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1、(10)申请公布号 CN 102775465 A (43)申请公布日 2012.11.14 CN 102775465 A *CN102775465A* (21)申请号 201210270745.0 (22)申请日 2012.08.01 C07K 1/14(2006.01) C07K 14/435(2006.01) C12N 11/02(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第三军医大学 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正街 30 号 (72)发明人 杨霞 吴玉章 (74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 赵荣之 (54) 发明名称 制备再生丝。
2、素蛋白的方法及其产品和应用 (57) 摘要 本发明公开了制备再生丝素蛋白的方法， 具 体为将脱胶蚕丝加入钙醇溶液， 水浴溶解， 离心去 除悬浮杂质， 透析， 干燥， 得再生丝素蛋白 ； 制备 方法简单， 丝素蛋白质溶解性好， 制得的再生丝 素蛋白结构主要为 - 折叠片层， 无规则卷曲结 构减少， 能够用作酶固定化载体， 将酶固定在该再 生丝素蛋白上能有效保护酶被生物体内降解酶降 解， 进而提高酶的稳定性及半衰期。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 4 页。
3、 1/1 页 2 1. 制备再生丝素蛋白的方法， 其特征在于 ： 将脱胶蚕丝加入钙醇溶液， 水浴溶解， 离心 去除悬浮杂质， 透析， 干燥， 得再生丝素蛋白 ； 所述钙醇溶液为钙盐、 醇与水的混合液或含水钙盐与醇的混合液。 2. 根据权利要求 1 所述制备再生丝素蛋白的方法， 其特征在于 ： 所述钙醇溶液为 CaCl2、 醇与水摩尔比为 1:2:8 的混合液或 Ca(NO3)2 4H2O 与醇摩尔比为 1:2 的混合液， 所述 醇为甲醇或乙醇。 3. 根据权利要求 2 所述制备再生丝素蛋白的方法， 其特征在于 ： 所述钙醇溶液为 CaCl2、 乙醇与水的摩尔比为 1:2:8 的混合液。 4. 。
4、根据权利要求 3 所述制备再生丝素蛋白的方法， 其特征在于 ： 加入所述钙醇溶液的 量为钙醇溶液与脱胶蚕丝的重量比为 100 ： 2-10。 5. 根据权利要求 1-4 任一项所述制备再生丝素蛋白的方法， 其特征在于 ： 所述水浴溶 解是在温度为 50-70的水浴中溶解 1-2 小时 ； 所述离心是 5000rpm、 离心 10 分钟 ； 所述透 析是将所述上清夜装入截留分子量为 6000 的透析袋， 透析 2-3 天 ； 所述干燥为真空干燥。 6. 根据权利要求 5 所述制备再生丝素蛋白的方法， 其特征在于 ： 所述脱胶蚕丝由以下 方法制备 ： 取蚕丝， 先用质量分数为 0.1%-10% 的。
5、十二烷基硫酸钠溶液， 煮沸 1 小时， 然后用 去离子水冲洗， 再用质量分数为 0.1%-10% Na2CO3溶液， 再煮沸 1 小时， 然后用去离子水冲 洗， 干燥， 得脱胶蚕丝。 7. 利用权利要求 1-6 任一项所述的方法制备的再生丝素蛋白。 8. 权利要求 7 所述再生丝素蛋白在酶固定化的载体中的应用。 9. 根据权利要求 8 所述的应用， 其特征在于 ： 所述酶为 L- 天冬酰胺酶。 权 利 要 求 书 CN 102775465 A 2 1/6 页 3 制备再生丝素蛋白的方法及其产品和应用 技术领域 0001 本发明涉及医药领域， 特别涉及制备再生丝素蛋白的方法， 还涉及由该制备方法。
