背景技术
1.技术领域
本发明公开的主题涉及用于培养微生物和检测微生物的培养基和方法。
2.相关文献
美国专利申请No.10\597909,用于李斯特菌(LISTERIAspp.)的选择性生长培养基,申请 日2005年2月12，,公开了包括氯化锂和选择试剂的成分。
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发明内容
在一个实施例中公开的培养基中，包含具有生物有效浓度的非螯合镁离子和除氧剂。
在另一些的实施例中，所述除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧化氢、巯基乙酸盐、半胱氨酸、 oxyraseTM、Na2S和FeS组成的组。
在另一些实施例中，所述培养基进一步包含具有生物有效浓度的锂盐；或铁(III)盐；或 锂盐和铁(III)盐。
在另一些实施例中，所述培养基进一步包含选择剂。
在另一些实施例中，所述培养基进一步包含基本无镁的螯合缓冲液。
在另一些实施例中，所述培养基用于培养李斯特菌(Listeriaspp.)。
在另一些实施例中，
所述铁(III)盐的浓度大于约0.05g/L；
所述锂盐以大于约0.1g/L的浓度存在；
所述镁盐以大于约0.1g/L的浓度存在；并且所述除氧剂以大于约0.1g/L的浓度存在。
在一些实施例中，所述培养基进一步包含选择剂。
在一个具体实施例中公开了用于培养生物样品的方法，所述方法包含：在包含具有生物有 效浓度的非螯合镁离子和除氧剂的培养基上培养所述生物样品。
在所述方法的一些实施例中，所述培养基包含锂盐；或铁(III)盐；或锂盐和铁(III) 盐。
在所述方法的另一些实施例中，所述培养基进一步包含选择剂。
在所述方法的另一些实施例中，
所述铁(III)盐以大于约0.05g/L的浓度存在；
所述锂盐以大于约0.1g/L的浓度存在；
所述镁盐以大于约0.1g/L的浓度存在；并且
所述除氧剂以大于0.1g/L的浓度存在。
在一些具体实施例中，所述方法用于培养李斯特菌(Listeriaspp.)。
在一个实施例中公开了一种用于检测样品中的细菌的方法，所述方法包含培养所述样品的 步骤，所述样品中存在具有生物有效浓度的：a)非螯合镁离子，和b)除氧剂。
在所述方法的一个实施例中，所述除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧化氢、巯基乙酸盐、半胱 氨酸、oxyraseTM、Na2S和FeS组成的组。
在所述方法的一个实施例中，所述培养在下列物质存在的情况下进行：
a)锂盐；或
b)铁(III)盐；或
c)锂盐和铁(III)盐。
在所述方法的一个实施例中，所述培养在选择剂存在的情况下进行。
在所述方法的一个实施例中，所述细菌是李斯特菌(Listeriaspp.)。
在一个实施例中公开了一种用于补充培养基的配方，所述配方包含无镁螯合缓冲液和除氧 剂。
在另一些实施例中，所述配方还包含具有生物有效浓度的：
a)锂盐；或
b)铁(III)盐；或
c)锂盐和铁(III)盐
在另一些实施例中，公开了用所述配方培养李斯特菌的用途。
在一个具体实施例中，公开了适于稀释的用于制作液体培养基的粉末状培养基，所述培养 基包含具有生物有效浓度的非螯合镁离子和除氧剂。
在所述粉末培养基的另一些实施例中，稀释过的培养基进一步包含具有生物有效浓度的：
a)锂盐；或
b)铁(III)盐；或
c)锂盐和铁(III)盐。
在一个具体实施例中，公开了用于培养李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括除氧剂和无镁 螯合缓冲液。
此处所述主题的特征和益处将通过以下详细描述的优选实施例的详细描述而变得更加明 显，如附图所示。公开和请求保护的主题可在各方面进行修改，只要不脱离权利要求的范围， 都是可以实现的。因此，附图和说明书实质上是用于解释性的，而不是限制性的且所述主题的 全部范围记录在权利要求书中。
优选实施例的详细说明
术语
在本公开中，“包含”一词被用在非限制性句子中表示紧接着该词的内容被包括进来，但是 没有特别提及的内容不代表被排除了。能被理解的是在包含或可能包含特定特征或变量或参数 的具体实施例中，一些实施例可能由或基本上由这些特征或变量或参数组成。采用不定冠词“一 种”限定的某种元素不排除多种该元素存在的可能，除非上下文明确限定一种和只有一种该元 素。
本公开中，通过端点表示的数值范围包括此范围内所有的数，包括所有完整的数，所有整 数，所有的小数(例如，1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5等)。
本公开中，单数形式“一个”和“所述”包括对复数的指代除非上下文内容明确限定指代其它 的。因此，例如，包含“一种化合物”配方的表述包括表示两种或以上化合物的混合物。
本公开中，“或者”一词采用包括“和/或”的含义，除非上下文另有明确规定。
本公开中，除非另有指明，说明书和权利要求书中列出的用于表示数量或组成成分、特性 测量值等的所有数值可在所有情况下理解为采用“大约”一词进行修饰后的意思。因此，除非根 据上下文有相反的或必要的指示，本公开中列出的数值参数为基于所需特性的可变化的近似 值，本领域技术人员利用本公开的内容并根据测量和定量的不准确性可试图获得所述特性。在 不限制等同原则适用于权利要求的范围的情况下，每个数值参数应至少根据已报道的重要数值 的数量以及利用普通的四舍五入方法进行分析。尽管本公开宽范围中列出的数值范围和参数为 近似值，它们在具体实施例中所列的数值仅广义地理解到一定程度，该程度与使本公开的有效 性以及公开和请求保护的主题与现有技术的区别是一致的。
本公开中，术语“POD”表示差异概率，且术语“dPOD”表示差异概率方面的差异。
本公开中，“灵敏度”或“灵敏度比率”的定义为：灵敏度比率＝(Actero/李斯特菌法得到的阳 性环境样品数/二代扩繁得到的阳性环境样品数)×100％。
本公开中，“特异性”或“特异性比率”的定义为：特异性比率＝(Actero/李斯特菌法得到的阴 性环境样品数/二代扩繁得到的阴性环境样品数)×100％。
本公开中，“方法一致性”的定义为：方法一致性＝[1–|(Actero/李斯特菌法得到的真阳性和 真阴性检测样品数–参考方法得到的真阳性和真阴性检测样品数)/总样品数|]×100％。
本公开中，“精确性”的定义为：精确性[Actero/李斯特菌法得到的阳性检测样品数/参考方 法得到的阳性检测样品数]×100％。
本公开中，“培养基”、“肉汤”、“培养液”等均涉及适于培养所需微生物(可能是细菌或微 生物菌株或品种)的营养混合物。在特定的实施例中，培养基可能包含水、琼脂、蛋白质、氨 基酸、酪蛋白水解物、盐、脂类、碳水化合物、盐、矿物质和pH缓冲液的一种或多种以及可能 含有提取物例如肉提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、植物蛋白胨、蛋白胨和麦芽提取物并可能 包含LB培养基。在实施例中，培养基可能是简单的、复杂的或限定的培养基并且可能是扩繁培 养基并且可能以不同方式进行补充，这些方式为本领域技术人员所熟知。在实施例中，培养基 可能包含MOPS缓冲液、铁(III)盐比如柠檬酸铁，镁盐比如硫酸镁，锂盐比如氯化锂并且可能 包含丙酮酸盐。在实施例中，培养基可能包含或由本文所定义的任何核心培养基组成。在实施 例中，培养基可能是简单的、复杂的或限定的培养基并且可能是扩繁培养基并且可能以不同方 式进行补充，这些方式为本领域技术人员所熟知。“Actero/李斯特菌”和“ALEM”肉汤、培养 基、扩繁培养基等被用作基于实施例的培养基的一般用词。
在实施例中，培养基含有可能是无镁螯合缓冲液的pH缓冲液。在一个系列的实施例中， 所述pH缓冲液是MOPS钠盐和MOPS游离酸的混合物，但是在替代实施例中一系列其他缓冲 液如碳酸盐和磷酸盐溶液也是可用的并且本领域技术人员能够轻易地选择使用并获得所需的培 养基pH值。
