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1、(10)授权公告号 CN 101665489 B (45)授权公告日 2012.12.05 CN 101665489 B *CN101665489B* (21)申请号 200910099405.4 (22)申请日 2009.06.11 C07D 407/04(2006.01) A61K 31/357(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 25/14(2006.01) A61P 25/16(2006.01) A61P 21/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61P 43/00(2006.01) (73)专利权人 大理学院 地址 671。
2、003 云南省大理市大理古城学府路 (72)发明人 赵昱 王晓雨 姜北 冯玉冰 李校堃 巫秀美 曾苏 郝小江 罗建蓉 刘光明 (54) 发明名称 一类脱氢水飞蓟宾三烷基醚及其制备方法和 药物用途 (57) 摘要 本发明涉及一类脱氢水飞蓟宾三烷基醚及其 制备方法和药物用途。具体而言， 本发明涉及 3 位、 7 位和 20 位取代的脱氢水飞蓟宾烯丙三醚和 1- 丁烯三醚衍生物， 以及该类化合物的制备方法 和药物用途。该类化合物具有显著抑制自由基诱 导的脂过氧化物生成的活性 ； 强效的对抗自由基 引起的大鼠肾上腺嗜铬瘤 PC12 细胞损伤作用， 说 明其对保护脑细胞组织抗氧化和脑神经抗氧化、 防治老。
3、年性痴呆症等神经退行性疾病有积极作 用。药效学结果表明该类脱氢水飞蓟宾三醚化合 物可以预期用于制备防治神经退行性疾病类药物 的用途。 (51)Int.Cl. 审查员 杨志培 权利要求书 2 页 说明书 11 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 11 页 1/2 页 2 1. 具有式 （I） 所示结构的脱氢水飞蓟宾醚化合物或其可药用盐 ： 其中， R 是烃基， 该烃基是指含 3-5 个碳的饱和或不饱和的直链烃基或支链烃基 ； 所述 式 （I） 化合物是 10， 11 位同时为 R 构型的脱氢水飞蓟宾醚化合物和 10， 11 位同时为 S 构型 。
4、的脱氢水飞蓟宾醚化合物组成的混合物。 2. 根据权利要求 1 所述的式 （I） 化合物， 它们是 ： 化合物 I-a ： 3,7,20- 三烯丙基 - 脱氢水飞蓟宾醚 ； 化合物 I-b ： 3,7,20- 三 -1- 烯丁基 - 脱氢水飞蓟宾醚 ； 3.一种权利要求1所述的式 （I） 化合物的制备方法， 其特征是 ： 水飞蓟宾在碱催化下与 过量的烃基卤素反应制备而得 ； 水飞蓟宾是指非对映体的水飞蓟宾 A 和水飞蓟宾 B 的混合 物 ； 反应温度为 20至 200， 反应时间为 10 分钟至 48 小时 ； 其中烃基是指含 3-5 个碳的 饱和或不饱和的直链烃基或支链烃基。 4. 根据权利要。
5、求 3 的制备方法， 其中碱是无机碱或有机碱 ； 过量的烃基卤素是指参与 反应的烃基卤素的摩尔数是参与同一反应的水飞蓟宾之摩尔数的三倍以上。 5. 根据权利要求 4 的制备方法， 其中碱是指碳酸钾 ； 烃基卤素是指烃基溴。 6. 根据权利要求 1 的式 （I） 所示结构的脱氢水飞蓟宾醚化合物或其可药用盐在制备防 治神经退行性疾病的药物中的应用。 7. 根据权利要求 6 所述的用途， 其特征在于所述的神经退行性疾病是指老年性痴呆 症、 帕金森氏症、 亨廷顿舞蹈病、 蛋白感染素病或肌萎缩性脊椎侧索硬化。 8. 一种用于防治神经退行性疾病的药物组合物， 其含有治疗有效量的作为活性成分的 根据权利要求。
6、 1 的式 （I） 所示结构的脱氢水飞蓟宾醚化合物或其可药用盐和可药用辅料。 9. 根据权利要求 8 所述的药物组合物， 其特征在于所述的神经退行性疾病是指老年性 权 利 要 求 书 CN 101665489 B 2 2/2 页 3 痴呆症、 帕金森氏症、 亨廷顿舞蹈病、 蛋白感染素病或肌萎缩性脊椎侧索硬化。 权 利 要 求 书 CN 101665489 B 3 1/11 页 4 一类脱氢水飞蓟宾三烷基醚及其制备方法和药物用途 技术领域 0001 本发明涉及有机合成和医药技术领域。 具体而言， 本发明涉及3位、 7位和20位烷 基取代的脱氢水飞蓟宾三醚类衍生物的制备方法及其药物用途， 该类化合。
