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1、(10)申请公布号 CN 102618566 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618566 A *CN102618566A* (21)申请号 201110036552.4 (22)申请日 2011.01.31 C12N 15/63(2006.01) C12N 1/13(2006.01) C12N 15/31(2006.01) (71)申请人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路 7 号 (72)发明人 崔玉琳 姜鹏 陈华新 李富超 秦松 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 许宗富 周秀梅 (54) 发明名称。
2、 一种构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法 (57) 摘要 本发明涉及生物基因工程技术领域， 具体的 说是一种构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方 法。利用 SEQ ID NO ： 1 所示的序列、 SEQ ID NO ： 2 所示的序列和带有选择标记的外源基因构建的 DNA 重组片段， 将其插入克隆载体并导入亚心型 扁藻细胞， 转化后经培养筛选获得转基因亚心型 扁藻。采用本发明的亚心型扁藻叶绿体稳定表达 系统， 可实现外源基因在亚心型扁藻叶绿体中的 稳定和高效表达， 并大量积累目的蛋白， 对其藻种 的品种改良以及基因工程产品开发都具有重要意 义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书。
3、 6 页 序列表 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法， 其特征在于 ： 利用 SEQ ID NO ： 1 所示 的序列、 SEQ ID NO ： 2 所示的序列和带有选择标记的外源基因构建的 DNA 重组片段， 将其插 入克隆载体并导入亚心型扁藻细胞， 转化后经培养筛选获得转基因亚心型扁藻。 2. 按权利要求 1 所述的构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法， 其特征在于 ： 所述利 用 SEQ ID NO ： 1 所示的序列。
4、采用由 SEQ ID NO ： 1 所示的序列 3 端开始， 向 5 端延伸至不 小于 1kb 的连续片段所代替。 3. 按权利要求 1 所述的构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法， 其特征在于 ： 所述利 用 SEQ ID NO ： 2 所示的序列采用由 SEQ ID NO ： 2 所示的序列 5 端开始， 向 3 端延伸至不 小于 1kb 的片段所代替。 4.按权利要求1或2或3所述的构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法， 其特征在于 ： 所述带有选择标记的外源基因为具有叶绿体启动功能的启动子、 终止子和选择标记基因的 DNA 片段。 5. 按权利要求 1 所述的构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的。
5、方法， 其特征在于 ： 所述选 择标记基因为草丁膦抗性基因 bar 基因。 6. 按权利要求 1 所述的构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法， 其特征在于 ： 转化后 的亚心型扁藻用除草剂草丁膦进行筛选。 权 利 要 求 书 CN 102618566 A 2 1/6 页 3 一种构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物基因工程技术领域， 具体的说是一种构建亚心型扁藻叶绿体表达 系统的方法。 背景技术 0002 在能进行光合作用的真核细胞中， 细胞核、 叶绿体和线粒体三种细胞器均含有 DNA 分子， 构成了既独立又相互联系的遗传体系。自 20 世纪 70 年代基因工程。
