用于李斯特菌的培养基和培养方法以及检测李斯特菌的方法.pdf

1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201280034383.3 (22)申请日 2012.07.11 61/507,193 2011.07.13 US C12N 1/00(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (73)专利权人 食品安全测试系统公司 地址 加拿大亚伯达省卡尔加里市 (72)发明人 马汀内兹加布里耶拉 克拉沃戴维 马杜罗莱拉 (74)专利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人 吴泳历 (54) 发明名称 用于李斯特菌的培养基和培养方法以及检测 李斯特菌的方法 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 用 于 培 养

2、包 括 李 斯 特 菌 （Listeria spp.） 的微生物的方法的， 包含非螯合 镁离子和除氧剂的培养基。所述培养基可以用于 培养样品以检测样品中细菌的存在。本发明还公 开了包含用于补充培养基的无镁螯合缓冲液和除 氧剂的配方。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.01.13 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/CA2012/000669 2012.07.11 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/006960 EN 2013.01.17 (51)Int.Cl. 审查员 李有朝 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求

3、书2页 说明书29页 CN 103748211 B 2016.05.18 CN 103748211 B 1/2 页 2 1.用于选择性培养李斯特菌 (Listeria spp.) 的培养基， 包含 ： 1g/L-10g/L 的植物蛋白胨 ； 1g/L-10g/L 的胰蛋白胨 ； 1g/L-10g/L 的牛肉提取物 ； 1g/L-10g/L 的酵母提取物 ； 10g/L-45g/L 的 MOPS 缓冲液 ； 0.1g/L-0.5g/L 的柠檬酸铁 (III) ； 7g/L-9g/L 的氯化锂 ； 0.6g/L-5g/L 的 MgSO4； 1g/L-5g/L 的丙酮酸钠 ； 以及 10mg/L-5

4、0mg/L 的萘啶酸、 15-50mg/L 的放线菌酮和 6-15mg/L 的盐酸吖啶黄的生物有 效性组合。 2.根据权利要求 1 所述的培养基， 包含 ： 5g/L 的植物蛋白胨 ； 5g/L 的胰蛋白胨 ； 5g/L 的牛肉提取物 ； 5g/L 的酵母提取物 ； 7.2g/L-26g/L 的 MOPS 钠盐 ； 4.5g/L-16.2g/L 的 MOPS 游离酸 ； 0.5g/L 的柠檬酸铁 (III) ； 8g/L 的氯化锂 ； 2g/L 的 MgSO4； 1g/L 的丙酮酸钠 ； 以及 10mg/L-50mg/L 的萘啶酸、 15-50mg/L 的放线菌酮和 6-15mg/L 的盐酸吖

5、啶黄的生物有 效性组合。 3.根据权利要求 2 所述的培养基， 其中所述萘啶酸以 27mg/L 的浓度存在， 所述放线菌 酮以 34mg/L 的浓度存在， 盐酸吖啶黄以 10mg/L 的浓度存在。 4.根据权利要求2所述的培养基， 其中所述放线菌酮以33.75mg/L的浓度存在， 盐酸吖 啶黄以 10.125mg/L 的浓度存在。 5.用于在食品或环境样品中选择性培养李斯特菌 (Listeria spp.) 的方法， 所述方法 包括在权利要求 1 4 任一所述的培养基上培养所述食品或环境样品。 6.根据权利要求 5 所述的方法， 所述方法不包括二代培养步骤。 7.根据权利要求 5 所述的方法，

6、 其中所述培养在 29 -37进行。 8.根据权利要求 7 所述的方法， 其中所述培养在 28.5 -29.5的温度下进行。 9.根据权利要求 5 所述的方法， 其中所述培养持续 28 小时或少于 28 小时。 10.根据权利要求 5 所述的方法， 其中所述食品或环境样品是经冰冻的、 冷藏的、 磨碎 的、 切碎的、 罐装的、 热处理的、 干燥的、 保藏的或提炼的。 11.根据权利要求 5 所述的方法， 其中所述李斯特菌包括选自由单核细胞增生李 斯特菌 (Listeria monocytogenes)、 伊氏李斯特菌 (Listeria Ivanovii)、 威尔斯李斯 权 利 要 求 书 CN