7、物具有显著抑制 自由基诱导的脂过氧化物生成的活性 ； 强效的对抗双氧水引起的大鼠肾上腺嗜铬瘤 PC12 细胞损伤作用， 即对模拟脑神经细胞的 PC12 细胞有抗氧化损伤保护作用 ； 说明其对保护脑 细胞组织抗氧化和脑神经抗氧化、 防治老年性痴呆症等神经退行性疾病有积极作用。药效 学结果表明该类脱氢水飞蓟宾双醚化合物可以预期用于制备防治神经退行性疾病类药物 的用途。 背景技术 0002 近年来， 老年性痴呆症(Alzheimer s Disease， 简称AD， 又称早老性痴呆)在我国 发病率开始逐年增高， 给国民生活带来极大的负面影响， 给患者家庭和社会保障体系带来 了巨大的负担， 国内外政府。
8、和药业均将越来越多的研究投入到这种神经退行性疾病的成因 和治疗研究中， 取得了较好的经济效益和社会效益。 0003 神经退行性疾病是极为可怕的一系列毁灭性的疾病， 其可以毁坏中枢神经系统功 能， 导致多种认知缺陷和 / 或行动缺陷。就目前的医疗技术而言， 此类疾病是致残率及致死 率均高的不可治愈性疾病， 已构成现代社会尤其是老龄化社会的一大健康隐患。老年性痴 呆症、 帕金森氏症(Parkinson s Disease)、 亨廷顿舞蹈病、 蛋白感染素病(priondisease)、 肌萎缩性 ( 脊椎 ) 侧索硬化都遭遇到大量的神经元丢失。 0004 脂质过氧化是自由基作用于多不饱和脂肪酸的产物。
9、， 含量与自由基的生成正相 关， 由于机体有抗氧化的酶系及非酶系的保护作用， 使自由基不断产生又不断被清除。随 着年龄的增长， 体内的抗氧化剂不断下降， 清除自由基的能力逐渐减弱， 脂质过氧化作用则 增强， 脂质过氧化产物增多。脂质过氧化是 AD 一个重要的发病机理 ( 文献 ： Busciglio 等， Nature， 1995， 378， 776-9)。研究指出 ： 在与 AD 近似乃至一致的退行性疾病唐氏综合症中， 神经元发生凋亡而死亡， 这种凋亡便是由脂质过氧化引起。使用过氧化氢酶和自由基清除 剂可以阻止这种脂质过氧化造成的神经元凋亡。 0005 此外， 活性氧能造成细胞膜双磷脂层的变。
10、化和损伤， 有些双磷脂层的破坏直接 造 成 AD 的 病 因 ( 文 献 ： Nitsch， R.M.， Proc Natl Acad SCiUSA， 1992， 89， 1671-1675)。 Markesbery 的研究显示 ： 脂质过氧化可以造成细胞膜双磷脂层的降解从而导致 AD 患者发 病 (Markesbery， W.R.， Free Radic Bio Med， 1997， 23， 134-147)。因此， 使用抗氧化剂和铁 离子螯合剂都可以减缓脂质过氧化和 AD 的进程。现在常见的抗氧化制剂有维生素 C、 维生 素 E、 银杏制剂 EGb761、 褪黑激素、 黄酮和胡萝卜素类。由。
11、于市场的需要， 更多的抗氧化剂诸 如雌激素类也开始活跃。 0006 衰老也是老年性痴呆的一大诱因， 而衰老基本上都是由自由基攻击细胞开始的。 老年性痴呆患者的脑组织解剖检查发现许多自由基攻击的痕迹， 如线粒体 DNA 和核 DNA 损 伤、 蛋白氧化损伤、 脂质过氧化、 产生深度糖基化最终产物 (AGEs) 等。自由基攻击 - 淀粉 说 明 书 CN 101665489 B 4 2/11 页 5 样蛋白使之聚合形成纠结及结块， 或者生成多肽自由基。抗氧化剂如自由基清除剂可以减 缓自由基对 - 淀粉样蛋白的毒性损伤。 0007 自由基是一种十分有害的物质， 能导致细胞死亡或不可逆的伤害。除了引起。
12、衰老 外， 还导致神经退行性发生和神经元死亡。该类活性氧 (reactive oxygen species， 简称 ROS) 可对细胞主要成分如细胞核、 线粒体 DNA、 细胞膜和细胞质蛋白质造成损伤。实验发 现 ： 神经元对自由基非常敏感， 此类自由基和活性氧的产生一旦出现失衡， 神经元细胞很可 能遭到持续损伤并造成神经退行性疾病诸如老年性痴呆。 0008 众多的抗自由基天然产物除了前述的维生素 C、 维生素 E、 银杏制剂 EGb761、 褪黑 激素、 黄酮和胡萝卜素外， 水飞蓟素也是少数几个在临床上广泛应用的药物之一。 三十多年 的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性 ( 参阅 Flo。