6、 制得的再生丝素蛋白和应用。 背景技术 0002 蚕丝是天然大分子聚合物， 天然桑蚕丝主要由蚕丝蛋白和丝胶组成。桑蚕丝核壳 结构， 外层包覆丝胶蛋白( Sericin)， 内层为丝素蛋白( Silk Fibroin， 简称SF)， 其中丝素 蛋白含量约为 70% 80%。丝素蛋白主要由 3 种蛋白质成分组成， 分别为 350kd 的 H 链蛋 白、 25kd 的 L 链蛋白及 30kd 的 P25 蛋白， 其中 H 链蛋白 ： L 链蛋白 ： P25 蛋白的摩尔比为 6 ： 6 ： l。H 链蛋白为疏水性蛋白质， 主要为丝纤维提供类结晶结构， 决定丝线强度 ； L 链蛋白为 亲水性蛋白， 弹性。
7、相对较强。丝素蛋白具有良好的亲和性， 无毒、 无污染、 无刺激性、 组织相 容性好， 应用于体内安全 ； 具有良好的生物可降解性， 可塑性强， 可制成纤维、 溶液、 粉、 膜以 及凝胶等。所以它是用作药物载体的最佳原材料之一。 0003 但是蚕丝中的蛋白结构有的疏水片层结构 （- 折叠片层） ， 也含有 - 螺旋结构 及无规则卷曲。研究表明丝蛋白的 - 螺旋结构及无规则卷曲比 - 折叠片层结构能加速 酶的降解。所以对于药物载体研究而言， 丝素蛋白二级结构应以改造为 - 折叠片层才能 显著提高固定酶的酶稳定性。 而天然丝素蛋白不溶于水， 可溶于强酸强碱和一些中性盐 （如 锂、 锶、 钡的氯化物、。
8、 溴化物、 碘化物， 以及硫氰酸盐和氯化锌） 溶液， 在强酸和强碱中丝素蛋 白的生物活性很难得以较好保存， 中性盐如锂锶钡的氯化物、 溴化物、 碘化物， 以及硫氰酸 盐对人体有危害， 因此也不适宜用于降解丝素蛋白。 0004 因此， 急需一种制备再生丝素蛋白的方法， 丝素蛋白溶解性好， 制得的再生丝素蛋 白 - 折叠片层比例升高。 0005 发明内容 有鉴于此， 本发明的目的之一在于提供制备再生丝素蛋白的方法， 其制备方法简单， 丝 素蛋白溶解性好， 固定酶后有利于提高酶的稳定性。 0006 为实现上述发明目的， 技术方案为 ： 制备再生丝素蛋白的方法， 将脱胶蚕丝加入钙醇溶液， 水浴溶解， 。
9、离心去除悬浮杂质， 透析， 干燥， 得再生丝素蛋白。 0007 所述钙醇溶液为钙盐、 醇与水的混合液或含水钙盐与醇的混合液。 0008 本发明中钙醇溶液为所述钙醇溶液为 CaCl2、 醇与水摩尔比为 1:2:8 的混合液或 Ca(NO3)2 4H2O 与醇摩尔比为 1:2 的混合液， 所述醇为甲醇或乙醇。 0009 优选的， 所述钙醇溶液为 CaCl2、 乙醇与水的摩尔比为 1:2:8 的混合液。 0010 优选的， 加入所述钙醇溶液的量为钙醇溶液与脱胶蚕丝的重量比为 100 ： 2-10。 0011 本发明中， 将脱胶蚕丝完全溶解即可， 然后除去杂质， 优选的， 所述水浴溶解是在 温度为 5。
10、0-70的水浴中溶解 1-2 小时 ； 所述离心是 5000rpm、 离心 10 分钟 ； 所述透析是将 所述上清夜装入截留分子量为 6000 的透析袋， 透析 2-3 天 ； 所述干燥为真空干燥。 说 明 书 CN 102775465 A 3 2/6 页 4 0012 本发明中脱胶蚕丝可以按照现有技术进行脱胶处理进行脱胶处理， 优选为， 取蚕 丝， 先用质量分数为 0.1%-10% 的十二烷基硫酸钠溶液， 煮沸 1 小时， 然后用去离子水冲洗， 再用质量分数为 0.1%-10% Na2CO3溶液， 再煮沸 1 小时， 然后用去离子水冲洗， 干燥， 得脱胶 蚕丝。 0013 本发明的目的之二在。