6、技术诞生以来， 向 细胞核导入外源基因的转化技术已经得到普遍应用。然而随着研究的深入发展， 人们逐渐 认识到核基因组中的基因工程操作有着如下难以克服的困难 ： 1. 细胞核基因组庞大， 背景 复杂 ； 2. 导入的外源基因随机插入到核基因组中 ； 3. 外源基因表达效率低， 且表达不稳定 ； 4. 有时外源基因的插入会引起其它性状的变异， 从而影响其经济价值 ； 5. 安全性不好， 外 源基因容易扩散等。这些问题严重制约着外源基因转化技术的改进及其在实践中的应用。 0003 1988 年， Boynton 等构建了莱茵衣藻的叶绿体稳定转化体系， 首次证明了叶绿体 转化的可行性。在此之后， 叶绿。
7、体转化技术在烟草等高等植物中得到了广泛应用。与核转 化相比， 叶绿体转化技术具有如下特点 ： 1. 外源基因可以定向插入 ； 2. 外源基因表达效率 高、 变异小 ； 3. 叶绿体基因组属于原核表达系统， 便于遗传操作 ； 4. 生物安全性高。 0004 叶绿体转化系统包括以下三个关键因素 ： 1) 同源片段 ： 叶绿体转化基于同源重组 的原理， 在叶绿体表达载体时， 外源基因两侧各具有一段叶绿体的同源片段， 长度约 1Kb 左 右， 较长的同源片段有利于同源重组的发生。2) 选择标记基因 ： 由于叶绿体自身的结构与 遗传特点， 选择标记的选择与使用与核转化明显不同， 也是影响叶绿体转化效率的。
8、关键因 素。3) 叶绿体基因表达调控序列 ： 外源基因需要能够在叶绿体中起作用的原核型启动子和 终止子， 来保障外源基因整合后在叶绿体中的稳定和高效表达。 0005 亚心型扁藻 (Platymonas subcordiformis)， 又名亚心型四爿藻 (Tetraselmis subcordiformis)， 是一种海洋单细胞绿藻， 在分类学上属于绿藻门 (Chlorophyta)， 青绿藻 纲 (Prasinophyceae)， 扁藻属 (Platymonas)。亚心型扁藻具有重要的应用价值， 是应用于 鱼、 对虾、 贝类等养殖中的重要饵料微藻， 其多糖含量非常高， 具有抗肿瘤活性， 还可。
9、作为油 脂代谢调控的贮藏物质来源。另外， 亚心型扁藻还可进行光合产氢， 在解偶联剂 CCCP 的诱 导下， 其产氢效率可达 503ml/l。 0006 尽管目前尚缺乏对亚心型扁藻叶绿体基因组序列的了解， 但参照高等植物以及其 它单细胞绿藻的相关研究， 可以有把握地推测， 亚心型扁藻叶绿体中编码许多与光合固碳、 油脂代谢等重要过程相关的基因， 因此， 在亚心型扁藻中构建叶绿体表达系统可以为其遗 传改造提供有力的工具， 工程藻株有望在构建高效微藻反应器 ( 生产高值蛋白、 油脂或氢 气 )、 开发口服型渔药等方面发挥独特优势。特别是， 亚心型扁藻细胞中只有一个巨大的杯 型叶绿体， 这一结构也有利于。
10、叶绿体遗传转化体系的建立， 其技术关键是发展叶绿体同源 整合平台， 以及可在叶绿体内进行筛选的相关机制， 最终实现外源基因在叶绿体基因组中 的整合与稳定表达。 但至目前为止， 亚心型扁藻遗传转化研究仅限于核基因组操作， 叶绿体 说 明 书 CN 102618566 A 3 2/6 页 4 基因组操作研究领域尚属完全空白。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法。 0008 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 0009 一种构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法 ： 0010 利用SEQ ID NO ： 1所示的序列、 SEQ ID NO ： 2所示的。