13、ra K. 等， Am.J.Gastroenterol， 1998， 93， 139-143 ； Saller R. 等， Drugs， 2001， 61(14)， 2035-2063)。水飞蓟素中水飞蓟宾 (Silybin) 含量最多， 活性也相对最高。故关于水飞蓟宾之药效学研究最为广泛。国家食 品与药品监督管理局制订的国家药品标准水飞蓟素一栏中， 要求含水飞蓟素以水飞蓟宾计 算， 不得少于 68。该天然药物的主要作用有抗自由基活性、 保护肝细胞膜、 促进肝细胞的 修复和再生、 抗肿瘤作用。 0009 水飞蓟宾类化合物具有确切的疗效， 故而以此天然药物为先导化合物 (Lead compoun。
14、d) 进一步开发， 寻找水飞蓟宾类新的衍生物， 使其能够具有更高或者更新的药理活 性， 以期获取自主知识产权的新药， 实属必要。如我们前期报道的在水飞蓟宾的 B 环上引入 甲氧基就显著提高了其清除超氧阴离子自由基的活性 杨雷香， 赵昱等，“Synthesis and Antioxidant Properties Evaluation of Novel SilybinAnalogue” ， Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry， 2006， 21(4)， 399-404.。 0010 根据碳链越长、 碳数越多则亲脂性越强的设计原。
15、则， 同时其亲脂性得到加强， 有利 于提高其通过血脑屏障、 在脑部脂质体层直接发挥药效的功力， 我们设计了新的 3 位、 7 位 和 20 位取代的脱氢水飞蓟宾三醚， 并以比乙烯基长的含 3-5 个碳的烷基作为首选取代基 团。以期其作用靶点更倾向于亲脂性的脑脂质体， 从而对老年性痴呆等脑神经退行性疾病 起到预防及治疗的作用。 0011 鉴于至今尚无相关文献报道增强了引入上述亲脂性基团后的脱氢水飞蓟宾三醚 类是否能提高其抗氧化活性， 为了证明此类新型结构的化合物抗神经退行相关之药效学活 性， 本发明还用了多种抗氧化损伤药效学模型对我们设计合成出的化合物进行了检验和药 效学评价。首先， 测试了 H。
16、2O2诱发 PC12 细胞的抗氧化损伤能力。目前比较肯定的用于研究 神经退行性疾病 ( 主要是胆碱能神经系统 ) 的体外细胞模型主要有 3 种 ： (1) 原代培养的 海马、 皮层、 基底前脑神经细胞 ； (2) 大鼠肾上腺嗜铬瘤 PC12 细胞 ； (3) 小鼠 HT22 海马细胞 株。其中， 由于 PC12 细胞更容易培养且由于其细胞均一性而成为神经科学离体研究中的重 要工具细胞， 并用于研究多种神经系统疾病， 如 AD、 帕金森病等。双氧水 (H2O2) 是一种强氧 化剂， 它能穿透细胞膜使细胞内反应性氧自由基产生增加。 因此， 我们通过测试经H2O2处理 后 PC12 细胞的死亡情况来。
17、评价新合成的抗氧化剂保护神经细胞抗氧化损伤的能力。 0012 其次， 本发明人还研究了设计合成出的化合物对大鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作 用。采用非酶促之维生素 C-Fe2+系统诱导大鼠肝匀浆产生脂质过氧化产物丙二醛 (MDA)， MDA 能与硫代巴比妥酸 (TBA) 反应， 产物在 532nm 处有最大吸收， 通过 MDA 量的变化可以间 说 明 书 CN 101665489 B 5 3/11 页 6 接反映化合物对肝匀浆脂质过氧化的抑制作用。 0013 上述药效学研究证实本发明的化合物有强效抑制非酶系统自由基诱导的脂质过 氧化物生成的活性， 并且对模拟脑神经细胞的 PC12 细胞有抗氧化损伤。
18、和神经元保护作用。 说明设计合成的 3 位、 7 位和 20 位烷基取代脱氢水飞蓟宾三醚类化合物对保护脑细胞组织 抗氧化和脑神经抗氧化、 防治老年性痴呆症有积极作用， 从而可以预期用于制备该类药物 的用途， 还可以预期发展成为防治其他神经退行性疾病如帕金森氏症 (PD)、 亨廷顿舞蹈病、 蛋白感染素病(prion disease)、 肌萎缩性(脊椎)侧索硬化等的药物或药物组合物。 由此 完成了本发明。 发明内容 0014 本发明的目的是提供一种具有式 (I) 所示结构的 3 位、 7 位和 20 位烷基取代的脱 氢水飞蓟宾三醚化合物或其可药用盐 ： 0015 0016 其中， R 是含 3-5。
19、 个碳的烷基， 该烷基是指饱和或不饱和的直链烷基或支链烷基 ； 10， 11 位同时为 R 构型或同时为 S 构型。 0017 优选的式 (I) 化合物是 ： 0018 0019 化合物 I-a ： 3， 7， 20- 三烯丙基 - 脱氢水飞蓟宾醚 ； 0020 0021 化合物 I-b ： 3， 7， 20- 三 -1- 烯丁基 - 脱氢水飞蓟宾醚。 说 明 书 CN 101665489 B 6 4/11 页 7 0022 本发明还提供了一种制备式 (I) 化合物的方法， 其特征是 ： 水飞蓟宾在碱催化下 与过量的烷基卤素反应制备而得 ； 反应温度为 20至 200， 反应时间为 10 分钟。