11、于提供利用上述制备方法制得的再生丝素蛋白， 技术方案 为 ： 利用所述方法制备的再生丝素蛋白。 0014 本发明的目的之三在于提供再生丝素蛋白的应用， 生物降解性好， 能够提高酶的 稳定性， 技术方案为 ： 所述再生丝素蛋白在酶固定化的载体中的应用。 0015 本发明中可以用于各种酶的固定， 如固定解除毒素的葡萄糖氧化酶， 用于有机磷 农药残留快速检测固定化的小麦酯酶， 用于食品加工中的淀粉酶或脂肪酶等， 优选为 L- 天 冬酰胺酶。 0016 本发明有益效果在于 ： 本发明公开的再生丝素蛋白的制备方法， 制备方法简单， 未 使用强酸或强碱， 便于保存， 蛋白质不易失活 ； 也未使用对人体有危。
12、害的化学物质， 用作载 体对生物体无危害， 本发明将脱胶蚕丝通过钙醇溶液处理， 将丝素蛋白的溶解性由脱胶丝 蛋白的疏水性变为亲水性， 钙醇溶液处理后， 蛋白结构完整性与脱胶类似， 变化不大， 二级 结构主要为 - 折叠片层， 无规则卷曲结构减少， 这个结构有利于丝蛋白形成类似于口袋 似的结构， 能更好地容纳酶， 结合更多的酶， 并能有效保护容纳的酶免受生物体内降解酶的 降解， 进而提高酶在生物体中的稳定性及半衰期。此外再生丝素蛋白与合成药物载体具有 生物相容性、 生物体可降解等优点， 再生丝素蛋白素固定酶后能降低酶类物质的免疫原性， 能显著降低酶的毒副作用， 具有广泛的应用前景。 0017 本。
13、发明中， 酶固定在载体上形成固定化酶， 因此可以重复使用， 提高酶的使用效 率， 降低成本， 使用后便于分离、 纯化， 产品收率高， 质量好， 并且固定化酶对热、 pH 的稳定性 提高， 对抑制剂的敏感性降低， 可较长时间的使用和储藏 ； 催化过程更易控制。 0018 附图说明 0019 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述， 其中 ： 图 1 是脱胶蚕丝扫描电镜观察图。 0020 图 2 是再生丝素蛋白扫描电镜观察图 （A ： Ca(NO3)2 4H2O- 甲醇处理的再生丝素蛋 白 ； B ： Ca(NO3)2 4H2O- 乙醇处理的再生。
14、丝素蛋白 ； C ： CaCl2- 甲醇 - 水处理的再生丝素蛋白 ； D ： CaCl2- 乙醇 - 水处理的再生丝素蛋白） 。 0021 图3是再生丝素蛋白SDS-PAGE电泳 （M为蛋白marker ； A为Ca(NO3)2 4H2O-甲醇处 理的再生丝素蛋白 ； B 为 Ca(NO3)2 4H2O- 乙醇处理的再生丝素蛋白 ； C 为 CaCl2- 甲醇 - 水 处理的再生丝素蛋白 ； D 为 CaCl2- 乙醇 - 水处理的再生丝素蛋白） 。 0022 图 4 是脱胶蚕丝与再生丝素蛋白傅立叶红外光谱图谱 （A 为脱胶蚕丝检测结果 ； B 为 Ca(NO3)2 4H2O- 甲醇处理的再。
