIV感染的正常细胞的作用的试 验，以评估上述药物组合物对正常细胞的影响。与感染细胞的杀伤试验一致，本 发明采用了非病毒载体CW27S21、ET27S2X与毒素重组质粒PEIIImut、PAP组成 的DNA-蛋白质组合物，并验证了它们对正常细胞的是否具有杀伤作用。正常细胞 杀伤试验共分为20组，分组情况同受感染细胞杀伤试验组，受试细胞为正常 CEMx-174细胞，每组3个平行试验。测试药物包括单独融合蛋白、单独DNA以 及DNA-蛋白质组合物、脂质体、脂质体/DNA，每种药物各分3个剂量，以测试 的DNA量计即为2μg、4μg、6μg，蛋白质则为根据最佳比例计算出的相应量。试 验结果见表5。
表5：蛋白DNA组合物对正常CEMx-174细胞的作用结果(调零组OD值＝ 0.074)
说明：
(1)对照为正常CEMx-174细胞；
(2)每组有3个平行孔，以减少孔间误差。
利用正常CEMx-174细胞进行的药物杀伤评估试验结果(图13、图14、图15) 显示，由重组蛋白构成的非病毒载体和毒素基因表达系统的DNA质粒单独应用于 正常细胞没有表现出杀伤效果(P＞0.20，未列出)，这说明本发明所述的非病毒重 组蛋白载体本身是安全的，不仅如此，携带有毒素基因的表达系统在单独应用于 正常细胞时也没有显示出毒性。与感染细胞杀伤试验类似，脂质体对正常细胞也 表现了一定的毒性。在两种非病毒重组蛋白载体和不同的毒素基因表达系统组合 的药物对正常细胞杀伤反应中，两种重组蛋白的效果没有显著的区别，但是由SV40 和LTR启动子驱动的两个毒素表达系统的试验显示了明显的差异。其中利用SV40 启动子构建的毒素表达系统杀伤细胞的作用非常明显(P＜0.05)，当使用最大的剂 量时，CW27S21/pSV40-PEIIImut、CW27S21/pSV40-PAP、ET27S2X/pSV40-PEIIImut 和ET27S2X/pSV40--PAP组合药物的杀伤效率分别达到了60.70％、64.26％、64.67％ 和58.05％。对应的，采用HIV 5’LTR构建的表达系统的杀伤作用与对照基本没有 区别(P＞0.05)。这些数据充分说明利用HIV 5’LTR严格调控毒素基因的选择性表 达确实发挥了作用，利用这种策略设计的基因药物是安全可靠的。同时，利用脂 质体转染两种毒素表达系统所进行的细胞杀伤试验结果与上述结论基本一致，这 为进一步利用这种策略实施基因治疗提供了依据。另外，脂质体/DNA的杀伤试验 所用到的对照和重组蛋白/DNA试验的对照不同，前者的对照为对应剂量的脂质体 单独转染的结果。还必须指出的是，此处杀伤率的计算公式与病毒感染的细胞杀 伤试验的计算公式是一致的，但是由于这里所用到的为正常细胞，所以不存在病 毒感染率的问题。
实施例11毒素基因在细胞内表达的直接证据
为了验证不同启动子调控下毒素基因的表达情况，本发明利用RT-PCR的方法 检测了正常细胞进行各药物组处理后毒素基因的表达。分别抽提以非病毒载体 CW27S21分别与上述4种表达型重组质粒装配成的4种组合物和非病毒载体 ET27S2X分别与上述4种表达型重组质粒装配成的另外4种组合物处理CEMx-174 细胞后的总RNA。
1)细胞总RNA提取(Trizol法)：
裂解细胞：取经本DNA/蛋白质组合物处理后的24孔板中的细胞2ml，细胞量 约为(5-10)×10E6个，离心去培养基，加入1ml TRIZOL，充分吹打使其完全裂解。 加入0.2ml氯仿，用手剧烈振荡15秒，再在15-30℃放置2-3min。在2-8℃用不超 过12000g的转速离心15min，从而使离心混合物分成下层的酚-氯仿相，中间相和 上层的无色透明液相。上层的液相体积约为初始TRIZOL试剂的60％。
沉淀RNA：将上层的液相移入一新的离心管中，用异丙醇来沉淀RNA，每1ml TRIZOL试剂加入0.5ml异丙醇。15-30℃放置10min后，在2-8℃用不超过12000g 的转速离心10min。
漂洗RNA：去除上清。用75％乙醇漂洗RNA沉淀，每1ml TRIZOL试剂至少 加入1ml 75％乙醇。振荡混匀样品后，在2-8℃用不超过7500g的转速离心5min。 溶解RNA。将RNA沉淀暴露于空气中干燥，将沉淀溶解于适量的无RNase水中。 取少量测量260nm处的吸光度确定RNA的浓度，其它保存于-70℃中备用。
