一种洛伐他汀的制备方法.pdf

本发明公开了一种洛伐他汀的制备方法，包括在发酵培养基中对土曲霉菌种进行发酵以获得洛伐他汀的步骤，其特征在于，在发酵过程中向发酵培养基中添加了苯丙氨酸和/或酪氨酸。本发明的制备方法有效提高洛伐他汀的产量，降低了生产成本。

1.一种洛伐他汀的制备方法，包括在发酵培养基中对土曲霉菌种进行发酵以获得洛伐他汀的步骤，其特征在于，在发酵过程中向发酵培养基中添加了苯丙氨酸和/或酪氨酸。 2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述苯丙氨酸的添加量为发酵培养基的0.001-0.05％(w/w)，更优选的为发酵培养基的0.01-0.03％(w/w)；所述酪氨酸的添加量为发酵培养基的0.005-0.05％(w/w)，更优选的为0.01-0.03％(w/w)。 3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵条件为在26±1℃的条件下发酵180-230小时。 4.根据权利要求1-3中任一所述的制备方法，其特征在于，在发酵的过程中向发酵培养基中添加苯丙氨酸，添加时间为发酵后的0-110小时，更优选的为发酵后的72-96小时。 5.根据权利要求1-3中任一所述的制备方法，其特征在于，在发酵的过程中向发酵培养基中添加酪氨酸，添加时间为发酵后的0-110小时，更优选的为发酵后0-96小时。 6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，洛伐他汀的制备方法中，还包括在发酵之前将菌种在种子培养基中进行培养的步骤，然后再将培养后获得的种子液接种于发酵培养基中，进行发酵。 7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在种子培养基中进行培养的条件为在在温度26±1℃下培养90-96h。 8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将培养后获得的种子液以5-15％的接种量接种于发酵培养基中。 9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，洛伐他汀的制备方法还包括在发酵之后对发酵液进行分离提纯的步骤。 10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵培养基为(按重量百分比计)：20％葡萄糖、4％豆粕、0.5％麦精、1％蛋白胨、0.1％NaCl、0.05％MgSO、0.05％KHPO、0.1％NaNO、余量为水，pH6.8。

技术领域

本发明总的来说涉及一种洛伐他汀的制备方法，尤其涉及一种通过发酵 法制备洛伐他汀的方法。

背景技术

洛伐他汀(lavostatin)是HMG-CoA(3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A)还 原酶抑制剂(HMG-CoA-RI)类微生物药物，它可以有效的降低冠心病和心 肌梗塞的发病率和死亡率。洛伐他汀主要用土曲霉(aspergillus terreus)和红 曲霉(monascus rubber)经深层发酵制取。红曲霉在我国有着广泛的应用， 红曲霉(monascus rubber)不仅产生洛伐他汀(也称莫那可林K，monacolin  K)，而且产生据推测为洛伐他汀生物合成的中间产物的聚酮类物质莫那可林 J、L、X，这些物质都是HMG-CoA-RI类物质，具有很强的降低胆固醇、调 节血脂的功能。土曲霉是现在国内生产洛伐他汀的原始出发菌，它具有优良 的发酵性能、较高的洛伐他汀产生能力、成熟的发酵工艺。但是目前生产中 普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种洛伐他汀的制备方法，从而 有效提高产量，降低生产成本。

为实现上述目的，本发明所提供的一种洛伐他汀的制备方法，包括在发 酵培养基中对土曲霉菌种进行发酵以获得洛伐他汀的步骤，其特征在于，在 发酵过程中向发酵培养基中添加了苯丙氨酸和/或酪氨酸。

优选的，在发酵过程中向发酵培养基中添加了苯丙氨酸和/或酪氨酸，所 述苯丙氨酸的添加量为发酵培养基的0.001-0.05％(w/w)，优选的为 0.01-0.03％(w/w)，所述酪氨酸的添加量为发酵培养基的0.005-0.05％(w/w)， 优选的为0.01-0.03％(w/w)。

根据本发明的一个优选实施方式，在发酵的过程中向发酵培养基中添加 苯丙氨酸，添加时间为发酵后的0-110小时，更优选的为发酵后72-96小时。

根据本发明的另一个优选实施方式，在发酵的过程中向发酵培养基中添 加酪氨酸，添加时间为发酵后的0-110小时，更优选的为发酵后0-96小时。

申请人发现，在发酵过程中，添加苯丙氨酸和/或酪氨酸，均能提高洛伐 他汀的产量，但是在发酵后的上述添加时间加入苯丙氨酸和/或酪氨酸，效果 更好。其它发酵的条件本领域技术人员可以根据常规发酵方法进行选择。例 如，可在发酵药瓶中，以200r/min在26±1℃的旋转式摇床中进行发酵180-230 小时。