11、序列和带有选择标记的外源基 因构建的 DNA 重组片段， 将其插入克隆载体如 pMD-18T， pBluscript KS， pBluescript SK+， 并导入亚心型扁藻细胞， 转化后经培养筛选获得转基因亚心型扁藻。 0011 所述利用的SEQ ID NO ： 1所示的序列采用由SEQ ID NO ： 1所示的序列3 端起始， 向 5 端延伸至不小于 1kb 的连续片段所代替。 0012 所述利用的SEQ ID NO ： 2所示的序列采用由SEQ ID NO ： 2所示的序列5 端起始， 向 3 端延伸至不小于 1kb 的连续片段所代替。 0013 所述带有选择标记的外源基因为外源叶绿体。
12、启动功能的启动子、 终止子和选择标 记的 DNA 片段。其中外源叶绿体启动功能的启动子和终止子， 可以来源于模式衣藻的叶绿 体基因组， 或者来源于研究较清楚的高等植物叶绿体， 如拟南芥， 烟草， 或油菜等。 0014 所述选择标记基因为草丁膦抗性基因 bar 基因。 0015 所述筛选试剂为除草剂草丁膦。 0016 本发明方法成功构建了亚心型扁藻的叶绿体稳定表达系统。 通过本发明能够有效 的将外源基因重组到亚心型扁藻的叶绿体基因组中， 并通过筛选获得转基因藻株。与现有 技术相比， 本发明实现了亚心型扁藻基因工程技术的重点突破， 具有如下有益效果 ： 0017 1、 本发明提供用于亚心型扁藻叶绿。
13、体转化的叶绿体基因组序列。 0018 2、 本发明利用亚心型扁藻对除草剂草丁膦的敏感性， 采用一种可行的选择标记基 因 - 选择压力组合 (bar 基因 - 草丁膦 ) 用于叶绿体转化体系的构建， 依靠在叶绿体中表达 翻译的抗性蛋白帮助转化子在除草剂筛选压力下存活是本发明的又一技术特点。 0019 3、 本发明能将外源基因定点整合到亚心型扁藻的叶绿体基因组上， 并能实现外源 基因的稳定表达。 0020 4、 本发明能使外源基因在亚心型扁藻叶绿体中高效表达， 并能大量积累目的蛋 白。 0021 5、 本发明能在亚心型扁藻叶绿体中同时表达多个外源基因。 0022 6、 本发明利用叶绿体遗传表达的原。
14、核性质， 外源重组 DNA 可以是多顺反子， 操作 简便， 表达效率高。 附图说明 0023 图 1 为本发明实施例提供的含有本发明的同源重组片段的亚心型扁藻叶绿体基 因组 DNA 片段。其中 1-1608bp 下划线标注部分， 为 16S-trnI 区域的片段， 即 SEQ ID NO ： 1 ； 1629-3729bp 斜体标注部分， 为 trnA-23S 区域的片段， 即 SEQ ID NO ： 2。 0024 图 2 为本发明实施例提供的质粒 p64D 物理图谱。 0025 图 3 为本发明实施例提供的质粒 pSVbar 物理图谱。 说 明 书 CN 102618566 A 4 3/6。
15、 页 5 0026 图 4 为本发明实施例提供的质粒 pPSCB 物理图谱。 0027 图 5 为本发明实施例提供的 PCR 产物电泳图 ( 其中引物为 5 atpA for 和 3 rbcL rev， 泳道 1-11 为草丁膦抗性藻株 ； 泳道 12 为野生型藻株 ； 泳道 M 为分子标记 DL2000)。 0028 图 6 为本发明实施例提供的 PCR 产物电泳图 ( 其中引物为 con-16s for 和 con-23s-rev， 泳道 1 为空白对照 ； 泳道 2 为野生型藻株 ； 泳道 3 和 4 为阳性转基因藻株 ； 泳 道 5 为质粒 pPSCB ； 泳道 M 为分子标记 DL2。
16、000)。 0029 图 7 为本发明实施例提供的转基因亚心型扁藻 Southern 杂交图， ( 其中泳道 1 为 野生型藻株 ； 泳道 2 和 3 为阳性转基因藻株 ； 泳道 4 为质粒 pPSCB)。 具体实施方式 0030 本发明获得的亚心型扁藻叶绿体转化藻株， 是指利用基因枪法或珠磨法等其他直 接导入方法， 将含有本发明的亚心型扁藻叶绿体同源重组片段的载体导入亚心型扁藻叶绿 体中， 通过同源重组， 将带有外源基因的外源 DNA 片段定点插入到亚心型扁藻叶绿体基因 组中， 特别是 trnI 和 trnA 之间的间隔区。 0031 下面结合实施例对本发明的方法及该方法所达到的效果作进一步。
