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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610438413.7 (22)申请日 2016.06.19 (71)申请人 苏州普罗达生物科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市高新区锦峰路8 号15号楼263室 (72)发明人 罗瑞雪 (51)Int.Cl. C07K 14/705(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种CD19免疫原多肽及其用途 (57)摘要 本发明公开了一种CD19免疫原多肽， 属于抗 癌疫苗领域。 具体涉及用。
2、作抗癌疫苗的CD19免疫 原的优化多肽， 增强T细胞免疫应答。 该氨基酸序 列为全新的序列， 在制备用于治疗肿瘤药物中的 应用。 尤其在制备用于肿瘤免疫细胞， 增强T细胞 免疫应答药物中的应用， 以及在制备用于CAR-T 细胞免疫治疗的应用。 本发明的有益效果在于为 全新的序列， 可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫 原， 能 （1） 促进T细胞，（2） 促进CD8+免疫应答，（3） 能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，（4） 促 进T细胞与肿瘤细胞的结合，（5） 在荷瘤小鼠体 内， 能抑制肿瘤的生长。 作为细胞疗法的靶标分 子， 应用于CAR-T等细胞疗法。 权利要求书1页 说明书4页 序列表。
3、1页 CN 105906705 A 2016.08.31 CN 105906705 A 1.一种CD19免疫原多肽， 其特征在于： 所述的多肽序列为SEQIDNO： 1。 2.根据权利要求1所述的多肽在用于治疗肿瘤药物中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述的多肽在制备用于肿瘤免疫细胞， 增 强T细胞免疫应答药物中的应用。 4.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105906705 A 2 一种CD19免疫原多肽及其用途 技术领域 0001 本发明是有关抗癌疫苗领域。 具体来说， 本发明涉及。
4、用作抗癌疫苗的CD19免疫原 的优化多肽， 增强T细胞免疫应答。 背景技术 0002 B细胞淋巴瘤是B细胞发生的实体肿瘤通常发生于儿童和成年人， 是一种攻击免疫 系统中B细胞的癌症类型。 包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。 其分型众多， 经典霍奇金 淋巴瘤和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤， 现在被认为是起源于B细胞的肿瘤。 弥漫性 大B细胞淋巴瘤、 滤泡性淋巴瘤、 黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、 小淋巴细胞淋巴瘤/慢性 淋巴细胞白血病、 套细胞淋巴瘤(MCL)5种B细胞非霍奇金淋巴瘤最为常见， 占非霍奇金淋巴 瘤的3/4。 B细胞淋巴瘤的预后和治疗取决于淋巴瘤的具体类型以及分期分级。 。
5、目前的治疗 手段以化疗为主， 但化疗对身体伤害很大， 以后康复了身体抵抗力也会变得很差。 0003 研究人员发现B细胞淋巴瘤细胞表面受体CD19起着关键作用。 CD19是一种B细胞特 异性转膜糖蛋白， 表达于B系细胞(不包括成熟浆细胞)及滤泡树突状细胞上， CD19是一种重 要的信号传导分子， 调节B淋巴细胞的生长激活和活化， 在调节B淋巴细胞抗原受体或其他 表面受体的信号阈值中起重要作用， 是与B淋巴细胞分化、 活化、 增殖及抗体产生有关的重 要膜抗原， 是诊断B淋巴细胞系肿瘤的最好标志， 如慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴 细胞白血病(ALL)。 0004 目前已经有肿瘤的临床试验测。
6、试对抗CD19受体的抗体。 这种抗体不仅能杀死B淋 巴细胞系肿瘤， 同时也能健康的B细胞， 从而削弱免疫系统。 研究人员希望能够设计更有效 的治疗方法， 能选择性地杀死肿瘤细胞， 同时保留健康的B细胞， 产生更安全、 有效的临床治 疗效果。 0005 肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、 具有显著疗效的肿瘤治疗模式， 是一种自身免 疫抗癌的新型治疗方法。 它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行 体外培养和扩增后回输到病人体内的方法， 来激发， 增强机体自身免疫功能， 从而达到治疗 肿瘤的目的。 肿瘤细胞免疫疗法是继手术、 放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。 0006 CD19可以。