本发明的洛伐他汀的制备方法中，通常还包括在发酵之前将菌种在种子 培养基中进行培养的步骤，然后再将培养后获得的种子液接种于发酵培养基 中，进行发酵。优选的，在种子培养基中进行培养的条件为在在温度26±1 ℃下培养90-96h。优选的，将培养后获得的种子液以5-15％的接种量接种于 发酵培养基中。

本发明的洛伐他汀的制备方法中，通常还包括在发酵之后对发酵液进行 分离提纯的步骤。例如对发酵液进行过滤、萃取、结晶、干燥，以获得洛伐 他汀成品。

根据本发明的一个具体实施方式，可以先将菌种接种于种子培养基中， 在温度26±1℃下培养90-96h，然后按10％接种量将培养后获得的种子液接 种于发酵培养基中，200r/min，26±1℃旋转式摇床进行发酵，在发酵后0-96 小时的过程中，添加占发酵培养基的重量百分比的0.001-0.05％的已灭菌苯丙 氨酸，或者在发酵后0-110小时的过程中，添加占发酵培养基的重量百分比 的0.005-0.05％已灭菌的酪氨酸。培养216h；将所得发酵液按常规处理，过 滤、萃取、结晶、干燥，即得洛伐他汀成品。

本发明中，发酵培养基可以按照常规配制方法进行配制。例如，发酵培 养基可以为(按重量百分比计)：20％葡萄糖，4％豆粕，0.5％麦精，1％蛋白胨， 0.1％NaCl，0.05％MgSO4，0.05％KH2PO4，0.1％NaNO3，余量为水，pH6.8。

本申请的发明人在研究提高洛伐他汀产量的过程中惊奇的发现，向土曲 霉的发酵培养基中加入苯丙氨酸和/或酪氨酸，能显著提高洛伐他汀的产量， 降低了生产成本。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅 用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

除特别说明外，以下实施例中所使用的％、‰均为重量比。

在本发明的实施例中，将土曲霉菌(Aspergillus terreus)斜面(即菌种) 接种于摇瓶种子培养基中，26±0.5℃摇床转速200转/分，周期90-96小时； 按10％接种量接入摇瓶发酵培养基中，发酵培养基按常规配制方法配制，发 酵培养基的配方为：20％葡萄糖，4％豆粕，0.5％麦精，1％蛋白胨，0.1％NaCl， 0.05％MgSO4，0.05％KH2PO4，0.1％NaNO3，余量为水，pH6.8，发酵温度 为26±1℃。

在本发明的实施例中，洛伐他汀的含量测定采用HPLC进行检测。

实施例1添加苯丙氨酸对洛伐他汀产量的影响

1.1苯丙氨酸的添加量对洛伐他汀生物合成的影响

配制洛伐他汀的发酵培养基，向洛伐他汀发酵培养基中分别加入重量比 如表1所示的苯丙氨酸，同时，以不添加苯丙氨酸的发酵培养基作为对照， 接入土曲霉菌(Aspergillus terreus)发酵培养216小时后，取样测定洛伐他 汀的含量。结果如表1所示。

表1、添加苯丙氨酸对洛伐他汀产量的影响

  苯丙氨酸加量(％)   0   0.001   0.01   0.02   0.03   0.04   0.05   相对含量   100   105   120   119   117   109   110

由表1的结果可见，在发酵培养基中添加苯丙氨酸可明显提高洛伐他汀 的生物合成，优选的加量范围为0.01-0.03％

1.2苯丙氨酸的添加时间对洛伐他汀产量的影响

配制洛伐他汀的发酵培养基，接入土曲霉菌(Aspergillus terreus)发酵 培养，分别在0、24、48、72、96、110小时向培养基中添加重量比为0.01％ 的苯丙氨酸，同时，以不加苯丙氨酸的发酵培养基作为对照培养基，总发酵 时间216小时，取样测定洛伐他汀的含量。结果如表2所示。

表2、苯丙氨酸的添加时间对洛伐他汀产量的影响

 苯丙氨酸添加时间(h)   0   24   48   72   96   110   对照  相对含量   108   112   117   124   123   115   100