15、生丝素蛋白检测结果 ； C 为 Ca(NO3)2 4H2O- 乙醇处理的再 说 明 书 CN 102775465 A 4 3/6 页 5 生丝素蛋白检测结果 ； D 为 CaCl2- 甲醇 - 水处理的再生丝素蛋白检测结果 ； E 为 CaCl2- 乙 醇 - 水处理的再生丝素蛋白检测结果） 。 0023 图 5 是脱胶蚕丝与再生丝素蛋白 X- 射线衍射图谱 （A 为脱胶蚕丝检测结果 ； B 为 Ca(NO3)2 4H2O- 甲醇处理的再生丝素蛋白检测结果 ； C 为 Ca(NO3)2 4H2O- 乙醇处理的再生丝 素蛋白检测结果 ； D为CaCl2-甲醇-水处理的再生丝素蛋白检测结果 ； E。
16、为CaCl2-乙醇-水 处理的再生丝素蛋白检测结果） 。 0024 图6 是脱胶蚕丝与再生丝素蛋白固相核磁共振图谱 （A为脱胶蚕丝检测结果 ； B为 Ca(NO3)2 4H2O- 甲醇处理的再生丝素蛋白检测结果 ； C 为 Ca(NO3)2 4H2O- 乙醇处理的再生丝 素蛋白检测结果 ； D为CaCl2-甲醇-水处理的再生丝素蛋白检测结果 ； E为CaCl2-乙醇-水 处理的再生丝素蛋白检测结果） 。 0025 图7 是脱胶蚕丝与再生丝素蛋白固定L-天冬酰胺酶酶活性测定 （A为脱胶蚕丝交 联L-天冬酰胺酶酶活性测定结果 ； B为Ca(NO3)2 4H2O-甲醇处理的再生丝素蛋白固定L-天 冬。
17、酰胺酶酶活性测定结果 ； C 为 Ca(NO3)2 4H2O- 乙醇处理的再生丝素蛋白固定 L- 天冬酰胺 酶酶活性测定结果 ； D为CaCl2-甲醇-水处理的再生丝素蛋白固定L-天冬酰胺酶酶活性测 定结果 ； E 为 CaCl2- 乙醇 - 水处理的再生丝素蛋白固定 L- 天冬酰胺酶酶活性测定结果） 。 具体实施方式 0026 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面对本发明的优选实施例进 行详细的描述。 0027 以下将参照附图， 对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具 体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件进行。 0028 氨基酸的。
18、缩写如下 ： 甘氨酸 Gly G ； 丝氨酸 Ser S ； 丙氨酸 Ala A ； 苏氨酸 Thr T ； 缬氨酸 Val V ； 异亮氨酸 Ile I ； 亮氨酸 Leu L ； 酪氨酸 Tyr Y ； 苯丙氨酸 Phe F ； 组氨酸 His H ； 脯氨酸 Pro P ； 天冬氨酸 Asp D ； 甲硫氨酸 Met M ； 谷氨酸 Glu E ； 色氨酸 Trp W ； 赖氨酸 Lys K ； 半胱氨 酸 Cys C ； 精氨酸 Arg R。 0029 实施例 1 制备再生丝素蛋白 取蚕丝， 加入质量分数为 0.1%-10% 的十二烷基硫酸钠 （SDS） 溶液， 煮沸 1 小时， 然后。
19、 用去离子水冲洗， 再加入质量分数为 0.1%-10% Na2CO3溶液， 再煮沸 1 小时， 用去离子水冲 洗， 然后在 65条件下干燥过夜， 获得脱胶蚕丝。通过脱胶使蚕丝中的丝胶溶解， 此步骤中 SDS 溶液的质量分数为 0.25% 和 Na2CO3溶液的质量分数为 0.25% 脱胶效果最佳， SDS 溶液和 Na2CO3溶液加入量相当于蚕丝重量的 100-1000 倍效果最佳， 脱胶后将脱胶蚕丝用扫描电镜 观察， 结果如图 1 所示。 0030 配制钙醇溶液 ： 钙醇溶液包括CaCl2-乙醇-水、 CaCl2-甲醇-水、 Ca(NO3)2 4H2O-甲 醇和 Ca(NO3)2 4H2O-。