20、至 48 小 时 ； 其中过量烷基卤素是指参与反应的烷基卤素的摩尔数是参与同一反应的水飞蓟宾之摩 尔数的三倍或三倍以上 ； 水飞蓟宾是指非对应体的水飞蓟宾 A 或水飞蓟宾 B 或它们的混合 物。碱是无机碱或有机碱， 烷基卤素优选烷基溴。 0023 本发明的另一目的是提供了式 (I) 所示结构的 3 位、 7 位和 20 位烷基取代的脱 氢水飞蓟宾三醚化合物或其可药用盐在制备防治神经退行性疾病药物中的应用 ； 所述的 神经退行性疾病是指老年性痴呆症 (AD)、 帕金森氏症 (PD)、 亨廷顿舞蹈病、 蛋白感染素病 (priondisease)、 肌萎缩性 ( 脊椎 ) 侧索硬化等病种。 0024。
21、 本发明的又一目的是提供了一种用于防治神经退行性疾病包括老年性痴呆症 (AD)、 帕金森氏症 (PD)、 亨廷顿舞蹈病、 蛋白感染素病 (prion disease)、 肌萎缩性 ( 脊椎 ) 侧索硬化病的药物或药物组合物， 其含有治疗有效量的作为活性成分的式 (I) 所示结构的 3 位、 7 位和 20 位烷基取代的脱氢水飞蓟宾三醚化合物或其可药用盐和可药用辅料。 0025 本发明的再一目的是提供了式 (I) 化合物或其可药用盐用于制备防治肝脑脂质 过氧化有关的其他生理改变或疾病药物的用途 ； 尤其是用于防治自由基诱导之脂过氧化物 生成引起的急 / 慢性肝损伤类疾病、 炎症， 也包括由脂质过。
22、氧化引起的自身免疫性疾病、 放 射治疗后遗症、 肿瘤、 心肌缺血、 心肌肥厚、 衰老、 变态反应、 动脉粥样硬化症药物的用途。 0026 本发明的又一目的是提供了一种用于防治自由基诱导之脂过氧化物生成引起的 急 / 慢性肝损伤类疾病、 炎症， 也包括由脂质过氧化引起的自身免疫性疾病、 放射治疗后遗 症、 肿瘤、 心肌缺血、 心肌肥厚、 衰老、 变态反应、 动脉粥样硬化症的药物或药物组合物， 其含 有治疗有效量的作为活性成分的式 (I) 所示之 3 位、 7 位和 20 位烷基取代的脱氢水飞蓟宾 三醚化合物或其可药用盐和可药用辅料。 0027 本发明的有益之处在于 ： 提供了 3 位、 7 位和。
23、 20 位取代的脱氢水飞蓟宾三醚衍生 物， 并用药理实验揭示了该类化合物具有抗脂质过氧化， 保护脑神经细胞减轻氧化损伤能 力。这些衍生物均显示出比水飞蓟宾优越的抗氧化活性， 从而可预期发展成为新型抗氧化 剂类药物及防治包括老年性痴呆症在内的神经退行性疾病药物的制药用途。 具有潜在的巨 大社会效益和经济效益。本发明中式 (I) 化合物由天然药物为母体制备而得， 方法简单、 步 骤短， 污染小， 适于节能减排大环境下的产业化。 具体实施方式 0028 为了更好地理解本发明的实质， 下面首先用实施例的形式说明化合物制备的过 程， 实施例给出了化合物的部分物理和化学及波谱学数据。 必须说明， 本发明的。
24、实施例是用 于说明本发明而不是对本发明的限制。 根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于 本发明要求保护的范围。除非另有说明， 本发明中的百分数是重量百分数。 0029 实施例 1 ： 化合物 I-a 即 3， 7， 20- 三烯丙基 - 脱氢水飞蓟宾醚的制备 0030 说 明 书 CN 101665489 B 7 5/11 页 8 0031 在干燥的反应瓶中， 0.24克水飞蓟宾溶于5毫升DMF中， 加入0.28克碳酸钾， 搅拌 10 分钟使溶解完全。缓慢滴加烯丙基溴 0.22 克， 搅拌 5 分钟， 再于 75反应 3 小时。静置 冷却， 加入 25 毫升蒸馏水， 醋酸乙酯萃取 3 次。
25、 ( 每次 10 毫升 )， 合并有机层， 10 毫升蒸馏水 洗， 无水硫酸钠干燥， 减压浓缩。得浅黄色粗品， 经 200 300 目硅胶 (10 克 ) 柱层析， 石油 醚醋酸乙酯 10 1 洗脱， 得到浅黄色固体 39.9 毫克。收率 13.3。 0032 化合物 I-a ： 2-2， 3- 二氢 -3-(4- 烯丙基氧基 -3- 甲氧基苯基 )-2- 羟甲基 -1， 4- 苯并二氧六环 -6-3， 7- 二烯丙基氧基 -5- 羟基 -4H-1- 苯并吡喃 -4- 酮， Rf( 石油醚 醋酸乙酯 3 1)0.72 ； 核磁共振氢谱 1H NMR(400MHz， 氘代丙酮 ) ： 3.54(。