7、 103748211 B 2 2/2 页 3 特菌 (Listeria welshimeri)、 西尔李斯特菌 (Listeria seeligeri)、 英诺克李斯特菌 (Listeria innocua) 和格氏李斯特菌 (Listeria grayi) 组成的组的菌株。 12.根据权利要求 5 所述的方法， 进一步包括， 在所述培养步骤之后， 在所述培养基中 检测李斯特菌的存在。 13.根据权利要求12所述的方法， 其中所述检测包括PCR、 凝集素结合、 简单扩散、 侧向 扩散、 免疫检测、 侧向层析、 或分步层析 (flow through step)。 14.用于检测李斯特菌的试剂盒

8、， 所述试剂盒包括(1)制作权利要求1所述的培养基的 成分以及 (2) 用所述培养基培养所述李斯特菌的操作说明。 15.根据权利要求 14 所述的试剂盒， 进一步包括用于检测李斯特菌的装置。 权 利 要 求 书 CN 103748211 B 3 1/29 页 4 用于李斯特菌的培养基和培养方法以及检测李斯特菌的方 法 背景技术 0001 1. 技术领域 0002 本发明公开的主题涉及用于培养微生物和检测微生物的培养基和方法。 0003 2. 相关文献 0004 美国专利申请No.10597909,用于李斯特菌(LISTERIA spp.)的选择性生长培养 基 , 申请日 2005 年 2 月

9、12， , 公开了包括氯化锂和选择试剂的成分。 0005 Mendonca,A.,F. 和 Knabel,S.,J.1994.A novel strictly anaerobic recovery and enrichment system incorporating lithium for detection of heat-injured Listeria monocytogenes in pasteurized milk containing background microflora. Appl.Environ.Microbiol.60:4001-4008. 0006 Beumer R

10、.R.,te Giffel M.C.,Anthonie S.V.R.,Cox L.J.1996.The effect of acriflavine and nalidixic acid on the growth of Listeria spp.in enrichment media.F.Microbiol.13(2):137-148. 0007 Teo,A.,Y-L.,Knabel,S.,J.2000.Development of a Simple Recovery-Enrichment System for Enhanced Detection of Heat-Injured Lister

11、ia monocytogenes in Pasteurized Milk.J.Food Prot.63(4):462-472. 0008 Busch SV,Donnelly CW.Development of a repair-enrichment broth for resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes and Listeria innocua.1992.Appl.Environ.Microbiol.58(1):14-20. 0009 Buchrieser C,Rocourt J.2007.The genus Listeri

12、a and Listeria monocytogenes:phylogenetic position,taxonomy,and identification. In:Listeria,listeriosis,and food safety,3rd edition./Ed.by Ryser ET,Marth EH.CRC Press.896p. 0010 Lang Halter E,Neuhaus K,Scherer S.2012.Listeria weihenstephanensis sp.nov.,isolated from the water plant Lemna trisulca of

13、 a German fresh water pond.Int J Syst Evol Microbiol.Apr 27.Epub ahead of print. 0011 Bertsch D,Rau J,Eugter MR,Haug MC,Lawson PA,Lacroix C,Meile L.2012. Listeria fleischmannii sp.nov.,isolated from cheese.Int J Syst Evol Microbiol. Apr 20.Epub ahead of print. 0012 Painter J,Slutsker L.Listeriosis i

14、n humans.2007.The genus Listeria and Listeria monocytogenes:phylogenetic position,taxonomy,and identification. In:Listeria,listeriosis,and food safety,3rd edition./Ed.by Ryser ET,Marth EH.CRC Press.896p. 0013 Wesley IV.Listeriosis in animals.2007.The genus Listeria and Listeria monocytogenes:phyloge