20、 乙醇共四种。 0031 CaCl2- 乙醇 - 水为 CaCl2、 乙醇和水按照 1:2:8 的摩尔比混合， 室温下溶解， 即得 ； CaCl2- 甲醇 - 水为 CaCl2、 甲醇和水按照 1:2:8 的摩尔比混合， 室温下溶解， 即得 ； Ca(NO3)2 4H2O- 甲醇为 Ca(NO3)2 4H2O 和甲醇按 1:2 的摩尔比混合后， 室温下磁力搅拌 直至完全溶解， 即得 ； Ca(NO3)2 4H2O- 乙醇为 Ca(NO3)2 4H2O 和乙醇按照 1:2 的摩尔比混合后， 室温下磁力搅 说 明 书 CN 102775465 A 5 4/6 页 6 拌直至完全溶解， 即得。 00。
21、32 在四种溶液中分别加入脱胶蚕丝至溶液中脱胶蚕丝的质量分数约为 2-10%， 然后 放入 50-70 水浴中至丝素蛋白纤维完全溶解， 溶解后的溶液呈黄色黏性状， 得再生丝素 蛋白溶液， 然后将所得再生丝素蛋白溶液以5000rpm的转速离心10分钟， 收集上清， 上清液 分别装入透析袋中 （截留分子量为 6000） ， 自来水透析 1-2 天， 换超纯水透析一天后， 放入真 空冷冻干燥机进行干燥， 得再生丝素蛋白， 保存于4， 备用。 溶解过程中也可以通过其他加 热方式进行保温， 如油浴、 金属浴等， 也可以用其他助溶方式进行溶解， 如超声助溶， 溶解过 程中观察四种溶液的溶解速度， 溶解相同。
22、质量的蚕丝， CaCl2- 乙醇 - 水溶解速度最快， 且溶 解后的溶液呈黄色黏性透明状。 0033 四种溶液处理结果表明， 脱胶蚕丝在四种溶液中均能溶解， 但是经过再生丝蛋白 处理研究发现 CaCl2- 乙醇 - 水溶液对丝素蛋白纤维的溶解最好。 0034 实施例 2 再生丝素蛋白扫描电镜观察 为了进一步观察再生丝素纤维溶解情况， 将脱胶蚕丝与四种溶液制得的再生丝素蛋白 进行扫描电镜观察， 脱胶蚕丝电镜观察如图 1 所示， 四种溶液制得的再生丝素蛋白采用扫 描电镜进行观察如图2所示。 由图1可知， 脱胶蚕丝结构保持完整， 但从图2中A可以看出， Ca(NO3)2 4H2O- 甲醇处理后脱胶蚕。
23、丝发生了溶解， 丝素蛋白有少量丝素纤维残余， 溶解后的 丝素蛋白呈比较均匀的颗粒状 ； 从图 2 中 B 和 C 可以看出， Ca(NO3)2 4H2O- 乙醇和 CaCl2- 甲 醇 -H2O 处理的脱胶蚕丝发生了溶解， 但是与 Ca(NO3)2 4H2O- 甲醇处理相比丝素蛋白溶解较 差， 部分丝素纤维未溶解 ； 从图 2 中 D 可以看出， CaCl2- 乙醇 - 水处理的脱胶蚕丝溶解效果 好， 其中丝素蛋白全部溶解， 呈片状。 另外， Ca(NO3)2 4H2O-甲醇处理的丝素蛋白冻干后为颗 粒状， 而 CaCl2- 乙醇 - 水处理的丝素蛋白冻干后为片状。电镜扫描图片表明了四种溶液中。
24、 CaCl2- 乙醇 - 水对丝素蛋白的溶解性最好， 其次是 Ca(NO3)2 4H2O- 甲醇， Ca(NO3)2 4H2O- 乙 醇和 CaCl2- 甲醇 -H2O 对丝素蛋白也能溶解， 但溶解性较差。 0035 实施例 3 再生丝素蛋白 SDS-PAGE 电泳 蚕丝富含丙氨酸、 甘氨酸和丝氨酸氨基酸， 由约300kDa的重链及26 kDa的轻链通 过二硫键连接， 分子量为 30 kDa 的 P25 糖蛋白通过疏水相互作用与轻链及重链的复合物 结合共同构成蚕丝分子， 分子量约 400 kDa。蚕丝蛋白在热、 化学试剂、 pH 条件下分子间的 结构会被破坏。 本发明的钙醇溶液处理之后， 脱胶。