在实施例中，培养基可能以粉末或浓缩物的形式被提供，通常也被称为“粉末培养基”、“培 养基粉末”、“培养基浓缩物”、“浓缩培养基”等，它包含多种成分并适于与定量的水结合提供具 有所需浓度的特定成分的液体培养基。这样的粉末培养基或浓缩培养基可能是完整的，这意味 着只需在使用前将它溶于适量的水(一般是无菌水)。作为选择，在实施例中另一种情况是， 粉末或浓缩培养基可能是不完整的，这意味着需要添加额外的成分来获得适于使用的完整的培 养基。在实施例中，粉末或浓缩的培养基也包括浓缩的至少部分水合的培养基，它在溶解后形 成用于培养细菌的培养基。除非文章另有要求，本文所用的“培养基”可以理解为不仅包括成分 浓度适合培养细菌和微生物的最终培养基，还包括适于稀释的粉末或浓缩培养基。
本公开中，“除氧剂”表示能去除或失活游离氧或氧自由基的化学制品。在特定的实施例 中，除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧化氢、巯基乙酸盐或化合物、L-(+)-半胱氨酸盐酸盐、L-半胱 氨酸、oxyraseTM酶(Patel,1995)、Na2S和FeS组成的组。在特定的实施例中，除氧剂是左旋 的(L)或右旋的(D)形式的并且可能是外消旋形式的或这几种的混合物。本领域技术人员能熟 练选择这些试剂并基于所讨论的实施例根据其生物兼容性对这些除氧剂进行选择。在实施例 中，当除氧剂或任何其他与本公开有关的试剂为盐时，任何生物有效的和兼容的盐都是可用的 并且本领域技术人员能熟练的识别和避免使用不适合的盐。在实施例中，盐为钠盐或钾盐。
在本公开中，“丙酮酸盐”表示和包括所有丙酮酸(也叫2-氧代丙酸)的所有盐类和任何包 含丙酮酸盐阴离子的化合物和任何它们的生物有效异构体或替代物。在实施例中，丙酮酸盐是 丙酮酸钠或丙酮酸钾。本领域技术人员能熟练的识别和避免使用不具有生物有效性或不适合的 盐类，比如有毒性的盐类。
本领域技术人员可以轻而易举地意识到应当避免使用对目标细菌致命或有毒的盐和其他化 合物且本领域技术人员能够很容易地识别这种盐和化合物。
在本公开中，碱金属为锂、钠、钾、铷、钙和钫中的任何一种以及碱金属盐并且碱金属盐 为前述中任何一种碱金属的生物可接受的盐类。在实施例中，盐是可溶解的并且可能是有机或 无机的，并且根据实施例可能是氯化物、磷酸盐、硝酸盐、磷酸氢盐、丙酮酸盐、醋酸盐。
本公开中，动词“缓冲”指以本领域技术人员显而易见的方式使溶液的pH稳定在预定范围 内，所述溶液可能是培养基。名词“缓冲”表示适于稳定溶液pH的化学药品。
本公开中，“盐”指可溶的盐或在相应条件下基本或部分可溶的盐。
本公开中，关于“生长”或“培养”样品或微生物表示一个过程，即将样品或微生物放置在适 宜或基本适宜维持或促进生长或分化一种或多种目标微生物的条件下的过程。这些术语可以理 解为包括一种情况，其中样品被暴露于目的微生物是否真实存在或能被检测到的相关条件下。
本公开中，“盐”指任何生物相容的盐，它是可溶的或基本可溶的或在适宜培养条件下的溶 解程度能达到所需生物有效性。
本公开中，“无镁螯合缓冲液”或“基本无镁螯合缓冲液”表示基本不含来自溶液的螯合的或 螯合溶解的镁离子的缓冲液或者镁离子含量未达到生物显著程度的缓冲液。在特定实施例中， 无镁螯合缓冲液是或包含3-(N-吗啉)丙磺酸，也指3-吗啉代丙烷-1-磺酸、3-(N-吗啉)丙磺 酸、3-(N-吗啉)propansulfonic酸、4-吗啉丙磺酸和“MOPS”，或者无镁螯合缓冲液是或包含 MOPS钠盐和MOPS游离酸的混合物。在替代实施例中，可以利用无镁螯合缓冲液生物可接受 的范围，且本领域技术人员容易识别和选择该范围。在某些实施例中，这种缓冲液可被替代或 者是MOPS的化学修饰形式。类似地，“未螯合的”或“非螯合的”表示离子或化学成分在溶液中 为基本游离状态。
本公开中，“基础”或“核心”培养基或肉汤指包含某些为本领域技术人员所熟知的基本需要 的成分的部分培养液，并且它的具体组成是可以变动的只要仍然适合于支持任何目标微生物的 生长。因此在实施例中，核心培养基包含盐、缓冲液和蛋白提取物，并且在实施例中，核心培 养基包含碳酸盐或磷酸盐或MOPS缓冲液或可能包含钠盐、镁盐和钙盐。在实施例中，1升核 心培养基的配方如表1所示。然而，在替代实施例中，核心培养基包含水、琼脂、蛋白质、氨 基酸、酪蛋白水解物、盐类、脂类、碳水化合物、盐、矿物质和pH缓冲液中的一种或多种， 并且在实施例中核心培养基包含提取物比如肉提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、植物蛋白胨、 蛋白胨和麦芽提取物，并且在实施例中，培养基是或者包含LB培养基；低盐LB培养基(1％ 蛋白胨，0.5％酵母提取物和0.5％NaCl)，SOB培养基(2％蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4)，SOC培养基(2％蛋白胨、0.5％酵母提取 物、10mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4、20mMGlucose)，超级肉汤 (3.2％蛋白胨、2％酵母提取物和0.5％NaCl)，2xTY培养基(1.6％蛋白胨、1％酵母提取物和 0.5％NaCl)，TB培养液(1.2％蛋白胨、2.4％酵母提取物、72mMK2HPO4、17mMKH2PO4和 0.4％甘油)，LB米勒培养液或LB伦诺克斯培养液(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％ NaCl)。
表1：基础培养基的一般成分
成分 生产商 规格(g/L) 植物蛋白胨 BD BBL(211906) X-Y 胰蛋白胨 Oxoid(LP0042) X-Y 牛肉提取物 BD BBL(212303) X-Y 酵母提取物 BD Bacto(212750) X-Y
表1中，X和Y是以克为单位的数值。每一组X和Y可以分别为0.0,0.01,0.02,0.03,0.04, 0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.11,0.12,0.13,0.14,0.15,0.16,0.17,0.18,0.19.0.2,0.3,0.4,0.5,0.6, 0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0, 3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4, 5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8, 7.9,8.0,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9,9.0,9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,10.0,10.1, 10.2,10.3,10.4,10.5,10.6,10.7,10.8,10.9,11.0,11.1,11.2,11.3,11.4,11.5,11.6,11.7,11.8,11.9, 12.0,12.1,12.2,12.3,12.4,12.5,12.6,12.7,12.8,12.9,13.0,13.1,13.2,13.3,13.4,13.5,13.6,13.7, 13.8,13.9,14.0,14.1,14.2,14.3,14.4,14.5,14.6,14.7,14.8,14.9,15.0,15.1,15.2,15.3,15.4,15.5, 15.6,15.7,15.8,15.9,16.0,16.1,16.2,16.3,16.4,16.5,16.6,16.7,16.8,16.9,17.0,17.1,17.2,17.3, 17.4,17.5,17.6,17.7,17.8,17.9,18.0,18.1,18.2,18.3,18.4,18.5,18.6,18.7,18.8,18.9,19.0,19.1, 19.2,19.3,19.4,19.5,19.6,19.7,19.8,19.9,20克等，并且在特定实施例中，X/Y的范围由X和Y 的值决定。可以理解的是，在特定的实施例中，本领域技术人员能熟练选择植物蛋白胨、胰蛋 白胨、牛肉提取物和酵母提取物的修饰形式作为上述物质的替代物。在某些实施例中，可以利 用另一种镁盐、钙盐和钠盐，并且在特定实施例中可以选择镁盐、钙盐和钠盐的替代物。在某 些实施例中，核心培养基包括缓冲液并且在实施例中，所述缓冲液为MOPS缓冲液。本领域技 术人员能熟练地对基本培养基成分进行调整以符合特定的目的。可以理解的是，在基础培养基 上所作的与此处公开的扩繁有效性作用一致的任何变形也都包括在该主题请求保护的范围内。