17、详细说明。 0032 实施例 ： 实现除草剂抗性基因在亚心型扁藻叶绿体中的稳定表达 0033 一、 亚心型扁藻两段叶绿体同源重组片段的扩增与克隆 0034 设计并合成如下两对引物 0035 P1 ： 5 -CGGGGTACCTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3 ( 下划线为 Kpn I 酶切位点 ) 0036 P2 ： 5 -GCGTCGACTTGAGGCAAATGGGCTATGC-3 ( 下划线为 Sal I 酶切位点 ) 0037 P3 ： 5 -TTGCGGCCGCACAACGGAGTTTCGGAATA-3 ( 下划线为 Not I 酶切位点 ) 0038 P4 ： 5 -CGAG。
18、CTCCGTTACTCAAACCGACATTC-3 ( 下划线为 Sac I 酶切位点 ) 0039 其中引物P1和P2的扩增产物是SEQ ID NO ： 1， 即片段16S-trnI ； 引物P3和P4的 扩增产物是 SEQ ID NO ： 2， 即片段 trnA-23S( 参见图 1)。 0040 以亚心型扁藻基因组总 DNA 为模板， 经引物 P1 和 P2 进行 PCR 扩增， 反应程序为 ： 9410min预变性 ； 941min， 5090sec， 7290sec， 共30个循环 ； 7210min延伸。 PCR 扩增产物约为1288bp， 即为片段16S-trnI， 将片段经琼脂。
19、糖凝胶电泳后， 经胶回收(天根公 司试剂盒 ) 纯化的 PCR 产物用 Kpn I 和 Sal I 酶切， 与经过同样酶切的 pBluescript SK 载 体 (Sigma 公司 ) 连接， 获得含有片段 16S-trnI 的重组质粒 pSK16I。 0041 以亚心型扁藻基因组总 DNA 为模板， 经引物 P3 和 P4 进行 PCR 扩增， 反应程序为 ： 94 10min 预变性 ； 94 1min， 50 100sec， 72 100sec， 共 30 个循环 ； 72 10min 延伸。 PCR 扩增产物约为 1405bp， 即为片段 trnA-23S， 将片段经琼脂糖凝胶电泳后。
20、， 经胶回收 ( 天 根公司试剂盒 ) 纯化的 PCR 产物用 Not I 和 Sac I 酶切， 与经过同样酶切的 pSK16I 连接， 获得含有片段 trnA-23S 和片段 16S-trnI 的重组质粒 pSK16I/A23。 0042 上述获得的重组质粒 pSK16I/A23 上， 两段插入序列 trnA-23S 和 16S-trnI 之间有 一段多克隆位点， 包括 Sal I、 EcoRV、 BamH I 和 Xba I 等， 可以继续插入外源 DNA 片段。 0043 二、 含有除草剂草丁膦抗性基因 (bar) 的亚心型扁藻叶绿体定点转化载体 pPSCB 的构建 0044 载体 p。
21、PSCB 的构建是以上述重组质粒 pSK16I/A23 为基础的。载体 pPSCB 的构建 说 明 书 CN 102618566 A 5 4/6 页 6 过程分为 3 步。首先， 设计并合成以下引物。 0045 5 atp A for ： 5 -GCGTCGACAAGCTTATCGATGACTTTATTAG-3 ( 下划线为 Sal I 酶切 位点 ) 0046 5 atp A rev ： 5 -CCGATATCGGACATTTTCACTTCTGGAGT-3 ( 下划线为 EcoRV 酶切位 点 ) 0047 Bar for ： 5 -CCGATATCATGAGCCCAGAACGACGCC-3。