表6，抽提RNA定量
2)cDNA第一条链合成：
(1).取4μg RNA，加入1μl DNase I(10U，RNase-Free，NEB)，10X DNase I buffer，37℃反应10min，然后于75℃，10min灭活DNase I，置于冰上备用。此步 骤能防止RNA中可能存在的DNA污染；
(2).配制42μl的dNTP(28μl)和随机引物(14μl)混合物，并以每管3μl分 装至0.5mlEP管中，同时加入相应的RNA和DEPC-treated水，从而得到12μl的 混合物；
(3).在使用之前，剧烈votex 5×cDNA buffer并且短暂离心；
(4).根据下表在冰上配制cDNA synthesis mixture，混匀；
(5).随机引物合成第一链的条件如下，25℃进行10min，随后置于52℃(或 50-65℃)20-50min；
(6).然后以85℃、5min终止反应；
(7).终止反应后加入1μl RNase H在37℃作用20min；
(8).合成的cDNA可以置于-20℃保存，或者直接用于PCR反应。
3)毒素基因的特异性引物PCR扩增cDNA-
以cDNA为模板，PEIIImut特异性上下游引物扩增，条件如下：95℃、5’； (95℃、40”；60℃、1’；72℃、1’30”)×20；72℃、5’；4℃、10’；
以cDNA为模板，PAP特异性上下游引物扩增，条件如下：95℃、5’；(95℃、 40”；52℃、40”；72℃、1’)×10；(95℃、40”；59℃；40”；72℃、1’)×20；72℃、 5’；4℃、10’。
4)扩增完毕后电泳检测PCR产物：
扩增所使用的引物如下：
PAP扩增克隆
PAPU tactcacggtaccccatggtgaatacaatcatctac 36bp (含KpnI NcoI位点)
PAPD aggcaagctttctagattatcaagttgtttggcagctcc 39bp(含HindIII XbaI位点)
PEIIImut扩增克隆
PEIIIU atcggaattcaccatggaactcggcgacggcgg 33bp EcoRI NcoI(SEQ ID NO：39)
PEIIID cgataagctttctagaattacagttcgtccttcggcg 37bp HindIII XbaI(SEQ ID NO：40)
RT-PCR检测特异扩增带显示了目标插入物的存在。
实施例12各组融合蛋白-毒素基因重组体组合物对SIV的中和作用
1)中和试验方法
取经过稀释的20TCID50病毒上清液加入24孔细胞培养板中。将已配制的蛋 白样品和蛋白/DNA组合物0.5ml分别加入上述24孔板的病毒溶液中。每种剂量 作3个平行组，混匀，置超净台中30min。
向上述24孔板中加入均匀的CEMx-174悬浮细胞培养物，每孔0.5ml，细胞 数为2.0×105。再向每孔中补加1ml1640不含血清的培养基，总体积到达2ml，DNA 每孔的转染量为2μg、4μg、6μg。将这些分装好的24孔板在二氧化碳孵箱中(95％ 空气、5％CO2)静置6小时。小心吸去1ml上层细胞生长培养基，每孔补加入1ml 新鲜培养基。置于二氧化碳孵箱中(95％空气、5％CO2)于37℃孵育。每48小时 更换1ml新鲜培养基。7天后进行MTT法测定各孔的OD值和病毒滴度等实验。
中和试验分组与实施
本实验分13组，每组3个平行试验，每种蛋白-DNA组合物分为3个剂量， 按DNA计为2μg、4μg、6μg。分组情况如下：
正常对照组，正常对照组为不加任何处理因素(如SIV和各种蛋白质-DNA组 合物)的CEMx-174细胞组，用作正常生长对照；
SIV+正常的CEMx-174细胞，整个试验的对照组；
1640培养基调零组；
CW27S21组：融合蛋白CW27S21+SIV+CEMx-174细胞处理组；
ET27S2X组：融合蛋白ET27S2X+SIV+CEMx-174细胞处理组；
CW27S21/pSV40-PEIIImut：CW27S21/pSV40-PEIIImut+SIV+CEMx-174细胞 处理组；
CW27S21/p5’LTR-PEIIImut：CW27S21/p5’LTR-PEIIImut+SIV+CEMx-174细 胞处理组；