7、作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。 然而， CD19由95KDa的蛋白， 分子量较大， 较难得到纯度高的CD19。 这样， 不仅会给后期的特异性T细胞免疫带来困难， 而且会导致患 者的自身免疫。 因此， 本发明提供了一种特异性强， 纯度较高的小分子多肽作为免疫原。 发明内容 0007 发明目的 0008 本发明提供一种CD19免疫原多肽， 可用于肿瘤细胞免疫的免疫原， 增强T细胞免疫 应答， 具有分子量小、 特异性免疫原性强的特点。 0009 技术方案 0010 本 发 明 的 技 术 方 案 在 于 提 供 一 种 C D 1 9 免 疫 原 多 肽 ，序 列 为 说明书 1/4 页 3 CN 1。
8、05906705 A 3 DNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKFLKLSLGLPGLGIHMRPLASW(SEQIDNO： 1)。 该氨基酸序列 为全新的序列， 在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。 尤其在制备用于肿瘤免疫细胞， 增强T 细胞免疫应答药物中的应用， 以及在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。 0011 有益效果 0012 本发明的CD19免疫原多肽， 为全新的序列， 可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原。 有益效果在于(1)促进T细胞， (2)促进CD8+免疫应答， (3)能与T细胞表面的MHC有效的特异 性结合， (4)促进T细胞与肿瘤细胞的结合， (5)在荷瘤。
9、小鼠体内， 能抑制肿瘤的生长。 作为细 胞疗法的靶标分子， 应用于CAR-T等细胞疗法。 具体实施方式 0013 多肽由上海生工吉尔合成。 0014 实施例1 0015 T淋巴细胞的增殖作用： 无菌取小鼠脾脏， 1640培养基清洗3次， 5ml注射器芯研磨， 200目筛网过滤， 制成单细胞悬液， 离心(1000r/min， 5min)， 弃上清， Tris-NH4CL破解红细 胞， 冰水浴静置3-5min， 离心(1000r/min,5min)， 弃上清， 用无菌冷PBS洗涤细胞两次。 最后 加入10小牛血清的RPMI1640培养液(5ml)悬浮细胞， 细胞计数， 调整细胞浓度为5106 个/。
10、ml， 于96孔培养板中培养。 0016 实验设空白对照组、 模型组(刀豆蛋白A， sigma公司购买)、 多肽各剂量(3、 6、 12mg/ ml)组。 各组分别加入脾脏淋巴细胞悬液100 l/孔后， 空白对照组加入1640培养液100 l， 模 型组加入ConA(终浓度为5 g/ml)， 多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加ConA(终 浓度为5 g/ml)。 37细胞培养箱静止培养48h， 培养结束后每孔加入20 lMTT， 继续培养 4h， 最后弃掉每孔所有溶液， 每孔加入100 lDMSO， 震荡， 用酶标仪检测570nm处OD值， 每孔设 5个平行。 0017 表1多肽对T淋巴。
11、细胞的增殖作用 0018 0019 *P0.05， *P0.01与模型组相比。 0020 实验结果见表1， 与模型组比较， 多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖， 在剂量为3 12mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系， 以20mg/ml的增殖率最高， 为153.6。 0021 实施例2 0022 CD19免疫原多肽的免疫原性测定： 采用流式细胞技术测定免疫原多肽对CD8+T细 说明书 2/4 页 4 CN 105906705 A 4 胞的影响。 6-8w龄C57BL/6小鼠， 小鼠随机分成4组， 每组10只。 (1)空白组； (2)免疫原多肽低 剂量组； (3)免疫原多肽中剂量组； (4)多肽高。
12、剂量组。 在试验的第0、 7、 14天， 分别进行免疫。 方案为： 空白组加入相同体积的溶剂， 实验组多肽设3个剂量： 1、 2、 4mg/Kg， 在小鼠背部淋巴 结附近多点注射。 30天后， 眼球取血0.8ml， 肝素抗凝， 将血离心后取血细胞层， 用红细胞裂 解液破解红细胞， 洗去裂解的红细胞， 再用荧光标记的单克隆抗CD8+-FITC(购自北京华泰 昕生物医疗技术有限公司)孵育、 固定后， 进行流式细胞技术测定， 评价免疫原多肽对CD8+T 细胞的影响。 0023 表2多肽对CD8+T淋巴细胞的作用 0024 0025 *P0.05， *P0.01与模型组相比。 0026 实验结果见表2。