表2：根据特定实施例的基础培养基配方
成分 规格(g/L) 植物蛋白胨 5 胰蛋白胨 5 牛肉提取物 5 酵母提取物 5
本领域技术人员熟知选择适合于所讨论的微生物的温度最有利于所需微生物的生长。在特 定的实施例中，所需微生物是李斯特菌且在约29℃,30℃,31℃,32℃,33℃,34℃,35℃,36℃, 37℃,38℃,39℃,40℃,41℃,42℃,43℃等温度下进行培养并且可以将使用的肉汤预热至这一温 度来准备受试样品的接种。在特定的实施例中在约35℃下进行培养且可以将使用的肉汤预热至 这一温度来准备受试样品的接种。在本文公开的实施例中，在29℃到43℃范围内的任何温度 进行培养且可能在约29℃,30℃,31℃,32℃,33℃,34℃,35℃,36℃,37℃,38℃或39℃或40℃ 或41℃或42℃或43℃或29℃和30℃之间，30℃和31℃之间,31℃和32℃之间,32℃和 33℃之间,33℃和34℃之间,34℃和35℃之间,35℃和36℃之间,36℃和37℃之间,37℃和 38℃之间,38℃和39℃之间,39℃和40℃之间,40℃和41℃之间,41℃和42℃之间,或42℃ 和43℃之间，或在34℃和43℃之间，或35℃和42℃之间，或36℃和42℃之间，或38℃ 和42℃或39℃和41℃之间，或39℃和40℃或38℃和39℃之间，或39℃和40℃之间，或 40℃和41℃之间，或41℃和42℃之间，或42℃和43℃之间的某一个温度下进行培养。在实 施例中，温度在32℃和38℃之间或在33℃和37℃之间。本公开中，培养基的“富集”指添加 选定的成分来促进一种或多种所需微生物的生长或其他特性。“富集溶液”指包含这类添加成分 的溶液。在实施例中，富集溶液中包括的成分包括MOPS、铁(III)盐、锂盐、丙酮酸盐的一种 或多种，并且在实施例中，选择性富集补充剂包含选择剂如萘啶酸、放线菌酮和盐酸吖啶黄。 在特定的实施例中，富集培养液含有硫酸镁、氯化锂、柠檬酸铁、丙酮酸钠和富集补充剂中的 一种或多种。
表3：一个实施例中富集培养基的一般成分
每一组X和Y分别为0.0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.11,0.12, 0.13,0.14,0.15,0.16,0.17,0.18,0.19.0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6, 1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0, 4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0,6.1,6.2,6.3,6.4, 6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8.0,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8, 8.9,9.0,9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,10.0,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26,27,28,29or30克或上述数值之间的任意值，并且在特定变体的实施例中，X到Y的 范围由X和Y的值确定。可以理解的是，调整MOPS盐和MOPS游离酸的相对量对于达到所 需pH是必需的。
每一组A和B分别为0.0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.11,0.12,0.13, 0.14,0.15,0.16,0.17,0.18,0.19.0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7, 1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1, 4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5, 6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8.0,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9, 9.0,9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,10.0,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29,30,40,50,60,70,80,90,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,2000, 3000,4000,5000,6000,7000,8000,9000,10,000,11,000,12,000,13,000,14,000,15,000,16,000, 17,000,18,000,19,000,20,000,30,000,40,000,50,000,60,000,70,000,80,000,90,000or100,000 mg/l。
表4：特定实施例中富集培养基的成分
*按表中所示重配一份，向1L培养基中加入2.7mL内容物。
然而，本领域技术人员可以很容易地理解这些数值可以调整以满足特定要求，在替代实施 例中最终的扩繁培养基的培养液中包括约1x10-6,2x10-6,3x10-6,4x10-6,5x10-6,6x10-6,7x10-6, 8x10-6,9x10-6,1x10-5,2x10-5,3x10-5,4x10-5,5x10-5,6x10-5,7x10-5,8x10-5,9x10-5,1x10-4,2x10-4, 3x10-4,4x10-4,5x10-4,6x10-4,7x10-4,8x10-4,9x10-4,1x10-3,2x10-3,3x10-3,4x10-3,5x10-3,6x10-3, 7x10-3,8x10-3,9x10-3,1x10-2,2x10-2,3x10-2,4x10-2,5x10-2,6x10-2,7x10-2,8x10-2,9x10-2,1x10-1, 2x10-1,3x10-1,4x10-1,5x10-1,6x10-1,7x10-1,8x10-1,9x10-1,10,20,30,40,50,60,70,80,90,1x102, 2x102,3x102,4x102,5x102,6x102,7x102,8x102,9x102,1x103,2x103,3x103,4x103,5x103,6x103, 7x103,8x103,9x103g/L或mg/L左右的单个成分。