CW27S21/pSV40-PAP：CW27S21/pSV40-PAP+SIV+CEMx-174细胞处理组；
CW27S21/p5’LTR-PAP：CW27S21/p5’LTR-PAP+SIV+CEMx-174细胞处理组；
ET27S2X/pSV40-PEIIImut：ET27S2X/pSV40-PEIIImut+SIV+CEMx-174细胞 处理组；
ET27S2X/p5’LTR-PEIIImut：ET27S2X/p5’LTR-PEIIImut+SIV+CEMx-174细 胞处理组；
ET27S2X/pSV40-PAP：ET27S2X/pSV40-PAP+SIV+CEMx-174细胞处理组；
ET27S2X/p5’LTR-PAP：ET27S2X/p5’LTR-PAP+SIV+CEMx-174细胞处理组。
处理7天后，于显微镜下观察细胞生长情况，各组分别取20μl上清做滴度实 验，并取一定量的细胞作荧光涂片。以MTT法测活细胞数进行方差分析和统计分 析，以感染对照组中存活细胞，计算出各组合物对CEMX-174细胞的中和作用。
ET27S2X蛋白组以及ET27S2X蛋白/DNA组合物处理组的细胞生长状况明显 好于受SIV感染对照组细胞，正常细胞数相对较多，死亡细胞较感染对照组少。 同时MTT法测量溶液OD值。所得数据显示，保护作用最为显著的是融合蛋白 ET27S2X，2、4、6μgOD数作对照DNA剂量所对应的融合蛋白即14、28、42微 克单独对细胞的保护作用为8.71％，20.63％，35.84％；ET27S2X/pSV40-PEIIImut 3 个剂量对细胞的保护作用依次为5.74％、10.85％、29.54％；ET27S2X/p5’LTR-PE IIImut3个剂量对细胞的保护作用依次为11.29％、15.53％、27.25％； ET27S2X/pSV40-PAP3个剂量对细胞的保护作用依次为7.13％、23.31％、31.99％； ET27S2X/p5’LTR-PAP3个剂量对细胞的保护作用依次为4.36％、17.38％、22.62％。 上述各组药物与空白对照组相比，存活细胞数显著增多，即被SIV感染的细胞数 显著减少。同一种药物对SIV的中和作用，具有剂量依赖关系。试验设计分组见 表7，实验结果见图16。
表7，中和试验分组以及结果
说明：
(1)每组剂量有3个平行孔，以减少孔间误差，每个孔用MTT法测定3次；
(2)“NC”表示正常CEMx-174细胞，“NC+SIV”表示经SIV吸附CEMx-174 细胞；
(3)剂量列中的数值2、4、6μg，以DNA计；
(4)显著性水准为*p＜0.05。分别与(正常细胞+SIV)组比较；
(5)数值计算方法，见正文说明。
中和试验的目的在于验证ET27S2X蛋白中的XE片段在中和病毒感染方面的 实际功能和效果，理论上，该片断能够封闭病毒表面的gp120的V3loop区域，从 而阻止病毒感染细胞。此外，本发明希望利用中和试验获得更多基因药物在抑制 病毒感染和杀伤感染细胞方面的信息。首先，本发明确定了评估中和效果的数学 计算方法，将最终的细胞浓度(由试验组OD值表示)减去对照组的细胞浓度(由 SIV感染的细胞OD值表示)，得到由于药物保护而多出来的细胞数目，再将对照 组的OD值减去调零组OD值(用相应的培养基)得到总的细胞数，再将上述数据 相比较，得出中和试验的保护率。
试验结果表明，单独应用于中和实验时，没有XE片段的CW27S21蛋白3个 剂量(换算成DNA的量分别为2、4、6微克)的保护率分别为0.67％、2.83％、 0.34％，统计显示和对照没有差别(P＞0.20)；而包含XE片断的ET27S2X重组蛋 白的保护率则分别达到了8.71％、20.63％、35.84％，和对照差异显著(P＜0.05)。 这说明根据本发明所设计的中和试验的方法，XE片段发挥了封闭病毒表面gp120 的作用。
除此之外，本发明还将非病毒载体融合蛋白和毒素表达系统和结合起来，按 照中和试验的方法进行了对比，SV40启动子驱动的毒素表达系统和LTR启动子驱 动的毒素表达系统在试验中显示了区别，推测这可能是由两个启动子发挥作用的 时效有关系，因为SV40是组成型表达的启动子，一旦被转染进入细胞即表达毒素 蛋白杀死细胞，而LTR由于需要来自病毒的调控元件，所以必须等到病毒入侵细胞 后并产生了这些元件后才能驱动毒素蛋白表达，这样就使试验中的细胞数量发生 了变化，并最终体现在保护率的差异上。