26、 多重峰， 2H， H-23)， 3.87( 单峰， 3H， OCH3)， 4.27( 多重峰， 1H， H-10)， 4.62( 双峰， J 5.2Hz， 2H， H-1 )， 4.67( 双峰， J 6.0Hz， 2H， H-1 )， 4.72( 双峰， J 5.2Hz， 2H， H-1 )， 5.10( 双峰， J 8.0Hz， 1H， H-11)， 5.17 5.48( 多重峰， 6H， H-3， H-3 &H-3 )， 6.10( 多重峰， 3H， H-2， H-2&H-2)， 6.35(双峰， J2.0Hz， 1H， H-6)， 6.77(双峰， J2.0Hz， 1H， H-8)，。
27、 7.03 7.10( 多重峰， 3H， 芳香环 Ar-H-16， H-21&H-22)， 7.19( 双峰， J 8.0Hz， 1H， H-18)， 7.75( 双峰， J 2.0Hz， 1H， H-13)， 7.82( 双双峰， J 8.8， 2.0Hz， 1H， H-15)， 12.70( 单峰， 1H， 5-OH) ； 电喷雾质谱 ESI-MS ： 601(M+H)+。 0033 实施例 2 ： 化合物 I-b 即 3， 7， 20- 三 -1- 烯丁基 - 脱氢水飞蓟宾醚的制备 0034 0035 在干燥的反应瓶中， 0.24克水飞蓟宾溶于5毫升DMF中， 加入0.28克碳酸钾， 搅。
28、拌 10 分钟使溶解完全。缓慢滴加 4- 溴 -1- 丁烯 0.25 克， 搅拌 5 分钟， 再于 75反应 3 小时。 静置冷却， 加入 25 毫升蒸馏水， 醋酸乙酯萃取 3 次 ( 每次 10 毫升 )， 合并有机层， 10 毫升蒸 馏水洗， 无水硫酸钠干燥， 减压浓缩。得浅黄色粗品， 经 200 300 目硅胶 (10 克 ) 柱层析， 石油醚醋酸乙酯 10 1 洗脱， 得到浅黄色固体 33.4 毫克。收率 10.4。 0036 化合物 I-b ： 2-2， 3- 二氢 -3-(4- 烯丁基氧基 -3- 甲氧基苯基 )-2- 羟甲基 -1， 4- 苯并二氧六环 -6-3， 7- 二烯丁基。
29、氧基 -5- 羟基 -4H-1- 苯并吡喃 -4- 酮， Rf( 氯仿醋 酸乙酯醋酸 20 1 0.5)0.5 ； 核磁共振氢谱 1HNMR(400MHz， 氘代氯仿 ) ： 2.43 说 明 书 CN 101665489 B 8 6/11 页 9 2.67( 多重峰， 6H， H-2， H-2 &H-2 )， 3.59( 多重峰， 1H， H-23a)， 3.75( 多重峰， 1H， H-23b)， 3.91( 单峰， 3H， OCH3)， 4.05 4.16( 多重峰， 7H， H-1， H-1， H-1 &H-10)， 5.03( 双峰， J 8.4Hz， 1H， H-11)， 5.08。
30、 5.22( 多重峰， 6H， H-4， H-4 &H-4 )， 5.79 5.98( 多重峰， 3H， H-3， H-3 &H-3 )， 6.34( 双峰， J 2.0Hz， 1H， H-6)， 6.42( 双 峰， J 2.0Hz， 1H， H-8)， 6.94( 双 峰， J 8.4Hz， 1H， H-16)， 6.97( 宽 双 峰， J 8.0Hz， 1H， H-15)， 7.02( 宽 双 峰， J 8.0Hz， 1H， H-22)， 7.09( 双 峰， J 8.8Hz， 1H， H-21)， 7.78( 宽单峰， 2H， H-13&H-18)， 7.09( 宽双峰， J 8.8。
31、Hz， 1H， H-15)， 12.63( 单峰， 1H， 5-OH) ； 核磁共振碳谱 13C NMR(100MHz， 氘代氯仿 ) ： 33.20(CH 2， C-2 )， 33.48(CH2， C-2 )， 34.48(CH2， C-2 )， 56.07(OCH3)， 61.55(CH2， C-23)， 67.66(CH2， C-1 )， 68.19(CH2， C-1 )， 71.88(CH2， C-1 )， 76.20(CH， C-11)， 78.63(CH， C-10)， 92.44(CH， C-8)， 98.24(CH， C-6)， 105.93(C， C-4a)， 110.40(。