22、 ( 下划线为 EcoRV 酶切位点 ) 0048 Bar rev ： 5 -CGGGATCCTCATCAAATCTCGGTGACGGG-3 ( 下划线为 BamH I 酶切位点 ) 0049 3 rbcL for ： 5 -CGGGATCCGTACTCAAGCTCGTAACGAAG-3 ( 下划线为 BamH I 酶切位 点 ) 0050 3 rbcL rev ： 5 -GCTCTAGAGGATCGCACTCTACCGATT-3 ( 下划线为 Xba I 酶切位点 ) 0051 其中， 引物 5 atpA for 和 5 atpA rev 的扩增产物是 5 atpA， 为来源于莱茵衣藻 叶绿。
23、体的具有叶绿体启动功能的启动子 ； 引物 3 rbcL for 和 3 rbcL rev 的扩增产物是 3 rbcL， 为来源于莱茵衣藻叶绿体的具有叶绿体启动功能的终止子 ； 引物 Bar for 和 Bar rev 的扩增产物是 bar 基因， 为草丁膦抗性基因。 0052 质粒 p64D 为模式藻种莱茵衣藻的叶绿体转化载体， 由中国农业科学院生物技术 所所得 ( 质粒图谱参见附图 2)。这个载体上有叶绿体启动功能的启动子 5 atpA 和终止子 3 rbcL。 质粒pSVbar(质粒图谱参见附图3)含有草丁膦抗性基因bar基因， 其构建过程为 ： 载体 pSV40LacZ 经 Sac II。
24、 酶切、 回收、 补平 ； 载体 pGEM/bar 经 Nco I 和 Ncot I 酶切、 回收 小片段 ( 带有 bar 基因 )、 补平 ； T4 连接酶连接上述大小片段， 其中载体 pSV4LacZ 和 pGEM/ bar 均购自 Clotech 公司。 0053 以质粒p64D为模板， 经引物5 atpA for和5 atpA rev进行PCR扩增， 扩增产物即 为莱茵衣藻叶绿体启动功能的启动子片段， PCR 反应程序为 ： 94 5min 预变性 ； 94 1min， 5040sec， 7250sec， 共30个循环 ； 7210min延伸， 产物为668bp。 琼脂糖凝胶电泳后，。
25、 经胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物用Sal I和EcoR V酶切， 与经过同样酶切的上 述 pSK16I/A23 连接， 获得含有莱茵衣藻叶绿体启动功能的启动子的重组质粒 pSK1623atp。 0054 以质粒 p64D 为模板经引物 3 rbcL for 和 3 rbcL rev 进行 PCR 扩增， 扩增产物 即为莱茵衣藻叶绿体启动功能的终止子 ； PCR 反应程序为 94 5min 预变性 ； 94 1min， 5030sec， 7240sec， 共30个循环 ； 7210min延伸， 产物为450bp。 琼脂糖凝胶电泳后， 经胶回收 ( 天根公司试剂盒 ) 纯化的 PCR 。
26、产物用 BamH I 和 Xba I 酶切， 与经过同样酶切的 上述 pSK1623atp 连接， 获得重组莱茵衣藻叶绿体启动功能的终止子的质粒 pSK1623-53。 0055 以质粒 pSVbar 为模板经引物 Bar for 和 Bar rev 进行 PCR 扩增， 扩增产物即 为草丁膦抗性基因 bar 基因， PCR 反应程序为 94 5min 预变性 ； 94 1min， 50 30sec， 7240sec， 共30个循环 ； 7210min延伸， 产物为560bp。 琼脂糖凝胶电泳后， 经胶回收(天 根公司试剂盒)纯化的PCR产物用EcoRV和BamH I酶切， 与经过同样酶切的p。
27、SK1623-53连 接， 获得含有草丁膦抗性基因 bar 基因的重组质粒 pPSCB( 质粒图谱见附图 4)。质粒 pPSCB 上， 在片段 3 rbcL 与 trnA-23S 之间有 Cla I 和 Not I 等多克隆位点， 用以插入外源基因。 0056 三、 基因枪转化法将质粒 pPSCB 导入亚心型扁藻 0057 在转化前 1h， 取浓度约为 5.0105cell ml-1的对数生长期的亚心型扁藻藻液， 离 心力 6000g 离心 5min， 弃上清， 用 f/2 培养液调整浓度到 1108cellml-1。然后取 0.2ml 藻 说 明 书 CN 102618566 A 6 5/6。