本公开中，培养基“补充剂”指溶液、液体、固体或其他用于培养基添加的物质。补充剂有 促进一种或多种微生物生长的效果并且在具体的实施例中，补充剂选择性地促进相对于其它非 期望的微生物的一种或多种微生物的生长。在特定的实施例中，补充剂包含镁盐、锂盐、铁(III) 盐、丙酮酸盐和选择性试剂的一种或多种，或者包含能够随时通过转换或代谢形成前述任何物 质的前体或修饰形式。在实施例中，补充剂是可以促进李斯特菌生长的补充剂。本公开中，“选 择剂”是有利于所需微生物生长或抑制非目的微生物生长的化学成分或培养条件。在特定的实施 例中，选择剂包括抗体、磺胺类药物或杀菌剂。在特定的实施例中，选择剂是或者包含萘啶 酸、放线菌酮和盐酸吖啶黄的一种、两种或全部三种，或者包括适当的等价物或另外的替代 物。“选择性扩繁补充剂”相当于“选择剂”。在特定的实施例中，放线菌酮的使用浓度为每升培 养基中约33.75mg，并且在替代实施例中为每升培养基中15-50mg，或者每升培养基中大于5, 10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100mg或以上。在特定的实施例 中，萘啶酸的使用浓度为每升培养基中约27mg，或者每升培养基中10-50mg，或者每升培养 基中大于5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100mg或以上。在实 施例中，盐酸吖啶黄的使用浓度约为10.125mg/L，或6.000-15.000mg/L，或每升培养基中大于 1.000,2.000,3.000,4.000,5.000,6.000,7.000,8.000,9.000,10.000,11.000,12.000,13.000,14.000, 15.000,16.000,17.000,18.000,19.000,20.000mg或以上。但是本领域技术人员能够识别使用选择 剂的浓度范围并为了特定目的做出适当调整。
本公开中，“Actero/李斯特菌”、“Actero/李斯特菌”和“ALEM”、培养液、培养基、扩繁培养 液等都是指相关实施例中的培养液或培养基。
本公开中，“培养条件”指培养微生物的因素并且包括培养基的化学组成和物理性质以及温 度、搅拌、封闭和培养的持续时间。因此在特定的替代实施例中，培养在29℃-43℃之间进 行，并且在特定的实施例中培养在约39℃的温度下进行。可以理解的是，在一些实施例中，温 度在30℃以上和25℃以下，并且在实施例中温度保持在29℃-43℃之间且实施例在约29℃, 30℃,31℃,32℃,33℃,34℃,35℃,36℃,37℃,38℃或39℃或40℃或41℃或42℃或43℃下或 在29℃-30℃之间、30℃-31℃之间、31℃-32℃之间、32℃-33℃之间、33℃-34℃之间、34℃- 35℃之间、35℃-36℃之间、36℃-37℃之间、37℃和38℃之间、38℃-39℃之间、39℃-40℃ 之间、40℃-41℃之间、41℃-42℃之间或42℃-43℃之间，或者在34℃-43℃之间或35℃-42℃ 之间或36℃-42℃之间或38℃-42℃之间或39℃和41℃之间或39℃-40℃之间或38℃-39℃之 间或39℃-40℃之间或40℃-41℃之间或41℃-42℃之间或42℃-43℃之间的某一个温度下得以 实施。在实施例中，还可以使用32℃-38℃之间或33℃-36℃之间的温度利用本文公开的培养 基培养微生物，但是发现约25℃和约30℃范围之外的温度会加快其它非目的微生物的生长并 抑制李斯特菌的生长。培养基的pH通常设置在7-8之间，并且比如在特定的实施例中，可能是 约7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9或8.0，或者在前述任何两个值的范围内。可以理解 的是，pH7-8范围之外的pH值在实施例中也是可用的，但是会对培养的效率和选择性产生不利 影响。接种完样品之后，按所需的周期进行培养，但是发现在非限制性实施例中，24小时的培 养周期已经足够将李斯特菌扩繁到足够的利用常规方法进行检测的数量。然而，在基于特殊目 的的替代实施例中，培养周期或长或短并且达到或低于0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48小时等。本领域技术人员能熟练选择适合的培养周期以符合特定要求。
本公开中，“微生物”指细菌，可以是致病菌且在实施例中为李斯特菌。
本公开中，微生物“检测”指无论微生物或微生物变化是否能被实际检测到，对微生物在生 物样品中存在或变化进行观察的过程。换句话说，测试样品中微生物或微生物水平变化的行为 即“检测”，即使该微生物被确定不存在或低于灵敏度水平。检测是定量、半定量或不定量观察 并且基于与一种或多种对照样品的比较。检测能被应用于任何样品，其中微生物的存在或不存 在能得到确定，并且在特定的实施例但不限于前述的一般性的情况下，样品是或者包含生物物 质的任何形式并且可以包含土壤或非土壤物质、肉类、家禽肉、鱼肉、海鲜、蔬菜、水果、乳 制品、牛奶、蛋、包装食品、罐头食品、瓶装食品或包裹的食品。
在实施例中，检测微生物的步骤包含但不限于使用PCR、实时PCR、外源凝集素、简易扩 散、横向扩散、免疫检测、侧向层析或通过一定方法的层析来检测培养过程中微生物的存在。 通过举例，在特定的实施例中，可能的检测方法包括或使用但不限于US6483303；US6597176； US6607922；US6927570和US7323139任何一篇中公开的主题。
本公开中，“样品”和“生物样品”具有与它们的内容相一致的相同的最广泛的可能的含义， 并且一般指但不限于任何由于一种或多种目的微生物存在而需要被检测的物质，并且包括所有 这类主题不管它是否包含任何微生物或任何目的微生物以及不管它是否包含沙门氏菌或大肠杆 菌。在实施例中，样品可以通过取一片或一部分获得或通过棉签、擦拭、过滤、涂片的方式来 获得，这些方式能被本领域技术人员熟练理解和操作。在特定的实施例中，样品是或者包含食 品材料或植物或动物材料或肉类、海鲜、鱼肉、蔬菜、水果、沙拉、速食食品、蛋类、乳制 品、组合和非组合食物材料、罐头食品或其它任何形式的生鲜的、生的、煮熟的、未煮熟的、 冰冻的、冷藏的、磨碎的、切碎的、罐装的、热加工的、干燥的、保藏的、提炼的或任何腌制 的食品。在进一步的实施例中，样品取自环境、表面、容器或场所，其中它需要确定目的微生 物是否存在，例如但不限于，厨房表面、厨具表面、食品储存容器、餐具、冷藏室、冰箱、显 示容器、包装材料、活的植物和动物以及其它环境、场所、表面或任何用户感兴趣的材料。本 领域技术人员能理解并采取合适的方法选择、获得并处理实施例中使用的任何样品。在优选的 实施例中，样品为肉类、鱼肉、海鲜、蔬菜、蛋类或乳制品等样品。
根据实施例的培养基
实施例中公开的培养基包含具有生物有效浓度的非螯合镁离子和除氧剂。“生物有效浓度” 可以理解为描述的是非螯合镁离子和除氧剂二者的浓度，并且本领域技术人员能熟练地调整这 二者的浓度，但是在特定实施例中应该以保证二者组合的有效性的的方式作出这种调整。在实 施例中，除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧化氢、巯基乙酸盐、半胱氨酸、oxyraseTM、Na2S和FeS 组成的组。
在实施例中，培养基包含具有生物有效浓度的非螯合镁离子和具有生物有效浓度的选自由 锂盐、铁(III)盐、和丙酮酸盐组成的组的至少一种成分。在不同的实施例中，培养基包含选自 如下组中的至少两种、三种或四种的生物有效组合，该组由锂盐、镁盐、铁(III)盐和丙酮酸盐 组成。在不同的实施例中，培养基进一步包含一种或多种选择剂。在不同的实施例中，培养基 是一种缓冲的培养基并且在不同的实施例中缓冲液基本上为无镁螯合缓冲液。在实施例中，铁 (III)盐存在的浓度大于约0.05g/L；锂盐存在的浓度大于约0.1g/L；镁盐存在的浓度大于约 0.1g/L；丙酮酸盐存在的浓度大于约0.1g/L。在实施例中培养基是用于培养李斯特菌的。