32、CH， C-13)， 112.94(CH， C-18)， 116.97(CH2， C-4 )， 117.07(CH2， C-4 )， 117.34(CH， C-16)， 117.51(CH， C-21)， 117.62(CH2， C-4 )， 120.07(CH， C-15)， 122.78(CH， C-22)， 123.85(C， C-14)， 128.23(C， C-17)， 133.7(CH， C-3 )， 133.95(CH， C-3 )， 134.43(CH， C-3 )， 138.13(C， C-3)， 143.60(C， C-20)， 145.59(C， C-16a)， 149.。
33、02(C， C-12a)， 149.75(C， C-19)， 155.44(C， C-2)， 156.63(C， C-8a)， 161.85(C， C-5)， 164.66(C， C-7)， 178.77(C， C-4) ； 电喷雾质谱 ESI-MS ： 643(M+H)+。 0037 本发明中的式 (I) 化合物和具有多种重要的生物活性， 通过药效学试验， 证明式 (I) 化合物具有确切的体外抑制自由基诱导之脂质过氧化物生成的活性、 保护脑神经细胞 抗氧化损伤的作用。表明式 (I) 化合物可以预期用于制备防治神经退行性疾病类药物的用 途， 所述的神经退行性疾病是指老年性痴呆症 (AD)、 帕。
34、金森氏症 (PD)、 亨廷顿舞蹈病、 蛋白 感染素病 (prion disease)、 肌萎缩性 ( 脊椎 ) 侧索硬化等病种 ； 还可以防治肝、 脑脂质过 氧化物生成引起的急、 慢性肝损伤类疾病、 肝炎、 脑动脉粥样硬化症药物。 0038 本发明的式 (I) 化合物或其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结合， 制备 得到具有抵御脂质过氧化物引起之损害、 保护脑神经细胞抗氧化损伤作用的抗氧化药物或 药物组合物， 可用于防治老年性痴呆症 (AD)、 帕金森氏症 (PD)、 亨廷顿舞蹈病、 蛋白感染素 病(prion disease)、 肌萎缩性(脊椎)侧索硬化等神经退行性疾病， 还可用于治疗急。
35、、 慢性 肝损伤类疾病、 肝炎、 脑动脉粥样硬化症等疾病。 上述各类药物或药物组合物可以采用注射 剂、 片剂、 胶囊剂、 气雾剂、 栓剂、 膜剂、 滴丸剂、 外用搽剂等剂型。 0039 本发明中所述剂型都可以根据现已公认的药剂学常识经由常规制备而得， 在这些 公知知识和技术基础上制备出的含有本发明权利要求化合物的药物或药物组合物之其他 剂型都在本发明的保护范围内。 0040 为了更好地理解本发明的实质， 下面分别用药理相关实施例的形式列举式 (I) 化 合物对双氧水H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用试验、 以及抑制自由基诱导之脂质过氧化 物生成的活性试验之结果， 说明其在制药领域中的用途以。
36、及用于制备相关抗氧化剂类药物 的根据。药理相关实施例给出了化合物的部分活性数据。同样必须说明， 本发明列举的这 些实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。 0041 根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。 0042 实施例 3 ： 式 (I) 化合物对双氧水 H2O2所致 PC12 细胞损伤的保护作用活性试验 0043 3.1 实验材料与样品 说 明 书 CN 101665489 B 9 7/11 页 10 0044 3.1.1 细胞 ： 大鼠肾上腺嗜铬瘤 PC12 细胞购自中科院上海细胞所。 0045 3.1.2 实验试剂 ： 0046 3.1.2.1 双氧水。
37、 (hydrogen peroxide， H2O2)、 硝基四氮唑兰 (nitrobluetetrazolium， NBT)、 菲咯嗪 (ferrozine) 购自 Sigma 公司 ； 0047 3.1.2.2 水飞蓟宾 (Silybin) 购自辽宁盘锦天缘药业有限公司， HPLC 检测纯度 98。 0048 3.1.2.3Tris 碱， DMEM 培养基购自 Gibco 公司 ； 0049 3.1.2.43-(4， 5-dimethylthiazol-2-yl)-2， 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 购自 Amresco 公司 ； 0050 3.1.2。