25、蚕丝的结构会改变， 为测定不同处理后再 生丝素蛋白分子量， 选用质量分数为12%的分离胶和4%的浓缩胶质量分数， 上样量为20L 进行再生丝素蛋白分子量检测。在垂直板电泳槽上电泳， 电流为 80mA， 电泳约 2 小时。电泳 结束后考马斯亮蓝G-250染色， 脱色， 电泳结果见图3。 由图3可知， 脱胶蚕丝不溶于或少溶 于水， 脱胶蚕丝 SDS-PAGE 观察不到明显的条带 (a)。Ca(NO3)24H2O- 甲醇、 Ca(NO3)2-4H2O- 乙 醇、 CaCl2-甲醇-水及CaCl2-乙醇-水溶液均能溶解脱胶蚕丝的丝素蛋白， 破坏其蛋白间的 二硫键及疏水相互作用结构。 Ca(NO3)24。
26、H2O-甲醇处理的丝蛋白分子量范围为95 KDa170 kDa， Ca(NO3)24H2O - 乙醇处理的分子量范围为 100 KDa 170 kDa。CaCl2- 甲醇 - 水处理 的分子量范围为 140 170 kDa， 而 CaCl2- 乙醇 - 水处理的分子量为 100 300 kDa。处理 后的再生丝素蛋白均观察到两个小分子量的蛋白 17 和 26 kDa， 但是 CaCl2- 乙醇 - 水处 理的再生丝蛋白只有很弱的条带， 表明 CaCl2- 乙醇 - 水处理的丝蛋白小分子量残基最少， 大分子量残基较其余 3 种溶液处理大， 说明 CaCl2- 乙醇 - 水处理对于丝蛋白间二硫键及。
27、疏 说 明 书 CN 102775465 A 6 5/6 页 7 水相互作用的破坏较其余溶液处理温和。 0036 实施例 4 再生丝素蛋白衰减全反射傅立叶变换红外光谱 丝素蛋白主要由甘氨酸、 丙氨酸、 丝氨酸等 18 种氨基酸组成。其特征氨基酸带有氨基 (-NH) 和羧基 (-COOH)， 具有两性电解质性质。衰减全反射傅立叶变换红外光谱检测丝蛋白 的结果表明3435.7 cm -1、 1620cm-1 处为酰氨I峰的特征峰(C=O键)， 1513 cm-1左右为酰氨 峰 (N-H 弯曲 )， 1240 cm -1 1270cm-1处为酰氨峰的特征峰 （C-N 键） ， 625 cm-1 69。
28、5 cm-1为酰氨 V 的吸收峰， 1372.6 cm -1、 1016.6 cm -1、 2894.3 cm -1、 3435.7 cm -1、 894.2 cm-1 处吸收峰主要是纤维素的特征峰。 此外， 吸收峰在660 cm-1处主要为无规则卷曲 ； 吸收峰在 1655 cm -1、 1546 cm -1、 1270 cm -1、 625 cm-1主要为-螺旋结构 ； 吸收峰在1630 cm -1、 1520 cm -1、 1240 cm -1、 695 cm-1主要为 - 折叠片层。 0037 不同钙醇溶液制备的再生丝素蛋白的衰减全反射傅立叶转换红外光谱分析均用 采用 Bruker T。
29、ENSOR 27 FT-IR 光谱仪。衰减全反射附件用于获得各处理的丝素蛋白在溶 剂中的波谱。所有扫描均用平均 32 次重复扫描从 1900800 cm -1进行， 结果见图 4。由图 4 可知， 再生丝素蛋白 - 折叠片层特征吸收峰在 1630 cm -1、 1530 cm -1、 1240 cm -1左右， 随机卷曲结构的吸收峰在 1650 cm -1、 1645 cm -1、 1550 cm -1、 1230 cm -1左右， - 螺旋结构 特征吸收峰在 1655 cm -1左右。由此可知， CaCl2- 乙醇 - 水处理的再生丝素蛋白在 1630 cm -1、 1530cm -1 等处。