在进一步的替代实施例中，培养基包含至少三种、四种、五种或全部六种选自如下组的成 分，这些组由无镁螯合缓冲液、锂盐、镁盐、铁(III)盐和丙酮酸盐组成。在替代实施例中，选 定的成分中的一种为锂盐。在进一步的替代实施例中，选定的成分中的一种为无镁螯合缓冲 液。在进一步的替代实施例中，选定的成分中的一种为镁盐。在进一步的替代实施例中，选定 的成分中的一种为铁(III)盐。选定的成分中的一种为镁盐。在进一步的替代实施例中，选定的 成分中的一种为丙酮酸盐。
在进一步的一系列替代实施例中，选定的成分包含无镁螯合缓冲液、锂盐和至少一种选自 如下组的成分，这些组由镁盐、铁(III)盐和丙酮酸盐组成。
在进一步的一系列替代实施例中，选定的成分包含无镁螯合缓冲液、镁盐和至少一种选自 如下组的成分，这些组由锂盐、铁(III)盐和丙酮酸盐组成。
在进一步的一系列替代实施例中，选定的成分包含无镁螯合缓冲液、铁(III)盐和至少一种 选自如下组的成分，这些组由镁盐、锂盐和丙酮酸盐组成。
在进一步的一系列替代实施例中，选定的成分包含无镁螯合缓冲液、丙酮酸盐和至少一种 选自如下组的成分，这些组由镁盐、锂盐和铁(III)盐组成。
在进一步的一系列替代实施例中，选定的成分包含锂盐和无镁螯合缓冲液，或者锂盐和镁 盐，或者锂盐和铁(III)盐，或者锂盐和丙酮酸盐。在进一步的一系列的优选实施例中，选定的 成分包含丙酮酸盐和无镁螯合缓冲液，或者丙酮酸盐和镁盐，或者丙酮酸盐和锂盐，或者丙酮 酸盐和铁(III)氧化物盐。在进一步的一系列的优选实施例中，选定的成分包含铁(III)氧化物盐和 锂盐，或者铁(III)氧化物盐和丙酮酸盐，或者铁(III)氧化物盐和无镁螯合缓冲液，或者铁(III)氧 化物盐和镁盐。
在进一步的一系列实施例中，培养基进一步保护选择剂。在实施例中，选择剂包含萘啶 酸、盐酸吖啶黄和放线菌酮中的至少一种。在实施例中，铁(III)盐以约大于0.05g/L的浓度存 在；锂盐以约大于0.1g/L的浓度存在；镁盐以约大于0.1g/L的浓度存在；丙酮酸盐以约大于 0.1g/L的浓度存在。在实施例中，铁(III)以0.05g/L-50g/L之间的浓度存在；所述锂盐以在0.1 g/L-100g/L之间的浓度存在；所述镁盐以在0.1g/L-100g/L之间的浓度存在；所述丙酮酸盐以在 0.1g/L-100g/L之间的浓度存在。
基于实施例中一个实例的培养基的成分如表5所示。
表5：基于实施例中一个实例的培养基的成分
*按指示重配一瓶培养基，向1L培养基中加入2.7mL所述成分。
所述2.7ml选择性补充剂包含33.75mg放线菌酮，27mg萘啶酸和10125mg盐酸吖啶黄。
在110℃下对含有补充剂的培养基进行高压灭菌15分钟。
基于一个实施例的培养方法：
在该实施例中，公开了一种用于培养生物样品的方法，该方法包含在具有生物有效浓度的 非螯合镁离子和除氧剂存在的情况下培养样品。在实施例中，除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧化 氢、巯基乙酸盐、半胱氨酸、oxyraseTM、Na2S和FeS组成的组。
在所述实施例的变形中，公开了一种用于培养生物样品的方法，该方法包含：在培养基上 培养样品，所述培养基包含具有生物有效浓度的非螯合镁离子和具有生物有效浓度的选自如下 组的至少一种成分，所述组由锂盐、铁(III)盐和丙酮酸盐组成。在替代实施例中，培养在选自 如下组的至少两种、三种、四种、五种或六种成分存在的情况下进行，所述组由基本无镁螯合 缓冲液、镁盐、锂盐、铁(III)盐、丙酮酸盐和选择剂组成。在实施例中，所述方法包含在基于 第一个实施例中的培养基上培养细菌。在该实施例中，所述检测进一步包含PCR、凝集素结 合、简单扩散、侧向扩散、免疫检测、侧向层析或分步层析(flowthroughstep)。在实施例 中，培养在所述选择剂存在的情况下进行。在实施例中，所述细菌是或者包括李斯特菌，并且 在实施例中所述检测包含优先培养在实施例中是李斯特菌或者包括李斯特菌的菌种。在所述实 施例的变型中，所述方法包括使用基于所述实施例的培养基培养生物样品。在替代实施例中， 所述生物样品包含细菌，在实施例中，所述细菌是李斯特菌并且在实施例中所述方法包含优先 培养李斯特菌或其它细菌菌株。
基于实施例检测细菌的方法
在所述实施例中，公开了检测样品中细菌的方法，所述方法包含在具有生物有效浓度的非 螯合镁离子和除氧剂存在的情况下培养样品。在实施例中，所述除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧 化氢、巯基乙酸盐、半胱氨酸、oxyraseTM、Na2S和FeS组成的组。
在进一步的一系列实施例中，公开了检测样品中细菌的方法，所述方法包含在下述物质的 生物有效组合存在的情况下培养样品：非螯合镁离子以及至少一种选自如下基团的成分，所述 组由锂盐、铁(III)盐、丙酮酸盐和选择剂组成。在替代实施例中，培养在选自如下组的至少两 种、三种、四种、五种或六种成分存在的情况下进行，所述组由基本无镁螯合缓冲液、镁盐、 锂盐、铁(III)盐、丙酮酸盐和选择剂组成。在实施例中，所述方法包含在基于所述实施例的培 养基上培养细菌。在替代实施例中，所述检测进一步包含PCR、凝集素结合、简单扩散、侧向 扩散、免疫检测、侧向层析或分步层析。在替代实施例中，所述培养在选择剂存在的情况下进 行。在替代实施例中，所述细菌是李斯特菌并且在实施例中，所述检测包含优先培养可能是李 斯特菌的菌种。
在实施例中，根据实施例在培养基上将微生物在适宜的培养条件下培养适合的周期后，通 过一系列为本领域技术人员所熟知的方法中的一种对目标微生物的存在进行检测。这样的方法 包括但不限于PCR检测、实时PCR检测、凝集素结合、简单扩散、侧向扩散、免疫检测、侧 向层析或分步层析。免疫方法包括免疫沉淀、杂交、免疫放射分析、关联磁性配体的免疫沉淀 或利用其它合适的方法。
在特定的实施例中，测试之前对所述培养物的一部分进行加热或其它处理以杀灭微生物。 然后所述加热样品通过所需的一套方法鉴定其中是否存在目的标生物的抗原或核酸序列。
在实施例中，所述培养基与现有的FoodChekTM技术(也称MICT)结合使用。总的来说在 使用MICT方法的某个实施例中，富集培养物的一部分需要进行加热以杀灭目标分析物。加载 加热样品于侧向层析盒中，该侧向层析盒由包含连接于抗体的可结合病原体抗原的纳米级磁性 颗粒的样品/结合垫组成。该测试还包括固定在一个窄条上的二抗，该窄条带叫捕获区。毛细流 动将加载的液体从样品垫流动至结合垫，在结合垫上目标细菌与抗体包被的颗粒相结合。该免 疫复合物流入检测带进入捕获区。结果造成捕获区上的磁性颗粒累积。如果目标抗原不存在， 则不会形成免疫复合物，颗粒也不会在捕获区累积且检测结果呈阴性。进一步下行，对照线， 以相同的条带款式固定了不同的试剂，用于证明了测试是正确进行的且试剂都是有活性的。所 述层析盒在能够检测低浓度的磁性颗粒的仪器中被读取。检测器在沿着测试条带的磁场中能感 知细微的变化，因为它在一组传感线圈下通过。所述线圈在交替方向上缠绕以便通过结合于测 试或对照线的磁性颗粒产生有特征的信号谱。所述仪器将检测信号与编码在条形码中的正阈值 进行对比并报告结果是正还是负，每个层析盒上都贴有所述条形码。所述结果在仪器的液晶显 示屏上显示并打印，或传送至相关的电脑。除了所有的分析参数之外，所述条形码编码了测试 名称、批号和有效日期，这些随着测试结果被打印出来。本领域技术人员熟知具体应用和使用 这种检测方法。对比文献US7323139,US6927570,US6607922,US6597176,US6518747, US6483303,US6046585,US6275031,US6437563中的一篇或多篇中提到了用于测试或测定微生 物是否存在的MICT技术的实施例，这些文献中的公开内容在此以法律允许的引用的方式并入 本文中。
在实施例中，所述培养基能至少取代微生物分离鉴定标准程序中第一富集培养步骤，并且 在实施例中的这些是斯特菌。
根据实施例的补充剂