15、netic position,taxonomy,and identification. 说 明 书 CN 103748211 B 4 2/29 页 5 In:Listeria,listeriosis,and food safety,3rd edition./Ed.by Ryser ET,Marth EH.CRC Press.896p. 0014 Ramaswamy V,Cresence VM,Rejitha JS,Lekshmi MU,Dharsana KS,Prasad SP,Vijila HM.2007.Listeriareview of epidemiology and pathogen

16、esis.J Microbiol Immunol Infect.40(1):4-13. 0015 Koch J,Stark K.Significant increase of listeriosis in Germany-epidemiological patterns 2001-2005.(2006).Euro Surveill.11(6):85-8. 0016 Anonymous.Incidence of Foodborne Illness,2010.(http:/www.cdc.gov/ Features/dsFoodborneIllness/).2009 欧盟关于人畜共患疾病和人畜共患

17、疾病药剂和食 物传染疫情的趋势和来源的摘要报告 (http:/www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/ doc/2090.pdf). 0017 Scallan E,Hoekstra RM,Angulo FJ,Tauxe RV,Widdowson M-A,Roy SL,Jones JL,Griffin PM.Foodborne illness acquired in the United Statesmajor pathogens.2011.Emerg Infect Dis.17(1):1268. 0018 Gandhi M,Chikindas ML.2007.Lis

18、teria:A foodborne pathogen that knows how to survive.Int J Food Microbiol.113(1):1-15. 0019 USDA-FSIS.2011.Isolation and Identification of Listeria monocytogenes from red meat,poultry,egg,and environmental samples.In:Microbiology Laboratory Guidebook,Chapter 8.07.(http:/www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_8_0

19、7.pdf). 发明内容 0020 在一个实施例中公开的培养基中， 包含具有生物有效浓度的非螯合镁离子和除氧 剂。 0021 在另一些的实施例中， 所述除氧剂选自由丙酮酸盐、 过氧化氢、 巯基乙酸盐、 半胱 氨酸、 oxyraseTM、 Na2S 和 FeS 组成的组。 0022 在另一些实施例中， 所述培养基进一步包含具有生物有效浓度的锂盐 ； 或铁 (III) 盐 ； 或锂盐和铁 (III) 盐。 0023 在另一些实施例中， 所述培养基进一步包含选择剂。 0024 在另一些实施例中， 所述培养基进一步包含基本无镁的螯合缓冲液。 0025 在另一些实施例中， 所述培养基用于培养李斯特菌 (

20、Listeria spp.)。 0026 在另一些实施例中， 0027 所述铁 (III) 盐的浓度大于约 0.05g/L ； 0028 所述锂盐以大于约 0.1g/L 的浓度存在 ； 0029 所述镁盐以大于约 0.1g/L 的浓度存在 ； 并且所述除氧剂以大于约 0.1g/L 的浓度 存在。 0030 在一些实施例中， 所述培养基进一步包含选择剂。 0031 在一个具体实施例中公开了用于培养生物样品的方法， 所述方法包含 ： 在包含具 有生物有效浓度的非螯合镁离子和除氧剂的培养基上培养所述生物样品。 0032 在所述方法的一些实施例中， 所述培养基包含锂盐 ； 或铁 (III) 盐 ； 或

21、锂盐和铁 说 明 书 CN 103748211 B 5 3/29 页 6 (III) 盐。 0033 在所述方法的另一些实施例中， 所述培养基进一步包含选择剂。 0034 在所述方法的另一些实施例中， 0035 所述铁 (III) 盐以大于约 0.05g/L 的浓度存在 ； 0036 所述锂盐以大于约 0.1g/L 的浓度存在 ； 0037 所述镁盐以大于约 0.1g/L 的浓度存在 ； 并且 0038 所述除氧剂以大于 0.1g/L 的浓度存在。 0039 在一些具体实施例中， 所述方法用于培养李斯特菌 (Listeria spp.)。 0040 在一个实施例中公开了一种用于检测样品中的细菌