38、.5 小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司 ； 0051 3.1.2.6 青霉素和链霉素由石家庄制药集团有限公司生产 ； 0052 3.1.2.7 其它试剂均为国产分析纯， 购自杭州华东医药试剂有限公司。 0053 3.1.3 实验仪器 ： 0054 3.1.3.1 酶标仪 ： Synergy-HT 型， BIO-TEK 公司 ； 0055 3.1.3.2 立式自动电热压力蒸汽灭菌器 ： LDZX-40BI 型， 上海申安医疗器材厂 ； 0056 3.1.3.3 紫外分光光度计 ： UV-1201 型， 北京瑞利分析仪器公司 ； 0057 3.1.3.4 超纯水系统 ： UPWS-I-6。
39、0D 型， 杭州永洁达净化科技有限公司 ； 0058 3.1.3.5 除菌过滤器 ： Sterifil500 型， Millipore 公司 ； 0059 3.1.3.6 气浴恒温振荡器 ： THZ-C， 江苏省金坛市医疗仪器厂 ； 0060 3.1.3.7CO2细胞培养箱 ： MMM， 德国公司 ； 0061 3.1.3.8 倒置显微镜 ： XD-2 型， 重庆光电仪器有限公司。 0062 3.2 实验原理 ： 0063 双氧水 H2O2是一种主要的活性自由基的前体， 它可引起中枢神经系统细胞的凋 亡， PC12 细胞可模拟脑神经细胞， 因此常用它来作为研究药物与神经细胞之间关系的模型， 用。
40、MTT测细胞的存活率， 如果待测化合物有清除由H2O2引起的自由基、 保护细胞抗氧化损伤 的作用， 则其细胞存活率就高， 相应之 OD 值也高， 反之细胞存活率和 OD 值均低。本发明之 药理学试验采用对唐希灿所报道之方法 (Xiaoqiu Xiao 等， Neurosci Letter， 1999， 275 ： 73-76) 加以改进来测定化合物对 PC12 细胞的保护作用。 0064 3.3 细胞培养 ： 0065 PC12细胞用含10小牛血清， 100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素的DMEM培养 基培养， 于 37、 5二氧化碳细胞培养箱中孵育， 常规方法传代培养。 0066 3.。
41、4 实验方法 ： 0067 3.4.1 细胞毒性的测定 ： 首先用改良的 MTT 法测定了待测化合物对 PC12 细胞增殖 的作用。 PC12细胞用胰酶-EDTA消化液消化， 收集细胞， 计数， 用含10小牛血清的DMEM培 养基稀释至 8000 个 / 毫升的密度， 然后接种于 96 孔细胞板中， 细胞培养箱中继续培养， 24 小时后， 分别将新配的待测的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中， 使孔中化合物 I-b 的最终浓度分别为 32、 16、 8 微克 / 毫升。72 小时后， 加入 10 微升 MTT(5 毫克 / 毫升 ) 的生 理盐水溶液， 继续在 37， 5二氧化碳潮湿空气的培养。
42、箱中培养 3 小时， 弃去原液， 每孔中 加入 150 微升二甲亚砜， 振荡溶解生成的 MTT 晶体甲臜， 用酶标仪在 570nm 波长下比色， 细 说 明 书 CN 101665489 B 10 8/11 页 11 胞生长抑制率计算公式 ： 细胞生长抑制率 (OD溶剂对照-OD样品)/OD溶剂对照100。 0068 3.4.2 化合物 I-b 对 H2O2所致 PC12 细胞损伤的保护作用的测定 0069 PC12 细胞用 DMEM 培养基培养， 培养基中含 10牛血清， 100U/ 毫升青霉素和 100U/ 毫升链霉素。细胞以每孔 8000 个的密度加到 96 孔板中， 在 37， 50二。
43、氧化碳潮湿 空气的培养箱中培养 36 小时。用倒置显微镜观察细胞的形态变化以及用 MTT 法测定细胞 的存活率。细胞经 36 小时的孵育后， 分别将新配的化合物 I-b 的二甲亚砜溶液以浓度梯度 加入到各孔中。作用 2 小时后加入新配的 H2O2( 终浓度为 600 微摩尔 / 升 ) 作用 3 小时， 显 微镜观察记录， 弃去原培养液， 加入新的培养液 100 微升， 然后加入 MTT 10 微升， 3 小时后， 小心吸去培养液， 加入 150 微升 DMSO 溶解甲臜， 于 570nm 处读数。采用水飞蓟宾为阳性对 照药物。 0070 3.4.3 试验结果 ： 见表一。 0071 表一化合。
44、物 I-b 及对照品组对双氧水损伤 PC12 细胞保护作用 0072 0073 3.5 结论 ： 0074 试验结果表明， 化合物 I-b 具有明确的对抗自由基引起的 PC12 细胞损伤作用， 即 对模拟脑神经细胞的 PC12 细胞有抗氧化损伤保护作用。在高浓度时其对保护 PC12 细胞免 受自由基损伤之能力比未加药时提高了 100以上。且其在中、 高浓度时保护 PC12 细胞能 力均强于阳性对照药物水飞蓟宾。说明该类 3， 7， 20 位丁烯取代脱氢水飞蓟宾三醚或其可 药用盐属于具有显效保护模拟脑神经细胞的 PC12 细胞作用的抗氧化物质。 0075 测定化合物对 H2O2所致 PC12 细。
