技术领域
本发明属于有机合成领域，具体涉及罗丹明B衍生物及其制备方法。
背景技术
铜是人体重要的微量元素，在线粒体的呼吸、铁的吸收、酶的氧化还原等 不同的生理过程中起着十分重要的作用。但若体内的铜离子代谢平衡遭到破坏， 有可能引起代谢紊乱和诸多疾病，如胆固醇升高，动脉弹性降低，血压升高。 此外，由于铜离子大量地开采和广泛地使用，使得铜也成为一个重要的金属污 染物。鉴于其对生命和环境的重要性，科学家们一直致力于采用选择性比色和 荧光传感探针实现对铜离子在生物和环境系统中检测的研究。
近年来，荧光分子探针技术由于具有灵敏度高、操作简单、成本低等特点， 已经成为检测金属离子污染的重要手段。荧光增强传感材料可减少检测错误， 对复杂体系检测准确，可同时用多种检测物对不同分析物进行检测。罗丹明及 其衍生物作为开/关形式的荧光探针，具有较高的荧光量子产率，较大的摩尔消 光系数，在可见光区域内具有较长的发射和吸收波长等特点，在铜离子和汞离 子识别的领域得到越来越广泛的重视。
发明内容
基于酰基吡咯与罗丹明B生成的罗丹明B酰腙通常情况下只能与金属铜离 子能够形成稳定的配合物，故含吡咯环的罗丹明酰腙衍生物具有较好的二价铜 离子识别性能。本发明主要目的在于提供一种可检测二价铜离子的灵敏度高、 选择性好的金属离子荧光探针；另一目的是提供该荧光探针的制备方法和应用。
本发明的技术方案是，一种基于罗丹明B衍生物的荧光探针，所述罗丹明 B衍生物具有如下结构式：
本发明还提供了一种基于罗丹明B衍生物的荧光探针的制备方法，具体制 备方法如下：S1：将2，4-二甲基-5-甲酰基-吡咯-3-甲酸首先用无水乙醇溶解， 再加入罗丹明B酰肼；
S2：将S1所得产品在常压下回流，反应时间22-24h；
S3：将S2所得产品冷却至室温后，有白色固体析出，减压过滤，取滤渣；
S4：将S3所得产品用无水乙醇洗涤，得到基于所述罗丹明B衍生物的荧光 探针。
本发明还提供了上述罗丹明B衍生物的荧光探针一种用途，即在作为二价 铜离子荧光探针方面的应用，特别是在作为检测细胞内二价铜离子的荧光探针 中的应用。
本发明还提供了一种用于检测细胞内二价铜离子的荧光探针，所述荧光探 针主要由上述罗丹明B衍生物组成。
本发明通过用吡咯亚胺基修饰改性罗丹明B制备罗丹明类荧光探针，能选 择性的与二价铜离子作用，使含有二价铜离子的溶液由无色变为红色，具有荧 光增强效应，可实现裸眼辨别检测，也可通过紫外吸收和荧光光度法进行分析， 更为重要的是可以用于细胞内铜离子的检测，具有快速、简便、灵敏度高、选 择性强的特点。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的荧光探针的1HNMR谱图；
图2为本发明实施例1制得的荧光探针的质谱谱图；
图3为本发明实施例1制得的荧光探针与二价铜离子作用生成配合物的质 谱谱图；
图4为本发明实施例1制得的荧光探针的乙腈/水(体积比1∶1)溶液(5× 10-6mol/L)对不同金属离子(Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Cu2+，Fe3+，Hg2+，K+， Mg2+，Na+，Pb2+，Zn2+，5×10-6mol/L)的荧光光谱图；
图5为本发明实施例1制得的荧光探针的乙腈/水(体积比1∶1)溶液(5× 10-6mol/L)对不同金属离子(Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Cu2+，Fe3+，Hg2+，K+， Mg2+，Na+，Pb2+，Zn2+，5×10-6mol/L)的紫外吸收光谱图；
图6为本发明实施例1制得的荧光探针的乙腈/水(体积比1∶1)溶液(5× 10-6mol/L)滴定不同浓度Cu2+的荧光光谱光图；
图7在Hela细胞中，荧光探针与Cu2+的荧光成像图；Hela细胞用5μM荧 光探针培育30分钟后加入Hg2+，继续培育30分钟后使用OlympusFV500-IX70 激光共聚焦显微镜进行荧光成像。
其中：a为荧光探针明场下的成像图；b为荧光探针荧光成像图；c为荧光探针 明场图和荧光图叠加后的图片；d为荧光探针+Cu2+明场下的成像图；e为荧光探 针+Cu2+荧光成像图；f为荧光探针+Cu2+明场图和荧光图叠加后的图片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，本发明实施例采用的 试剂和原料为常规市场购买得到。
实施例1：
罗丹明B衍生物的合成
将0.167g2，4-二甲基-5-甲酰基-吡咯-3-甲酸溶于10mL无水乙醇中，再 加入0.46g罗丹明B酰肼，常压下回流搅拌24h，冷却至室温后析出大量固体， 减压过滤，将滤渣用无水乙醇洗涤得到白色固体即为目标产物，目标产物的产 率为73％。
采用核磁共振仪对制得的罗丹明B衍生物进行核磁共振分析，计算结果如 下：