22、的方法， 所述方法包含培养所 述样品的步骤， 所述样品中存在具有生物有效浓度的 ： a) 非螯合镁离子， 和 b) 除氧剂。 0041 在所述方法的一个实施例中， 所述除氧剂选自由丙酮酸盐、 过氧化氢、 巯基乙酸 盐、 半胱氨酸、 oxyraseTM、 Na2S 和 FeS 组成的组。 0042 在所述方法的一个实施例中， 所述培养在下列物质存在的情况下进行 ： 0043 a) 锂盐 ； 或 0044 b) 铁 (III) 盐 ； 或 0045 c) 锂盐和铁 (III) 盐。 0046 在所述方法的一个实施例中， 所述培养在选择剂存在的情况下进行。 0047 在所述方法的一个实施例中， 所述

23、细菌是李斯特菌 (Listeria spp.)。 0048 在一个实施例中公开了一种用于补充培养基的配方， 所述配方包含无镁螯合缓冲 液和除氧剂。 0049 在另一些实施例中， 所述配方还包含具有生物有效浓度的 ： 0050 a) 锂盐 ； 或 0051 b) 铁 (III) 盐 ； 或 0052 c) 锂盐和铁 (III) 盐 0053 在另一些实施例中， 公开了用所述配方培养李斯特菌的用途。 0054 在一个具体实施例中， 公开了适于稀释的用于制作液体培养基的粉末状培养基， 所述培养基包含具有生物有效浓度的非螯合镁离子和除氧剂。 0055 在所述粉末培养基的另一些实施例中， 稀释过的培养基

24、进一步包含具有生物有效 浓度的 ： 0056 a) 锂盐 ； 或 0057 b) 铁 (III) 盐 ； 或 0058 c) 锂盐和铁 (III) 盐。 0059 在一个具体实施例中， 公开了用于培养李斯特菌的试剂盒， 所述试剂盒包括除氧 剂和无镁螯合缓冲液。 0060 此处所述主题的特征和益处将通过以下详细描述的优选实施例的详细描述而变 得更加明显， 如附图所示。 公开和请求保护的主题可在各方面进行修改， 只要不脱离权利要 求的范围， 都是可以实现的。因此， 附图和说明书实质上是用于解释性的， 而不是限制性的 且所述主题的全部范围记录在权利要求书中。 0061 优选实施例的详细说明 说 明

25、书 CN 103748211 B 6 4/29 页 7 0062 术语 0063 在本公开中，“包含” 一词被用在非限制性句子中表示紧接着该词的内容被包括 进来， 但是没有特别提及的内容不代表被排除了。能被理解的是在包含或可能包含特定特 征或变量或参数的具体实施例中， 一些实施例可能由或基本上由这些特征或变量或参数组 成。采用不定冠词 “一种” 限定的某种元素不排除多种该元素存在的可能， 除非上下文明确 限定一种和只有一种该元素。 0064 本公开中， 通过端点表示的数值范围包括此范围内所有的数， 包括所有完整的数， 所有整数， 所有的小数 ( 例如， 1 到 5 包括 1、 1.5、 2、

26、2.75、 3、 3.80、 4 和 5 等 )。 0065 本公开中， 单数形式 “一个” 和 “所述” 包括对复数的指代除非上下文内容明确限 定指代其它的。因此， 例如， 包含 “一种化合物” 配方的表述包括表示两种或以上化合物的 混合物。 0066 本公开中，“或者” 一词采用包括 “和 / 或” 的含义， 除非上下文另有明确规定。 0067 本公开中， 除非另有指明， 说明书和权利要求书中列出的用于表示数量或组成成 分、 特性测量值等的所有数值可在所有情况下理解为采用 “大约” 一词进行修饰后的意思。 因此， 除非根据上下文有相反的或必要的指示， 本公开中列出的数值参数为基于所需特性

27、的可变化的近似值， 本领域技术人员利用本公开的内容并根据测量和定量的不准确性可试 图获得所述特性。在不限制等同原则适用于权利要求的范围的情况下， 每个数值参数应至 少根据已报道的重要数值的数量以及利用普通的四舍五入方法进行分析。 尽管本公开宽范 围中列出的数值范围和参数为近似值， 它们在具体实施例中所列的数值仅广义地理解到一 定程度， 该程度与使本公开的有效性以及公开和请求保护的主题与现有技术的区别是一致 的。 0068 本公开中， 术语 “POD” 表示差异概率， 且术语 “dPOD” 表示差异概率方面的差异。 0069 本公开中，“灵敏度” 或 “灵敏度比率” 的定义为 ： 灵敏度比率 (