2)中和试验后的病毒滴度试验
病毒滴度试验方法如实例11中感染细胞杀伤试验后的病毒滴度测定。病毒滴 度试验结果显示：对照组的病毒滴度为1∶1280，ET27S2X组3个剂量(14、28、 42μg)处理组的病毒滴度分别为1∶320、1∶160、1∶20；ET27S2X/pSV40-PEIIImut3 个剂量处理后的病毒滴度依次为1∶640、1∶320、1∶40；ET27S2X/p5’LTR-PEIIImut3 个剂量处理后的病毒滴度依次为1∶320、1∶160、1∶40；ET27S2X/pSV40-PAP3个剂 量处理后的病毒滴度依次为1∶320、1∶80、1∶20；ET27S2X/p5’LTR-PAP3个剂量处 理后的病毒滴度依次为1∶640、1∶160、1∶40，中和试验结果图17。
实施例13验证毒素基因对细胞的凋亡作用
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及内环境 的稳定等方面起着重要的作用。为论证本试验中两种毒素表达重组体对细胞凋亡 的靶向诱导作用，用脂质体2000分别转染两种质粒pSV40-PAP、p5’LTR-PAP至未 被感染的CEMx-174细胞，通过流式细胞仪检测凋亡发生。在24孔培养板中每孔 接种4-6×105个细胞，以脂质体2000(LipofectamineTM2000，Invitrogen)分别转染 2μg质粒DNA pSV40-PAP、p5’LTR-PAP，并以单纯脂质体2000作对照，转染44 小时后流式检测凋亡发生。如前所述，本发明还以毒素基因重组体pSV40-PEIIImut 和p5’LTR-PEIIImut作为延伸系统，验证了毒素基因对细胞的调亡诱导作用。
Propidum iodide(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋 亡晚期的细胞和死亡细胞，PI能够透过而使其染红因而将Annexin-V与PI匹配使 用，就可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。试验步骤：
(1)调整待测细胞的浓度为5×105-1×106个/ml；
(2)取1ml细胞，1000rpm 4℃离心10min，弃上清；
(3)加入1ml冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮；
(4)1000rpm 4℃离心10min，弃上清；
(5)重复步骤3、4两次；
(6)对于贴壁细胞，先用胰酶消化，再用PBS洗涤；
(7)将细胞重悬于200μl的binding buffer；
(8)加入10μl Annexin V-FITC和5μl的PI，轻轻混匀，避光室温反应15min或 4度反应30min；
(9)加入300μl binding buffer，立即上机检测。
检测结果表明与单独脂质体对照相比，毒素表达质粒pSV40-PAP可以诱导细 胞凋亡。流式检测组成型启动子控制的毒素表达质粒pSV40-PAP转染后的细胞中， 碘化丙锭PI和Annexin V/FITC双染呈阳性的细胞为11.7％，高于对照的双染阳性 细胞6.5％。pSV40-PAP跟脂质体对照相比，其诱导细胞凋亡的发生率为23.8％， 表现出了明显的诱导凋亡的作用；由HIV 5’LTR控制的毒素基因重组质粒 p5’LTR-PAP跟脂质体对照相比，无显著差异，表明上述调控型质粒没有诱导细胞 凋亡。同样的，对延伸的两种质粒pSV40-PEIIImut和p5’LTR-PEIIImut的检测结果 表明，即由SV40启动子控制的毒素基因重组质粒pSV40-PEIIImut，其诱导细胞凋 亡的发生率为25.2％，也表现出了明显的诱导凋亡的作用，由HIV 5’LTR控制的 毒素基因重组质粒p5’LTR-PEIIImut跟脂质体对照相比，也无显著差异，表明该质 粒没有诱导细胞凋亡。上述结果说明毒素PEIIImut和PAP均能通过诱导细胞凋亡 发挥作用，而且，由HIV 5’LTR控制的限制性毒素基因表达系统对正常细胞没有 影响，体现了毒素基因重组质粒限制性表达的严谨。