1HNMR(400MHz，CDCl3)；δ(ppm)：9.55(s，1H，NH)，8.04(s，1H， CH＝N)，7.94-7.96(m，1H，Aryl-H)，7.44-7.46(m，2H，Aryl-H)，7.22-7.24(m，1H，A ryl-H)，7.08-7.10(m，1H，Aryl-H)，6.45-6.46(s，2H，Aryl-H)，6.39-6.40(s，2H， Aryl-H)，6.21-6.24(m，2H，Aryl-H)，3.28-3.31(q，8H，4CH2)，2.43(s，3H，CH3)，2. 09(s，3H，CH3)，1.11-1.14(t，12H，4CH3)，具体核磁图谱见图1；
质谱：ESI-MS：m/z＝606.3029for[M+H]+，具体质谱谱图见图2。
实施例2
将0.167g2，4-二甲基-5-甲酰基-吡咯-3-甲酸溶于15mL无水乙醇中，再 加入0.46g罗丹明B酰肼，常压下回流搅拌22h，冷却至室温后析出大量固体， 减压过滤，将滤渣用无水乙醇洗涤得到白色固体即为目标产物，目标产物的产 率为73.8％。
实施例3
罗丹明B衍生物对二价铜离子的光学性质测定
将上述制得的罗丹明B衍生物作为荧光探针在乙腈/水(体积比1∶1)介质 中配制成摩尔浓度为5×10-6mol/L的溶液，分别在含摩尔浓度为5×10-6mol /L的Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Cu2+，Fe3+，Hg2+，K+，Mg2+，Na+，Pb2+，Zn2+等金属离子的溶液中加入等量的上述荧光探针溶液，其中，Cu2+能够催化罗丹明 B衍生物荧光探针水解生成配合物罗丹明B酸，产生红色荧光，该产物的质谱 谱图具体见图3。
1、发射光谱的测定
浓度为5×10-6mol/L的罗丹明B衍生物荧光探针的乙腈/水(体积比1∶1) 溶液中分别加入Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Cu2+，Fe3+，Hg2+，K+，Mg2+，Na+，Pb2+， Zn2+等浓度为5×10-6mol/L的金属离子，采用荧光分光光度计对其分别进行荧 光光谱分析(激发波长为350nm)，记录575nm处的荧光强度值，所得的荧光 光谱图见图4。通过图4可以看出，本发明制得的罗丹明B衍生物作为荧光探 针对二价铜离子的响应时间短，强度高，可用于二价铜离子的快速检测。365nm 紫外灯激发下，二价铜离子反应液中快速出现明显的橘红色荧光，而本发明制 得的罗丹明B衍生物对其它金属离子如Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Fe3+，Hg2+， K+，Mg2+，Na+，Pb2+，Zn2+等无明显荧光响应。
2、吸收光谱的测定
浓度为5×10-6mol/L的罗丹明B衍生物荧光探针的乙腈/水(体积比1∶1) 溶液中分别加入Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Cu2+，Fe3+，Hg2+，K+，Mg2+，Na+，Pb2+， Zn2+等浓度为5×10-6mol/L的金属离子，采用紫外可见光光度计对制得的罗丹 明B衍生物进行紫外吸收光谱分析，所得的紫外吸收光谱图见图5。本发明制 得的罗丹明B衍生物与二价铜离子作用在550nm处产生明显的吸收峰，同时产 生肉眼明显可见的粉红色，可用于二价铜离子的快速检测。而本发明制得的罗 丹明B衍生物对其它金属离子如Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Fe3+，Hg2+，K+，Mg2+， Na+，Pb2+，Zn2+等无明显紫外吸收响应。
乙腈/水(体积比1∶1)溶液中，摩尔浓度为5×10-6mol/L的罗丹明B衍 生物荧光探针对二价铜离子具有较高的选择性响应。通过图6荧光滴定光谱可 以计算得到Cu2+检出限达3.16×10-6mol/L，线性范围为0.2-1.5×10-5mol/L， 因此本发明制得的罗丹明B衍生物可用于二价铜离子的荧光定量检测。
实施例4
罗丹明B衍生物荧光探针在细胞内铜离子的检测实验
Hela细胞用5×10-6M的上述罗丹明B衍生物荧光探针培育5小时后加入 Cu2+，继续培育5小时后使用OlympusFV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光 成像，获得在Hela细胞的荧光成像图，具体如图7所示，其中a为上述荧光探 针明场下的成像图；b为上述荧光探针荧光成像图；c为上述荧光探针明场图和 荧光图叠加后的图片；d为上述荧光探针+Cu2+明场下的成像图；e为上述荧光探 针+Cu2+荧光成像图；f为上述荧光探针+Cu2+明场图和荧光图叠加后的图片。Hela 细胞中加入上述罗丹明B衍生物只产生非常弱的荧光，而再加入二价铜离子后， 荧光强度明显增加。故本发明制得的罗丹明B衍生物可用于细胞中二价铜离子 的荧光探针。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范 围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换， 均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。