28、Actero/ 李斯特 菌法得到的阳性环境样品数 / 二代扩繁得到的阳性环境样品数 )100。 0070 本公开中，“特异性” 或 “特异性比率” 的定义为 ： 特异性比率 (Actero/ 李斯特 菌法得到的阴性环境样品数 / 二代扩繁得到的阴性环境样品数 )100。 0071 本公开中，“方法一致性” 的定义为 ： 方法一致性 1|(Actero/ 李斯特菌法得 到的真阳性和真阴性检测样品数参考方法得到的真阳性和真阴性检测样品数)/总样品 数 |100。 0072 本公开中，“精确性” 的定义为 ： 精确性 Actero/ 李斯特菌法得到的阳性检测样品 数 / 参考方法得到的阳性检测样品数

29、 100。 0073 本公开中，“培养基” 、“肉汤” 、“培养液” 等均涉及适于培养所需微生物 ( 可能是细 菌或微生物菌株或品种 ) 的营养混合物。在特定的实施例中， 培养基可能包含水、 琼脂、 蛋 白质、 氨基酸、 酪蛋白水解物、 盐、 脂类、 碳水化合物、 盐、 矿物质和 pH 缓冲液的一种或多种 以及可能含有提取物例如肉提取物、 酵母提取物、 胰蛋白胨、 植物蛋白胨、 蛋白胨和麦芽提 取物并可能包含 LB 培养基。在实施例中， 培养基可能是简单的、 复杂的或限定的培养基并 且可能是扩繁培养基并且可能以不同方式进行补充， 这些方式为本领域技术人员所熟知。 在实施例中， 培养基可能包含

30、MOPS 缓冲液、 铁 (III) 盐比如柠檬酸铁， 镁盐比如硫酸镁， 锂 盐比如氯化锂并且可能包含丙酮酸盐。在实施例中， 培养基可能包含或由本文所定义的任 说 明 书 CN 103748211 B 7 5/29 页 8 何核心培养基组成。 在实施例中， 培养基可能是简单的、 复杂的或限定的培养基并且可能是 扩繁培养基并且可能以不同方式进行补充， 这些方式为本领域技术人员所熟知。 “Actero/ 李斯特菌” 和 “ALEM” 肉汤、 培养基、 扩繁培养基等被用作基于实施例的培养基的一般用词。 0074 在实施例中， 培养基含有可能是无镁螯合缓冲液的 pH 缓冲液。在一个系列的实施 例中， 所

31、述 pH 缓冲液是 MOPS 钠盐和 MOPS 游离酸的混合物， 但是在替代实施例中一系列其 他缓冲液如碳酸盐和磷酸盐溶液也是可用的并且本领域技术人员能够轻易地选择使用并 获得所需的培养基 pH 值。 0075 在实施例中， 培养基可能以粉末或浓缩物的形式被提供， 通常也被称为 “粉末培养 基” 、“培养基粉末” 、“培养基浓缩物” 、“浓缩培养基” 等， 它包含多种成分并适于与定量的水 结合提供具有所需浓度的特定成分的液体培养基。 这样的粉末培养基或浓缩培养基可能是 完整的， 这意味着只需在使用前将它溶于适量的水 ( 一般是无菌水 )。作为选择， 在实施例 中另一种情况是， 粉末或浓缩培养基