45、胞损伤的保护作用可作为初步探讨其保护中枢脑 神经细胞的作用机理之依据。故据该化合物表现出之对双氧水损伤所致 PC12 细胞的保护 作用， 可预期该类3位、 7位和20位烷基取代的脱氢水飞蓟宾三醚化合物对神经退行性疾病 类药物中的治疗有积极作用。 0076 实施例 4 ： 式 (I) 化合物抑制自由基诱导之脂过氧化物生成活性的试验 0077 4.1 实验原理 ： 0078 脂质过氧化是自由基作用于多不饱和脂肪酸的产物， 含量与自由基的生成正相 关， 由于机体有抗氧化的酶系及非酶系的保护作用， 使自由基不断产生又不断被清除。 随着 说 明 书 CN 101665489 B 11 9/11 页 12。
46、 年龄的增长， 体内的抗氧化剂不断下降， 清除自由基的能力逐渐减弱， 脂质过氧化作用则增 强， 脂质过氧化产物增多。因此， 测定样品抗脂质过氧化作用， 是筛选抗氧化、 抗衰老药物 的重要指标之一。本研究用维生素 C-Fe2+系统诱导大鼠肝匀浆产生脂质过氧化产物丙二 醛 (MDA)， MDA 能与硫代巴比妥酸 (TBA) 反应， 产物在 532nm 处有最大吸收， 通过 MDA 量的变 化间接反映化合物对肝匀浆脂质过氧化的抑制作用 ( 文献 ： 杨雷香等， Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry， 2009， 24(2)， 425。
47、-431)。 0079 4.2 实验材料与样品 0080 4.2.1 试验动物 ： SD(sprague-dawley) 大鼠购自浙江大学实验动物中心。合格证 号 ： SCXK( 浙 2007-0029)。 0081 4.2.2 实验试剂 ： 0082 4.2.2.1 硫酸亚铁 FeSO4溶液 ： 国产 FeSO4分析醇试剂， 购自杭州华东试剂公司， 使 用前按照要求自配 ； 0083 4.2.2.2 维生素 C( 即 Vc) 溶液 ： 国产 Vc 分析醇试剂， 购自杭州华东试剂公司， 使 用前按照要求自配 ； 0084 4.2.2.3 三氯醋酸 (20 ) 溶液 ： 国产 CCl3CO2H 。
48、分析醇试剂， 购自杭州华东医药试 剂有限公司， 使用前按照要求自配 ； 0085 4.2.2.4 磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾、 硫代巴比妥酸及其它试剂均为国产分析纯， 杭 州华东医药试剂有限公司。 0086 4.2.2.5 水飞蓟宾购自辽宁盘锦天缘药业有限公司， HPLC 检测纯度 98。 0087 4.3 实验仪器 ： 0088 4.3.1 酶标仪 ： Synergy-HT 型， BIO-TEK 公司 ； 0089 4.3.2 立式自动电热压力蒸汽灭菌器 ： LDZX-40BI 型， 上海申安医疗器材厂 ； 0090 4.3.3 紫外分光光度计 ： UV-1201 型， 北京瑞利分析仪器公司 。
49、； 0091 4.3.4 超纯水系统 ： UPWS-I-60D 型， 杭州永洁达净化科技有限公司 ； 0092 4.3.5 恒温水浴箱 ： 上海森信试验科学仪器公司 ； 0093 4.3.6 气浴恒温振荡器 ： THZ-C， 江苏省金坛市医疗仪器厂 ； 0094 4.3.7 台式高速冷冻离心机 ： TGL-16G， 上海安亭仪器厂。 0095 4.4 实验方法 ： 0096 4.4.1 肝匀浆的制备 ： 取 SD 实验大鼠 5 只断头处死， 迅速取出肝脏， 用超速离心法 制备肝匀浆。 0097 4.4.2 样品对鼠肝脂质过氧化的抑制作用 ： 在含 FeSO4(4 微摩尔 / 升 ) 与 Vc(50 微 摩尔 / 升 ) 的 1 毫升缓冲液中加入 200 微克 / 毫升肝微粒体， 以诱导产生脂质过氧化， 同时 加入不同浓度的化合物 I-a 样品， 37孵育 30 分钟后加入 1 毫升三氯醋酸 (20 ) 中止反 应加入 1.5 毫升硫代巴比妥酸 (0.76 )， 100沸水浴处理 20 分钟， 离心去除蛋白沉淀， 在 532nm波长下测定上清吸光度。 脂质过氧化以反应中生成的丙二醛表示， 实验以水飞蓟宾作 为阳性对照药物。用缓冲液代替反应液作为空白对照组， 加入同样体积。