在进一步的一系列实施例中，公开了用于补充培养基的成分，所属补充剂包含具有生物有 效浓度的非螯合镁离子和除氧剂。在实施例中，除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧化氢、巯基乙酸 盐、半胱氨酸、oxyraseTM、Na2S和FeS组成的组。在所述实施例的变体中，所述成分包含无镁 螯合缓冲液和具有生物有效浓度的如下物质中的一种或多种的浓缩混合物，这些物质包括镁 盐、锂盐、铁(III)盐和丙酮酸盐。
在替代实施例中，所述成分包含具有生物有效浓度的选自如下组的至少两种、三种或四种、 五种成分，这些组由镁盐、锂盐、铁(III)盐和丙酮酸盐组成。
在实施例中，所述成分包含选择剂。在实施例中，所述成分用于培养李斯特菌。在实施例 中，所述成分被用于培养可能是李斯特菌的细菌。
根据实施例的试剂盒
在一系列进一步的实施例中，公开了用于培养细菌的试剂盒并且在实施例中这种细菌为李 斯特菌。在实施例中所述试剂盒包含基本无镁螯合缓冲液和除氧剂。在实施例中，所述除氧剂 选自由丙酮酸盐、过氧化氢、巯基乙酸盐、半胱氨酸、oxyraseTM、Na2S和FeS组成的组。
在实施例中，试剂盒包含选自如下组的一种、两种、三种或四种成分，这些组由锂盐、铁 (III)盐、丙酮酸盐、镁盐和无镁螯合缓冲液组成。在替代实施例中，所述试剂盒还包含选择 剂，并且在进一步的实施例中包含关于如何使用试剂盒培养细菌或如何优先培养细菌的说明。
在实施例中，基于实施例的所述培养基和方法能或者可能适于取代在分离鉴定细菌的普通工 序中的双重扩繁步骤，所述细菌为李斯特菌。在实施例中，为了检测细菌，所述培养基允许将 必要的扩繁时间缩减至约24h或更少并且在实施例中允许或可以允许所述扩繁时间少于约30, 29,28,27,26,25,24,23,22,21,20,19,18,17,16,15小时。在实施例中单轮的培养能获得大部分 现有技术能检测的足够的灵敏度，这些技术可以检测孵育了21、22、23或24小时后处于约 103-104cfu/ml水平之间的细菌。在实施例中甚至使用较弱的初始接种体也能获得这些结果。
具体示例
通过以下具体实施例的示例说明而不是限定本发明。
在一个示例中描述了培养液和它培养李斯特菌的用途。
表6：基于一个实施例的示例的李斯特培养基成分
*按表中所示重配一份，向1L培养基中加入2.7mL所述内容物。
添加补充剂的所述扩繁培养基在110℃高压下灭菌15分钟。
在一系列进一步示例中公开了培养基及其制备方法和使用。
试剂：Actero/李斯特菌扩繁培养基。－在单步扩繁中用于李斯特菌生长和恢复的专门优化培养 基。基于该示例的所述培养基有两种规格：粉末，一瓶500g和一打包含20个独立小包装，每个 4.9g。
其它用品和试剂：任何来源的蒸馏/去离子水灭菌水；Dey-Engley(D/E)中和培养基(LabMLimited,英国兰开夏郡)被用来检测杀菌剂和卫生效率；改良牛津琼脂(MOX；DifcoBectonDickinson,美国新泽西州)；Rapid’L.mono琼脂(RLM；Bio-Rad,Missisauga,加拿大安大略省)是用于检测、计数、分化李斯特菌，尤其是来自食品和环境样品的单核细胞增生李斯特菌的发色培养基；生化试验板李斯特菌系统(Biomérieux,Marcy-L’etoile,法国)；用D/E预浸湿的非杀菌的8×4×0.3cm无菌采样纤维素海绵；无菌过滤普通均质袋；可从多种渠道获得的有盖聚丙烯管；任何来源的一次性移液器；任何来源的塑料接种针和10μL接种测量杯。
仪器：用于将环境海绵样品充分混合于扩繁培养液中的StomacherSeward400Circulator匀浆机 (Seward，英国伦敦)；微量移液器和一次性无菌枪头；固定式培养箱SymphonyTM(VWR， 美国)或等同物，温度调至29℃±0.5℃。固定式培养箱model1555(VWR，美国)或等同物， 温度调至35℃±2℃。
培养基的一般制备：为了准备Actero/李斯特菌，将53.8g所述粉末悬浮于一升蒸馏水中。将混合 物加热至100℃并搅拌均匀直到粉末完全溶解(大约需要35分钟)。转入最终容器中110℃高压 灭菌15分钟。如果培养基在制备后马上使用则无需高压灭菌，这种情况下则建议使用灭菌水。
样品制备：为了准备环境海绵样品，100cm2医用海绵表面采用无菌的纤维素采样海绵在横向和 纵向上用和D/E培养液预浸湿各5次(从上至下或者从一侧到另一侧为1次)。将每一块采样海 绵放置在无菌的样品袋中并置于4℃±2℃待测。
分析：将90ml在29±0.5℃下预热的Actero/李斯特菌放入每一个含有独立采样海绵样品的样品 袋中，匀浆30秒并在29±0.5℃下扩繁24h。匀浆可用手动混合代替。如果是手动混合，需要揉 搓每块海绵约1分钟。在扩繁结束时，将样品直接放入MOX中和/或RLM琼脂平板上。用 MLG8.07(12)推荐的方法确认假定的李斯特菌菌落或者将它们送至独立实验室进行确认。
诠释和结果报告：如果在孵化48±2h后在MOX上和/或RPM琼脂平板上没有发现具有李斯特菌 的典型形态的可疑菌落，则认为样品为李斯特菌阴性。如果在孵化48±2h后在MOX上和/或RPM 琼脂平板上发现具有李斯特菌的典型形态的可疑菌落，则认为样品可能是阳性。可疑菌落必须 根据USDAFSIS微生物实验室指南第8.07章进行确认，法律允许的情况下，在此引入该章全部 内容。
本研究中使用的其它用品、试剂和仪器：马血覆盖琼脂平板(HBO或HL琼脂；QuélabInc.，加 拿大魁北克省)；乳酸菌M.R.S.培养液(MRS；QuélabInc.，加拿大魁北克省)；福蒙特大学 改良培养液(UVM；QuélabInc.，加拿大魁北克省)被用于选择性分离和扩繁单核细胞增生李 斯特菌；吗啉丙磺酸-李斯特菌缓冲扩繁培养液(MOPS-BLEB；OxoidLTD，加拿大安大略 省)；含有0.6％酵母提取物(TSA-YE；BactoTM酵母提取物；BDDiagnostics，美国新泽西 州)的胰酶大豆琼脂(TSA；QuélabInc.，加拿大魁北克省)；含有5％羊血的胰酶大豆琼脂平 板(血琼脂；BBLTMStackerTM，由BDDiagnostics提供，美国新泽西州)；含有0.6％酵母提取物 (TSA-YE；BactoTM酵母提取物；BDDiagnostics，美国新泽西州)的胰酶大豆培养液(TSB； QuélabInc.，加拿大魁北克省)；tomacherSewardCirculator3500匀浆机(Seward，英国伦 敦)。用于扩繁培养液中海绵环境样品的充分混合；涡旋混合器(VWR，美国)。
内部验证研究：在食品安全系统检测公司的子公司Maxivet公司的实验室进行了下列验证研究。
健壮性测试：为评估两种方法因素(孵育温度和时间)的干扰影响，进行了耐用性研究，这些 因素会影响Actero/李斯特菌的性能。耐用性变量和它们各自的范围如表1所示。
方法：利用纯培养评估每个测试范围条件。检测到了一种目标菌株，单核细胞增生李斯特菌 HPB5949和一种非目标菌株，粪肠球菌ATCC19433。
单核细胞增生李斯特菌HPB5949在血琼脂平板上进行划线培养并在35℃±1℃下孵育过夜。 目标菌株的一些菌落被转移至9mL的TSB-YE中在35℃下放置6–7h。该培养物以1:10的比例稀 释于新鲜TSB-YE并在相同温度下孵育过夜。然后将该培养物在ALEM培养液中稀释以达到分数 接种水平(每份样品小于1CFU)。
对于非目标菌株来说，使用相同的培养方法进行培养，只不过接种水平浓度比目标菌株高 10倍。
扩繁阶段结束后，将样品在MOX和RLM琼脂平板上划线以确认李斯特菌的生长。
结果：经POD分析，每种分析参数间并无明显差异，因为极端条件的dPOD值之间的置信区间 包含零(表7)。因此Actero培养基恢复单核细胞增生李斯特菌HPB5949的能力在测试时不 受温度和时间的影响。
在ALEM中未检测到非目标菌株粪肠球菌ATCC19433的存在(数据未显示)、
表7：ALEM法健壮性结果
aN–测试份数；
bx–阳性测试份数；
cPOD(A)–条件A下的阳性结果除以总测试数；