32、可能是不完整的， 这意味着需要添加额外的成分来获 得适于使用的完整的培养基。在实施例中， 粉末或浓缩的培养基也包括浓缩的至少部分水 合的培养基， 它在溶解后形成用于培养细菌的培养基。除非文章另有要求， 本文所用的 “培 养基” 可以理解为不仅包括成分浓度适合培养细菌和微生物的最终培养基， 还包括适于稀 释的粉末或浓缩培养基。 0076 本公开中，“除氧剂” 表示能去除或失活游离氧或氧自由基的化学制品。在特定的 实施例中， 除氧剂选自由丙酮酸盐、 过氧化氢、 巯基乙酸盐或化合物、 L-(+)- 半胱氨酸盐酸 盐、 L- 半胱氨酸、 oxyraseTM酶 (Patel,1995)、 Na2S 和

33、FeS 组成的组。在特定的实施例中， 除 氧剂是左旋的 (L) 或右旋的 (D) 形式的并且可能是外消旋形式的或这几种的混合物。本领 域技术人员能熟练选择这些试剂并基于所讨论的实施例根据其生物兼容性对这些除氧剂 进行选择。 在实施例中， 当除氧剂或任何其他与本公开有关的试剂为盐时， 任何生物有效的 和兼容的盐都是可用的并且本领域技术人员能熟练的识别和避免使用不适合的盐。 在实施 例中， 盐为钠盐或钾盐。 0077 在本公开中，“丙酮酸盐” 表示和包括所有丙酮酸 ( 也叫 2- 氧代丙酸 ) 的所有盐 类和任何包含丙酮酸盐阴离子的化合物和任何它们的生物有效异构体或替代物。 在实施例 中， 丙酮酸

34、盐是丙酮酸钠或丙酮酸钾。本领域技术人员能熟练的识别和避免使用不具有生 物有效性或不适合的盐类， 比如有毒性的盐类。 0078 本领域技术人员可以轻而易举地意识到应当避免使用对目标细菌致命或有毒的 盐和其他化合物且本领域技术人员能够很容易地识别这种盐和化合物。 0079 在本公开中， 碱金属为锂、 钠、 钾、 铷、 钙和钫中的任何一种以及碱金属盐并且碱金 属盐为前述中任何一种碱金属的生物可接受的盐类。在实施例中， 盐是可溶解的并且可能 是有机或无机的， 并且根据实施例可能是氯化物、 磷酸盐、 硝酸盐、 磷酸氢盐、 丙酮酸盐、 醋 酸盐。 0080 本公开中， 动词 “缓冲” 指以本领域技术人员显

35、而易见的方式使溶液的 pH 稳定在 预定范围内， 所述溶液可能是培养基。名词 “缓冲” 表示适于稳定溶液 pH 的化学药品。 0081 本公开中，“盐” 指可溶的盐或在相应条件下基本或部分可溶的盐。 0082 本公开中， 关于 “生长” 或 “培养” 样品或微生物表示一个过程， 即将样品或微生物 放置在适宜或基本适宜维持或促进生长或分化一种或多种目标微生物的条件下的过程。 这 说 明 书 CN 103748211 B 8 6/29 页 9 些术语可以理解为包括一种情况， 其中样品被暴露于目的微生物是否真实存在或能被检测 到的相关条件下。 0083 本公开中，“盐” 指任何生物相容的盐， 它是可

36、溶的或基本可溶的或在适宜培养条 件下的溶解程度能达到所需生物有效性。 0084 本公开中，“无镁螯合缓冲液” 或 “基本无镁螯合缓冲液” 表示基本不含来自溶液的 螯合的或螯合溶解的镁离子的缓冲液或者镁离子含量未达到生物显著程度的缓冲液。 在特 定实施例中， 无镁螯合缓冲液是或包含 3-(N- 吗啉 ) 丙磺酸， 也指 3- 吗啉代丙烷 -1- 磺酸、 3-(N- 吗啉 ) 丙磺酸、 3-(N- 吗啉 )propansulfonic 酸、 4- 吗啉丙磺酸和 “MOPS” ， 或者无镁 螯合缓冲液是或包含 MOPS 钠盐和 MOPS 游离酸的混合物。在替代实施例中， 可以利用无镁 螯合缓冲液生物