30、有明显的吸收峰， 为 - 折叠片层结构。 0038 实施例 5 再生丝素蛋白 X- 射线衍射 将四种钙醇溶液制备的再生丝素蛋白进行 X- 射线衍射， 采用北京普析通用仪器有限 公司生产的 XD-3 多晶 X 射线衍射仪 （铜靶， = 0.15418 nm） ， 电压 36 Kv， 电流 20 mA。扫 描范围为 5o- 40 o(2)， 以每分钟 1 o的速度进行扫描。通过 X 射线衍射仪测得的 2， 计 算分子间空间距离公式为 ： D=/(2sin()， 及 D=0.0752/(sin ) nm， 如， 扫描获得 2=20 o， 那么空间距离即为 D=0.0752/(sin 10 o) nm。
31、， 即 D-space 为 0.43 nm。研究表明 silk I分子空间距离 （D-spacings） 主要为 0.74 nm、 0.56 nm、 0.44 nm、 0.41 nm、 0.36 nm、 0.32 nm及 0.28 nm。 而silk II的分子空间距离主要为0.98 nm、 0.48 nm及0.43 nm。 如 图 5 所示， Ca(NO3)24H2O- 乙醇、 Ca(NO3)24H2O - 甲醇及 CaCl2- 甲醇 - 水制备的再生丝素蛋 白空间距离为 0.47nm（2=18.4 o） ， 对应为 silkII 结构。Silk 结构主要以无规则卷曲 为主， 包括少量 - 。
32、转角 （type II -turn） 和 - 螺旋结构 ； Silk 结构主要为反平行 -折叠片层 （anti-parallel-pleated sheet） 。 Silk和Silk构象可通过改变温度、 溶剂极性、 pH 值、 应力等条件进行转变。CaCl2- 乙醇 - 水处理的再生丝素蛋白 X- 射线衍射 2 扫描结果为 19.4 o、 20.3 o、 24.6 o及 29.3 o， 空间距离为 0.44 nm、 0.41 nm、 0.35 nm 及 0.30 nm， 主要对应于 silk I 结构。此外， CaCl2- 乙醇 - 水制备的丝素蛋白较 Ca(NO3)24H2O - 乙醇、 C。
33、a(NO3)24H2O - 甲醇及 CaCl2- 甲醇 - 水制备的丝素蛋白在 2=20.3 o处有明显吸 收峰， 并且 CaCl2- 乙醇 - 水处理蚕丝增加了丝蛋白的晶体度。 0039 实施例 6 再生丝素蛋白固相核磁共振 所有样品均由 13C CP/MAS NMR (AVANCE 400, Bruker, Germany) 固态核磁共振仪 进行二级结构的鉴定， 结果见图6。 其中1618ppm为Ala C， 代表松散螺旋、 无规线圈 结构。 2022ppm为Ala C ， 为反平行-折叠片层结构。 Ala C 吸收峰在15.2ppm、 Ala C 吸收峰在 52.4ppm 为有规律的螺旋。
34、结构。从检测结果可以看出， Ca(NO3)24H2O- 乙 说 明 书 CN 102775465 A 7 6/6 页 8 醇、 Ca(NO3)24H2O - 甲醇及 CaCl2- 甲醇 - 水处理蚕丝增加了 Ala C的吸收峰， 降低了 Gly C=O（169.1 ppm） 的吸收峰， 表明 Ca(NO3)24H2O- 乙醇、 Ca(NO3)24H2O - 甲醇及 CaCl2- 甲醇处 理蚕丝， 使其发生了化学键的位移。而 CaCl2- 乙醇 - 水处理蚕丝在这些位点的吸收峰与脱 胶蚕丝相似， 表明 CaCl2- 乙醇处理能有效保护丝素蛋白分子内部结构。 0040 实施例 7 再生丝素蛋白固定。