由表2的结果可见，在发酵0-110小时向发酵培养基中添加苯丙氨酸均 可明显提高洛伐他汀的生物合成，更优选的添加时间为发酵后72-96小时。

实施例2添加酪氨酸对洛伐他汀生物合成的影响

2.1酪氨酸的添加量对洛伐他汀生物合成的影响

配制洛伐他汀的发酵培养基，向洛伐他汀发酵培养基中分别加入重量比 为0.005％、0.01％、0.03％、0.05％的酪氨酸，同时，以不添加酪氨酸的发酵 培养基作为对照，接入土曲霉菌(Aspergillus terreus)在26±1℃下发酵培养 216小时后，取样测定洛伐他汀的含量。结果如表3所示。

表3、添加酪氨酸对洛伐他汀产量的影响

  酪氨酸加量(％)   0   0.005   0.01   0.03   0.05   相对含量   100   108   116   115   109

由表3的结果可见，在发酵培养基中添加酪氨酸可明显提高洛伐他汀的 生物合成，优选的加量范围为发酵培养基的0.01-0.03％。

2.2酪氨酸的添加时间对洛伐他汀产量的影响

配制洛伐他汀的发酵培养基，接入土曲霉菌(Aspergillus terreus)发酵 培养，分别在0、24、48、72、96、110小时向培养基中添加重量比为0.01％ 的酪氨酸，同时，以不加酪氨酸的发酵培养基作为对照培养基，总发酵时间 216小时，取样测定洛伐他汀的含量。结果如表4所示。

表4、酪氨酸的添加时间对洛伐他汀产量的影响

 酪氨酸添加时间(h)   0   24   48   72   96   110   对照  相对含量   118   120   119   120   114   102   100

由表4的结果可见，在发酵0、24、48、72、96、110小时向发酵培养基 中添加酪氨酸可明显提高洛伐他汀的生物合成，优选的添加时间为0-96小 时。

综上所述，在土曲霉菌(Aspergillus terreus)的发酵培养基中添加苯丙 氨酸和酪氨酸，均可明显提高洛伐他汀的产量，产量最高提高了24％；其最 适添加量、最适添加时间分别为：72-96小时添加重量百分比为发酵培养基 的0.01-0.03％的苯丙氨酸；0-96小时添加重量百分比为发酵培养基的 0.01-0.03％酪氨酸。

实施例3同时添加苯丙氨酸和酪氨酸对洛伐他汀生物合成的影响

3.1同时添加苯丙氨酸和酪氨酸添加量对洛伐他汀生物合成的影响

配制洛伐他汀的发酵培养基，同时向洛伐他汀发酵培养基中分别加入重 量比为0.005％、0.01％、0.03％、0.05％的酪氨酸和苯丙氨酸，同时，以不添 加酪氨酸和苯丙氨酸的发酵培养基作为对照，接入土曲霉菌(Aspergillus  terreus)在26±1℃下发酵培养216小时后，取样测定洛伐他汀的含量。结 果如表5所示。

表5、同时添加苯丙氨酸和酪氨酸对对洛伐他汀产量的影响

由表5的结果可见，在发酵培养基中同时添加苯丙氨酸和酪氨酸可明显 提高洛伐他汀的生物合成，优选的加量范围为发酵培养基的0.01-0.03％。

2.3同时添加苯丙氨酸和酪氨酸添加时间对洛伐他汀产量的影响

配制洛伐他汀的发酵培养基，接入土曲霉菌(Aspergillus terreus)发酵 培养，分别在0、24、48、72、96、110小时向培养基中添加重量比为0.01％ 的酪氨酸和苯丙氨酸，同时，以不加酪氨酸和苯丙氨酸的发酵培养基作为对 照培养基，总发酵时间216小时，取样测定洛伐他汀的含量。结果如表5所 示。

表5、同时添加苯丙氨酸和酪氨酸的添加时间对洛伐他汀产量的影响

 酪氨酸添加时间(h)   0   24   48   72   96   110   对照  相对含量   112   116   114   120   114   102   100

由表4的结果可见，在发酵0、24、48、72、96、110小时向发酵培养基 中同时添加苯丙氨酸和酪氨酸可明显提高洛伐他汀的生物合成，优选的添加 时间为0-96小时。

虽然本文已经描述出本发明的优选的实施方式，但是很明显对于本领域 技术人员而言可以进行的许多改变和修改并不能超出从本发明的较宽方面的 范围。因此，所附的权利要求是为了试图覆盖所有在本发明的真实精神和范 围之内的所有的改变和修改。