37、可接受的范围， 且本领域技术人员容易识别和选择该范围。在某些实施例 中， 这种缓冲液可被替代或者是 MOPS 的化学修饰形式。类似地，“未螯合的” 或 “非螯合的” 表示离子或化学成分在溶液中为基本游离状态。 0085 本公开中，“基础” 或 “核心” 培养基或肉汤指包含某些为本领域技术人员所熟知 的基本需要的成分的部分培养液， 并且它的具体组成是可以变动的只要仍然适合于支持任 何目标微生物的生长。因此在实施例中， 核心培养基包含盐、 缓冲液和蛋白提取物， 并且在 实施例中， 核心培养基包含碳酸盐或磷酸盐或 MOPS 缓冲液或可能包含钠盐、 镁盐和钙盐。 在实施例中， 1 升核心培养基的配方如

38、表 1 所示。然而， 在替代实施例中， 核心培养基包含 水、 琼脂、 蛋白质、 氨基酸、 酪蛋白水解物、 盐类、 脂类、 碳水化合物、 盐、 矿物质和 pH 缓冲液 中的一种或多种， 并且在实施例中核心培养基包含提取物比如肉提取物、 酵母提取物、 胰蛋 白胨、 植物蛋白胨、 蛋白胨和麦芽提取物， 并且在实施例中， 培养基是或者包含 LB 培养基 ； 低盐 LB 培养基 (1蛋白胨， 0.5酵母提取物和 0.5 NaCl)， SOB 培养基 (2蛋白胨、 0.5酵母提取物、 10mM NaCl、 2.5mM KCl、 10mM MgCl2、 10mM MgSO4)， SOC 培养基 (2蛋白 胨

39、、 0.5酵母提取物、 10mM NaCl、 2.5mM KCl、 10mM MgCl2、 10mM MgSO4、 20mM Glucose)， 超级 肉汤 (3.2蛋白胨、 2酵母提取物和 0.5 NaCl)， 2xTY 培养基 (1.6蛋白胨、 1酵母提 取物和 0.5 NaCl)， TB 培养液 (1.2蛋白胨、 2.4酵母提取物、 72mM K2HPO4、 17mM KH2PO4 和 0.4甘油 )， LB 米勒培养液或 LB 伦诺克斯培养液 (1蛋白胨、 0.5酵母提取物和 1 NaCl)。 0086 表 1 ： 基础培养基的一般成分 0087 成分生产商规格 (g/L) 植物蛋白胨

40、BD BBL(211906)X-Y 胰蛋白胨Oxoid(LP0042)X-Y 牛肉提取物BD BBL(212303)X-Y 酵母提取物BD Bacto(212750)X-Y 0088 表 1 中， X 和 Y 是以克为单位的数值。每一组 X 和 Y 可以分别为 0.0,0.01,0.02,0 .03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.11,0.12,0.13,0.14,0.15,0.16,0.17,0.18 说 明 书 CN 103748211 B 9 7/29 页 10 ,0.19.0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,

41、1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9 ,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8, 3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5 .8,5.9,6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7. 7,7.8,7.9,8.0,8.1,8.2,8.3,8.4,

42、8.5,8.6,8.7,8.8,8.9,9.0,9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6 ,9.7,9.8,9.9,10.0,10.1,10.2,10.3,10.4,10.5,10.6,10.7,10.8,10.9,11.0,11.1,11.2 ,11.3,11.4,11.5,11.6,11.7,11.8,11.9,12.0,12.1,12.2,12.3,12.4,12.5,12.6,12.7,1 2.8,12.9,13.0,13.1,13.2,13.3,13.4,13.5,13.6,13.7,13.8,13.9,14.0,14.1,14.2,14. 3,14.4,14.5,14.6,1

43、4.7,14.8,14.9,15.0,15.1,15.2,15.3,15.4,15.5,15.6,15.7,15.8, 15.9,16.0,16.1,16.2,16.3,16.4,16.5,16.6,16.7,16.8,16.9,17.0,17.1,17.2,17.3,17 .4,17.5,17.6,17.7,17.8,17.9,18.0,18.1,18.2,18.3,18.4,18.5,18.6,18.7,18.8,18.9 ,19.0,19.1,19.2,19.3,19.4,19.5,19.6,19.7,19.8,19.9,20 克等， 并且在特定实施例中， X/Y 的范围由 X 和 Y