13、， 与空白组比较， 多肽能促进小鼠CD8+T淋巴细胞， 在剂量为1 4mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系， 以4mg/Kg的增殖率最高， 为156.82。 0027 实施例3 0028 应用竞争性受体-配体亲和法测试多肽与MHC的结合能力： 0029 将多肽与HLA各型的结合能力由竞争性受体-配体亲和法判断。 将固定浓度为50 mol/L的标记125I的多肽以及不同浓度(1-50 mol/L)的多肽加入反应体系(磷酸盐缓冲液 和MHC， 所述的MHC试剂盒购自上海泛柯生物科技有限公司， 试剂盒内有HLA-A1、 A2、 A3、 A11 和A24)， 在反应体系中形成两种复合物， 即待测多肽。
14、MHC复合物和125I标记多肽复合物。 待 测多肽与125I标记多肽竞争与MHC的结合。 用超过滤(产品型号Microcon30， Amicon公司) 分离游离多肽和多肽MHC复合物， 然后测定多肽MHC复合物的125I放射量， 将此放射量与没 有竞争性抑制的多肽MHC复合物(没有加待测多肽的样本)的放射量比较， 求待测多肽在抑 制50标记多肽与MHC结合时的浓度， 即IC50。 由此得到， 多肽对HLA-A1、 A2、 A3、 A11和A24的 IC50值分别为8.67、 6.87、 3.22、 6.53和0.22 mol/L， 均符合阳性多肽的标准(10 mol/L)。 因此， 多肽为具有。
15、有效结合能力的免疫原多肽。 0030 实施例4 0031 CD19免疫原多肽的T细胞结合试验： 采用玫瑰花环试验评价T细胞与人弥漫大B细 胞淋巴瘤(diffuselargeB-celllymphoma,DLBCL)活化B细胞(activatedB-cell,ABC) 型细胞株OCI-Ly3的结合能力。 无菌取豚鼠胸腺， 1640培养基清洗3次， 5ml注射器芯研磨， 200目筛网过滤， 制成单细胞悬液， 离心1000转/分， 10分钟， 弃上清， 以Hank s液调细胞浓度 为3106/ml。 于96孔培养板中培养。 0032 实验设空白对照组、 多肽各剂量(3、 6、 12mg/ml)组。 。
16、各组分别加入胸腺淋巴细胞悬 液100 l/孔后， 空白对照组加入1640培养液500 l， 多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽。 说明书 3/4 页 5 CN 105906705 A 5 37细胞培养箱， 培养48h， 培养结束后每孔中加入100 l/孔OCI-Ly3细胞(细胞浓度为1 106/ml， 含10胎牛血清)， 混匀， 500转/分， 离心5分钟。 弃上清， 加少量戊二醛， 轻轻晃动， 使细胞悬浮， 加甲紫染色， 400倍显微镜观察。 凡结合3个以上肿瘤细胞的T淋巴细胞为花环 阳性细胞。 记数100个T细胞中形成花环的淋巴细胞百分率， 即为T细胞与OCI-Ly3细胞的结 合率。 每孔设。
17、5个平行。 0033 实验结果见表3， 与空白组比较， CD19免疫原多肽可以显著性增加T细胞与OCI-Ly3 细胞的结合率(P0.01)， 低中高剂量组的结合率分别为34.35、 45.30和54.72。 在剂量为3 12mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。 0034 表3多肽对T细胞结合的影响 0035 0036 0037 *P0.05， *P0.01与空白组相比。 0038 实施例5 0039 用人弥漫性大B细胞淋巴瘤移植瘤模型检测CD19免疫原多肽的体内活力。 0040 6-8龄SCID小鼠， 小鼠随机分成4组， 雌雄各半， 每组10只。 (1)空白组； (2)多肽低剂 量组； (。
18、3)多肽中剂量组； (4)多肽高剂量组。 建立人弥漫性大B细胞淋巴瘤移植瘤模型， 在接 种肿瘤细胞后的第3、 5、 7天， 分别进行免疫。 方案为： 空白组加入相同体积的溶剂， 实验组多 肽设3个剂量： 1、 2、 4mg/Kg， 在肿瘤周围多点注射。 21天后， 观察小鼠存活数量， 计算存活率。 结果显示， 剂量1、 2、 4mg/Kg的多肽可有效地保护小鼠， 提高荷瘤小鼠的生存率， 生存率达到 65.87、 70.98和82.98。 说明书 4/4 页 6 CN 105906705 A 6 SEQUENCELISTING 苏州普罗达生物科技有限公司 一种CD19免疫原多肽及其用途 1 PatentInversion3.3 1 37 PRT 人工序列 1 AspAsnAlaValLeuGlnLysLysLysLeuSerAspGlyProThrGln 151015 GlnLeuThrTrpSerArgGluSerProLeuLysLeuLeuLeuSerLeu 202530 GlyLeuProGlyLeu 35 序列表 1/1 页 7 CN 105906705 A 7 。