dPOD(B)–条件B下的阳性结果除以总测试数；
edPOD(AB)–条件A和条件B下POD值的差异；
f95％CI–95％置信区间(如果dPOD值的95％置信区间不包括零，那么差异水平处于5％具有统计学上的差异显著)。
包容性：为测试李斯特菌扩繁各种李斯特菌的能力，分析了代表李斯特菌属的6个品种的54份 菌株(表8)，并着重分析了人类病原菌单核细胞增生李斯特菌(33株属于8中最流行的血清 型菌株)。
方法：所有的李斯特菌在血琼脂平板上进行划线培养并在35℃下孵育过夜。将一些菌落转移至 10mLTSB-YE中在35℃下放置6-7小时。每一份培养物以1:10的比例稀释于新鲜TSB-YE中 并在相同温度下孵育过夜。然后将所述培养物在10mLALEM培养液中稀释并孵育使得每种菌 株约为5-20CFU。每一种菌株做3个重复，在29℃下孵育24h。扩繁阶段结束后，将这些样品 在MOX和RLM琼脂平板上进行划线培养以确认李斯特菌的生长。
结果：表7中总结了包容性研究的结果。所有54份测试的李斯特菌菌株都能在ALEM上29℃ 生长24h。
表8：李斯特菌菌株列表-包容性研究结果
aATCC:美国菌种保藏中心，马纳萨斯(VA)，美国。IRDA:农业环境发展研究所，魁北克省(QC)，加拿大.CRDA:食品研究发展中心，St- Hyacinthe(QC),加拿大。LEPAQ:魁北克动物病理专业实验室，魁北克(QC)，加拿大。ARS:美国农业科学研究院，华盛顿(DC)，美国。 MAPAQ:魁北克农业、渔业和食品部，魁北克省(QC)，加拿大。FMV:兽医学院诊断服务和细菌学实验室，St-Hyacinthe(QC)，加拿大。
+出现李斯特菌典型菌落。
+/-仅在培养基中接种体浓度高于50CFU/10mL时观察到MOX和/或RLM上出现李斯特菌典型菌落。
排斥性：分析了表9中列出的30种非李斯特菌菌株并确定了Actero/李斯特菌将目标微生物从 非目标微生物中鉴别出来的能力。挑选属于19个不同的细菌和酵母种属的所述菌株，因为它们 与李斯特菌十分相关或者因为它们在相同的环境中被发现。
方法：将每一份非李斯特菌菌株在血琼脂平板上划线并在35℃下孵育过夜，然后将它们置于表 9中所示的最佳条件下进行培养。将每一份悬浮培养液以比用在目标微生物中的浓度高10倍的 浓度稀释并接种于10mLALEM。这一步做3个重复。培养物在29℃下生长24h。扩繁阶段结 束后，将样品在MOX和RLM琼脂平板上进行划线培养以证明它们在ALEM上的生长能力。
结果：表9中总结了排斥性研究获得的结果。在测试条件的ALEM扩繁培养后，所测试的菌株 没有一个呈阳性结果。
表9：非李斯特菌菌株列表-排斥性研究结果
多对多测试：本研究的目的是为了确认多种培养基之间的操作是一致的。
方法：三个独立的测试被用于确认ALEM的操作再现性。使用一种目标菌株单核细胞增生 李斯特菌HPB5949和一种非目标菌株粪肠球菌ATCC19433来评估每个测试。
将所述目标菌株在血琼脂平板上划线并在35℃下孵育过夜。
将一些菌落转移至9mLTSB-YE中在35℃下放置6-7h。将细菌培养物以1:10的比例溶解 于新鲜TSB-YE中并在相同温度下孵育过夜。然后将所述培养物在10mLALEM培养液中稀释 以获得分数接种体(每份样品中约0.5CFU)。
对于那些非目标菌株来说，使用相同的方法对其进行培养，只不过接种水平浓度比目标菌 株高10倍，约5CFU。所述目标菌株进行10个重复而非目标菌株进行5个重复。培养物在 29℃下生长24h。扩繁阶段结束后，将样品在MOX和RLM琼脂平板上划线进行确认。
结果：用三批不同的Actero/李斯特菌进行了一个成功的性能测试。通过置信区间为95％的 POD分析证明了操作过程中的稳定性(见表10)。
表10：ALEM多对多测试结果
aN–测试份数；
bx–阳性测试份数；
cPOD(A)–lot1阳性结果除以总测试数；
dPOD(B)–lot2阳性结果除以总测试数；
ePOD(C)–lot3阳性结果除以总测试数；
fdPOD(CB)–POD极值间差异(lot3POD值和lot2POD值)；
g95％CI–95％置信区间(如果dPOD的95％置信区间不包括零，那么差异水平为5％为差异显著).
稳定性测试：通过一个6周的4℃黑暗处理的贮存期检测了制备的ALEM的稳定性。使用 目标和非目标细菌分别在贮存期0(新配制的)、2、4、6周时测试了ALEM的性能。
方法：使用一种目标菌株，单核细胞增生李斯特菌HPB5949和一种非目标菌，株粪肠球菌 ATCC19433在每个建议的贮存时间点评估Actero/李斯特菌。将所述目标菌株在血琼脂平板上 划线并于35℃下孵育过夜。将一些菌落转移至9mLTSB-YE中并于35℃下放置6-7h。将培 养物以1:10的比例稀释于新鲜TSB-YE中并在相同温度下孵育过夜。然后将目标细菌的培养物 稀释至10mLALEM培养液中以获得分数接种体(每份样品中约0.5CFU)。对于那些非目标 菌株来说，使用相同的方法对其进行培养，只不过接种水平浓度比目标菌株高10倍，约5 CFU。所述目标菌株进行10个重复而非目标菌株进行5个重复。培养物在29℃下生长24h。 扩繁阶段结束后，将样品在MOX和RLM琼脂平板上划线进行确认。
结果：稳定性研究结果如表11所示。制备的ALEM的两个极端的贮存时间点的dPOD值 的置信区间包括零，这确认了与新配制的培养基相比，贮存45天后培养基性能无显著变化。制 备的ALEM其它几个不同的贮存时间点也无显著差异(数据未示出)。这些数据表明制备的 ALEM可以在制备后的45天内贮存在4℃且无性能上的明显改变。
基质研究：进行基质研究用来评估ALEM培养液在扩繁的某个步骤中从不锈钢恢复李斯特 菌的能力。
用于这个研究的分离菌株为来自食品的野生型分离菌株，由加拿大卫生研究实验室提供。 将使用单核细胞增生李斯特菌HPB5949和innocua李斯特菌HPB118分别在不锈钢和塑料表面 进行测试。
使用不锈钢平板的研究在Maxivet公司进行，而其他使用塑料表面的研究与外部实验室共同 完成。(请见“独立验证研究”部分)。
表11：ALEM稳定测试结果
aN–测试份数；
bI–接种体水平：CFU/份；
cx–阳性测试份数；
dPOD(A)–新鲜制备的ALEM阳性结果除以总测试数；
ePOD(B)–贮存14天的ALEM阳性结果除以总测试数；
fPOD(C)–贮存30天的ALEM阳性结果除以总测试数；
gPOD(D)–贮存45天的ALEM阳性结果除以总测试数；
j95％CI–95％置信区间(如果dPOD的95％置信区间不包括零，那么差异水平为5％为差异显著)。
当前结果的dPOD(AD)为-0.1，代表处于两个极端的贮存时间点(0和45天)上的制备的ALEM的POD值之间的差异以及极端接种体水平 (0.2和0.7CFU/份)POD值之间的差异；
方法：接种体制备：将作为目标菌株的单核细胞增生李斯特菌HPB5949和作为竞争菌株的 粪肠球菌ATCC19433在血琼脂平板上划线并于35℃下孵育过夜。将一些菌落转移至10mL TSB-YE中并于35℃下放置6-7h。将培养物以1:10的比例稀释于新鲜TSB-YE中并在相同温度下 孵育过夜。孵育后将培养物贮存在4±2℃备用。
将目标菌株和非目标菌株的混合物(1:10的比例)作为不锈钢平板的接种体。混合物的制 备如下：将单核细胞增生李斯特菌HPB5949稀释至10％脱脂奶粉(NFDM)以获得分数阳性结 果。此外，将粪肠球菌培养物也稀释至10％的NFDM以获得比目标菌株高10倍的菌株。每种菌 株的细菌细胞浓度在混合之前通过plaiting确定。
环境样品制备：100cm2不锈钢平板从一个食品供应商处获得。在使用之前，所有平板被清 洗干净并高压灭菌。
将250μL混合培养物(按6.1.1部分描述的方法制备)逐滴散布于40个不锈钢平板的整个表 面并进行孵育。然后将250μL10％NFDM与其它10个不锈钢平板进行孵育作为阴性对照。