44、的值决定。可以理解的是， 在特定的实施例中， 本领域技术人员能熟练 选择植物蛋白胨、 胰蛋白胨、 牛肉提取物和酵母提取物的修饰形式作为上述物质的替代物。 在某些实施例中， 可以利用另一种镁盐、 钙盐和钠盐， 并且在特定实施例中可以选择镁盐、 钙盐和钠盐的替代物。 在某些实施例中， 核心培养基包括缓冲液并且在实施例中， 所述缓冲 液为 MOPS 缓冲液。本领域技术人员能熟练地对基本培养基成分进行调整以符合特定的目 的。可以理解的是， 在基础培养基上所作的与此处公开的扩繁有效性作用一致的任何变形 也都包括在该主题请求保护的范围内。 0089 表 2 ： 根据特定实施例的基础培养基配方 0090 成

45、分规格 (g/L) 植物蛋白胨5 胰蛋白胨5 牛肉提取物5 酵母提取物5 0091 本领域技术人员熟知选择适合于所讨论的微生物的温度最有利于所需微生物的 生长。 在特定的实施例中， 所需微生物是李斯特菌且在约29,30,31,32,33,34 ,35,36,37,38,39,40,41,42,43等温度下进行培养并且可以将使用的 肉汤预热至这一温度来准备受试样品的接种。 在特定的实施例中在约35下进行培养且可 以将使用的肉汤预热至这一温度来准备受试样品的接种。在本文公开的实施例中， 在 29 到43范围内的任何温度进行培养且可能在约29,30,31,32,33,34,35,3 6 ,37 ,3

46、8或 39或 40或 41或 42或 43或 29和 30之间， 30和 31之 间 ,31和 32之间 ,32和 33之间 ,33和 34之间 ,34和 35之间 ,35和 36 之间 ,36和 37之间 ,37和 38之间 ,38和 39之间 ,39和 40之间 ,40和 41之间 ,41和 42之间 , 或 42和 43之间， 或在 34和 43之间， 或 35和 42 说 明 书 CN 103748211 B 10 8/29 页 11 之间， 或 36和 42之间， 或 38和 42或 39和 41之间， 或 39和 40或 38和 39之间， 或 39和 40之间， 或 40和 41

47、之间， 或 41和 42之间， 或 42和 43之 间的某一个温度下进行培养。在实施例中， 温度在 32和 38之间或在 33和 37之间。 本公开中， 培养基的 “富集” 指添加选定的成分来促进一种或多种所需微生物的生长或其他 特性。 “富集溶液” 指包含这类添加成分的溶液。在实施例中， 富集溶液中包括的成分包括 MOPS、 铁 (III) 盐、 锂盐、 丙酮酸盐的一种或多种， 并且在实施例中， 选择性富集补充剂包含 选择剂如萘啶酸、 放线菌酮和盐酸吖啶黄。在特定的实施例中， 富集培养液含有硫酸镁、 氯 化锂、 柠檬酸铁、 丙酮酸钠和富集补充剂中的一种或多种。 0092 表 3 ： 一个实施

48、例中富集培养基的一般成分 0093 0094 每一组X和Y分别为0.0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1 ,0.11,0.12,0.13,0.14,0.15,0.16,0.17,0.18,0.19.0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9 ,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8, 2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3

49、,4.4,4.5,4.6,4.7,4 .8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6. 7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8.0,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6 ,8.7,8.8,8.9,9.0,9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,10.0,11,12,13,14,15,16,1 7,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29or 30 克或上述数值之间的任意值， 并且在特定 变体的实施例中， X 到 Y 的范围由 X 和 Y 的值确定。可以理解的是， 调整 MOPS 盐和 MOPS 游 离酸的相对量对于达到所需 pH 是必需的。 0095 每一组 A 和 B 分别为 0.0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0 .1,0.11,0.12,0.13,0.14,0.15,0.16,0.17,0.18