35、 L- 天冬酰胺酶酶活性测定 各称取 Ca(NO3)24H2O- 甲醇、 Ca(NO3)24H2O 乙醇、 CaCl2- 甲醇 - 水及 CaCl2- 乙醇 - 水 处理的再生丝素蛋白 50mg， 分别加入 2 mL PBS 溶解的 L- 天冬酰胺酶 （L- 天冬酰胺酶的浓 度为 2mg/mL） 、 1mL 保护剂天冬酰胺 (5mg/L)、 加入 PBS（pH7.4） 及戊二醛溶液 （其终浓度为 0.05%） ， 至终体积为 5mL。搅拌， 放置于 4交联固定 12 小时。然后加入 100mg 甘氨酸终 止反应。然后分别用 0.05 M Tris-HC1 缓冲液 (pH 8.6) 和蒸馏水充分。
36、冲洗至少 3 次， 每次 在 4、 10000rpm 条件下， 离心 10 分钟） ， 以洗去粘在丝胶上的游离 L- 天冬酰胺酶和未交联 的戊二醛。然后用 1mL 的 Tris-HC1 缓冲液重悬再生丝素蛋白， 37水浴 10 分钟， 分别加入 2mLTris-HC1缓冲液溶解的L-天冬酰胺， 37水浴10分钟， 各加入100mg的三氯乙酸 （TCA） 终止反应。3000rpm 离心 5 分钟， 各取其中 0.5mL 上清至预装 1mL Nessler 试剂的新离心 管中 （100 毫升体积 Nessler 试剂含 35g 碘化钾、 1.3g 氯化汞溶解于 70 毫升水中， 然后加入 30ml。
37、 4N 氢氧化钾溶液） ， 混合后于室温下静置 10 min， 再各取 50L 混合液至酶联板中， 再 分别加入150L Tris-HC1缓冲液， 重复3次， 用分光光度计在450nm处测定吸光度， 以空白 管为对照测定吸光度， 取平均值计算固定化酶的活性或相对活性。 活性测定检测实验重复3 次， 最后计算平均值。结果见图 7， 结果表明， CaCl2- 乙醇 - 水与 CaCl2- 甲醇 - 水处理蚕丝 天冬酰胺酶活性较Ca(NO3)24H2O-乙醇和Ca(NO3)24H2O -甲醇处理酶活性高， 其中CaCl2- 乙 醇 - 水处理丝蛋白天冬酰胺酶活性最高， 表明 CaCl2- 乙醇 - 。
38、水处理优于其他处理。 0041 综上所述， 采用 CaCl2- 乙醇 - 水处理丝蛋白制备药物靶向载体是一种较理想的制 备方法。 0042 最后说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述， 但本领域的普通技术人员应当理解， 可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利要求书所限定的本发 明。 说 明 书 CN 102775465 A 8 1/4 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102775465 A 9 2/4 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102775465 A 10 3/4 页 11 图 5 说 明 书 附 图 CN 102775465 A 11 4/4 页 12 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102775465 A 12 。