将这些平板置于封闭层流生物安全柜中与室温(22±2℃)下干燥18-20h。用无菌纤维素 取样海绵(NascoWhirl-PakSpeci-Sponge，Nasco，美国)擦拭每块平板，用中和D/E培养液对 这些海绵在横向和纵向上(从上至下或者从一侧到另一侧为1次)预浸湿各5次。将每块取样海 绵放置在灭菌样品袋中并于室温下放置至少2h。
将一半擦拭过孵育后的和未孵育的不锈钢平板的取样海绵样品使用下述的本发明的方法工 艺(ALEM工艺)进行分析。剩下的海绵样品则使用文献中的方法MLG8.07进行分析。
ALEM扩繁程序：将一组海绵样品(20个孵育过的和5个未孵育的)进行如下处理：将90 mLALEM在29±0.5C下预热后加入到样品袋中每个独立的海绵样品中。样品进行匀浆30秒并在 29±0.5℃下扩繁24h。扩繁结束后，用10μL接种测量杯将这些样品在MOX和RLM琼脂平板上 直接进行划线培养。通过MLG8.07中所推荐的使用API李斯特菌的快速生化检测确认推定的单 核细胞增生李斯特菌。
ALEM扩繁确认：根据ALEM工艺获得的结果通过按照USDA-FSIS参考工艺的双重扩繁的方 法来确认。即将0.1±0.02mLALEM扩繁的样品转移至10±0.5mLMOPS-BLEB中并于35±2.0℃下 孵育24h，然后将样品在MOX琼脂平板上进行划线并在35±2.0℃下孵育24-28h。
将MOX琼脂平板上的可疑菌落转移至HL琼脂平板上并在35±2.0℃下孵育18-26h。通过进 行MLG8.07中所推荐的使用API李斯特菌的快速生化检测以确认推定的阳性分离菌落。
对照方法扩繁和确认：将第二组所述海绵样品(20个孵育过的和5个未孵育的)在225±5 mLUVM培养液中进行匀浆处理2±0.2分钟，然后再在30±2.0℃下扩繁培养22±2h。然后将 0.1±0.02mLUVM扩繁样品转移至10±0.5mlMOPS-BLEB中并于35±2.0℃下孵育18～ 24±2h。
扩繁结束后，将样品直接在MOX琼脂平板上进行划线。通过进行MLG8.07中所推荐的使 用API李斯特菌的快速生化检测确认所有推定的阳性样品。
结果：ALEM基质研究结果示于表12中。20份样品中有15份按照本发明的方法工艺进行 孵育和处理过的样品被确认为阳性。相反的是，20份经参考方法工艺处理的样品中只有5个阳 性结果。在所有的测试样品中未发现假阴性结果。
表12：在不锈钢平板海绵样品中检测单核细胞增生李斯特菌的比较结果
aI–接种体水平，CFU/样品；
bN–测试样品数；
cx–阳性测试样品数；
dPOD(CP)–候选方法推定的阳性结果除以总测试数；
ePOD(CC)–候选方法确认的阳性结果除以总测试数；
fPOD(R)–参考方法确认的阳性结果除以总测试数；
gdPOD(C,R)–候选方法结果和参考方法结果POD值之间的差异；
hdPOD(CP,CC)–候选方法推定结果和候选方法确认结果POD值之间的差异；
独立验证研究：在AOAC的监督下与外部认证的测试实验室Agat实验室(加拿大魁北克圣 劳伦斯)合作完成了验证研究。
方法比对：进行方法比对研究来评估ALEM培养液从29℃下扩繁24h的塑料平板环境样品中 对李斯特菌的恢复能力。
方法：接种体制备：将innocua李斯特菌MAX-L-3作为目标菌株在血琼脂平板上进行划线并 于35℃下孵育过夜。将一些菌落转移至10mLTSB-YE中并于35℃下放置6-7h。将培养物以1:10 的比例稀释于新鲜TSB-YE中并在相同温度下孵育过夜。孵育后将培养物贮存在4±2℃备用。将 培养物稀释至10％脱脂奶粉(NFDM)中以较低的接种体水平与塑料环境表面接种以获得分数 阳性结果。接种后通过plaiting测定细菌细胞浓度。
样品制备：100cm2塑料平板从一个食品供应商处获得。在使用之前，所有平板被清洗干净 并高压灭菌。
将250μLinnocua李斯特菌MAX-L-3培养物(按1.1.1部分描述的方法制备)逐滴散布于40个 塑料平板的整个表面进行孵育。然后将250μL10％NFDM与其它10个塑料平板进行孵育作为阴 性对照。将这些平板置于封闭层流生物安全柜中于室温(22±2℃)下干燥18-20h。
环境海绵样品通过如下方式获得：用无菌纤维素取样海绵(NascoWhirl-PakSpeci- Sponge，Nasco，美国)擦拭每块平板，用中和D/E培养液对这些海绵在横向和纵向上(从上至 下或者从一侧到另一侧为1次)预浸湿各5次。将每块海绵放置在灭菌样品袋中并于室温下放置 至少2h。
将一半擦拭过孵育后的和未孵育的塑料平板的取样海绵样品使用下述的本发明的方法工艺 (ALEM工艺)进行分析。剩下的海绵样品则使用文献中的方法MLG8.07进行分析。
ALEM扩繁工序：将一组海绵样品(20个孵育过的和5个未孵育的)进行如下处理：将90 mLALEM在29±0.5C下预热后加入到样品袋中每个独立的海绵样品中。样品进行匀浆30秒并在 29±0.5℃下扩繁24h。扩繁结束后，将这些样品在MOX和RLM琼脂平板上直接进行划线培养。 通过MLG8.07中所推荐的使用API李斯特菌的快速生化检测确认推定的单核细胞增生李斯特 菌。
ALEM扩繁确认：根据ALEM工艺获得的结果通过USDA-FSIS参考工艺推荐的双重扩繁的方 法来确认。即将0.1±0.02mLALEM扩繁的样品转移至10±0.5mLMOPS-BLEB中并于35±2.0℃下 孵育24h，然后将样品在MOX琼脂平板上直接进行划线并在35±2.0℃下孵育24-28h。
将MOX琼脂平板上的可疑菌落转移至HL琼脂平板上并在35±2.0℃下孵育18-26h。通过进 行MLG8.07中所推荐的使用API李斯特菌的快速生化检测确认推定的阳性分离菌落。
对照方法的扩繁和确认：将第二组海绵样品(20个孵育过的和5个未孵育的)在225±5 mLUVM培养液中进行匀浆处理2±0.2分钟，然后再在30±2.0℃下扩繁培养22±2h。然后将 0.1±0.02mLUVM扩繁样品转移至10±0.5mlMOPS-BLEB中并于35±2.0℃下孵育18–24±2h。
扩繁结束后，将样品直接在MOX琼脂平板上进行划线。通过进行MLG8.07中所推荐的使 用API李斯特菌的快速生化检测确认所有推定的阳性样品。
结果：方法比较研究的结果示于表13中。基于POD和卡方未配对分析，本发明的方法工 艺和参考的方法工艺从食品接触塑料表面上恢复innocua李斯特菌的能力无明显差异。未发现 假阴性结果或假阳性结果。表14总结了Actero/李斯特菌方法的性能参数。
表13：在塑料平板环境海绵样品中检测innocua李斯特菌的对比结果
aI–接种体水平，CFU/样品；
bN–测试样品数；
cx–阳性测试样品数；
dPOD(CP)–候选方法推定的阳性结果除以总测试数；
ePOD(CC)–候选方法确认的阳性结果除以总测试数；
fPOD(R)–参考方法确认的阳性结果除以总测试数；
gdPOD(CP)–候选方法结果和参考方法结果POD值之间的差异；
hdPOD(CP)–候选方法推定结果和候选方法确认结果POD值之间的差异；
表14：Actero/李斯特菌方法的性能参数总结
aI–接种水平，CFU/份；
bN–测试样品数；
cχ2定义为科克-伦曼特尔-亨塞尔检验(χ2结果大于3.84表明在95％的置信区间两种方法存在显著差异)；
n/a–不适用.
本文提出的实施例和示例对本发明请求保护的主题的一般特点起到了说明性的作用而不是 限制。本领域技术人员了解如何在各种应用中且以各种方式但不脱离所公开的请求保护的主题 的精神和范围熟练地修订和/或改写这些实施例。本文的权利要求应被理解为包括但不限于所有 的替代实施例，并且与本主题等同。本文使用的惯用语、词语和术语是说明性而非限制性的。 凡是法律允许的，本文所引用的所有文献通过引用全部并入本文。可以理解的是，本文公开的 不同的实施例的任何方面都可以与一系列可能的替代实施例相结合，并且特征的替代组合，所 有这些特征的不同组合也能形成本发明请求保护的主题的一部分。具体的实施例可以可选地包 含或包括或排除任何一项所公开的一个或多个元素。