28、 页 7 液涂在 f/2 固体培养平板的中央， 呈直径约 3cm 的圆形。涂好的平板置于超净工作台中备 用。 0058 微粒子弹的制备 ： 取 50L 金粉悬浮液 ( 约含 3mg 金粉 ) 边涡旋边加入 5L 质粒 ( 质粒浓度 1g L-1)， 50L 2.5M CaCl2， 20L 0.1M 亚精胺。然后继续涡旋 3min。 离心 5-6sec， 弃上清。然后用 250L 无水乙醇洗两次， 最后用 60L 无水乙醇重悬。这样 一管包被了质粒的微粒子弹可用于 5-6 次轰击。 0059 在无菌条件下 ( 超净工作台中 )， 用高压氦气式基因枪进行轰击。 0060 轰击后， 藻细胞先在固体培。
29、养平板上黑暗条件下培养 8h， 然后再转到 f/2 培养液 中继续培养 40h， 使细胞生长状态得以恢复。 0061 四、 叶绿体转化藻株的获得 0062 经过恢复培养的亚心型扁藻细胞， 转到选择性培养液中， 以杀死未转化的藻细胞。 选择性培养液即为含有 15g ml-1草丁膦的 f/2 培养液。15d 后， 对照组细胞全部死亡， 实验组仍有活的藻细胞。将培养液以 6000g 离心 5min， 弃上清。收集到的藻体涂布到含有 15g ml-1草丁膦的 f/2 固体培养平板上， 使抗性的藻细胞分散生长， 得到抗性单藻落。约 培养 20d 后， 平板上长出单藻落。再将单藻落挑出， 并划线到含有 5。
30、g ml-1草丁膦的 f/2 固体培养平板上， 使抗性藻落进一步纯化并增强抗性。20d 后， 挑取单藻落至 f/2 培养液中 继续培养约 20d， 6000g 离心 5min， 收集藻体， 每个藻体湿重 100mg， 然后置于液氮中冷 冻备用。 0063 提取转基因亚心型扁藻的基因组总 DNA， 用以进行分子鉴定。首先用 PCR 方法来 鉴定质粒的整合情况。PCR 中使用的上游引物为 5 atpA for， 下游引物为 3 rbcL rev， 产 物为包括 5 atpA 和 3 rbcL 在内的 bar 基因表达盒。PCR 反应程序为 ： 94 10min 预变 性 ； 94 1min， 55。
31、 100sec， 72 110sec， 共 30 个循环 ； 72 10min 延伸。PCR 产物约为 1700bp( 参见图 5)。在一部分抗性亚心型扁藻基因组中扩增到了这个片段， 在未转化的亚 心型扁藻中均未发现该片段。 0064 然后在 SEQ ID NO ： 13 端附近和 SEQ ID NO ： 25 端附近分别设计并合成引物， 引 物序列如下 ： 0065 con-16s for ： ACAAGCAACGGGCTATTA ； 0066 con-23s rev ： TTTAGGCTGTTCCCATTT。 0067 这对引物 con-16s for 和 con-23s rev 在野生型。
32、亚心型扁藻基因组总 DNA 中扩 增到包括 trnI-trnA 的片段， 长度约为 500bp ； 在实现同质化的转基因亚心型扁藻基因组总 DNA 中， 扩增到 trnI-5 atpA-bar-3 rbcL-trnA 的片段， 长度约为 2000bp。 0068 以阳性转基因藻的全基因组 DNA 为模板， 以引物 con-16s for 和 con-23s-rev 进 行 PCR 扩增。PCR 反应程序为 ： 94 10min 预变性 ； 94 1min， 50 110sec， 72 120sec， 共 30 个循环 ； 72 10min 延伸。PCR 产物经电泳分离有两条带， 一条约为 20。
33、00bp， 另一条约为 500bp( 参见图 6)。较长的条带说明 bar 基因的通过同源重组插入到亚心型扁藻叶绿体基 因组中， 插入位点为片段 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 之间的间隔区位置。 0069 PCR 有阳性结果的转基因亚心型扁藻样品， 要继续进行 Southern 杂交鉴定。每个 样品的基因组总 DNA 至少 4g。Southern 杂交探针是来源于地高辛标记的质粒 pPSCB 上 bar 基因内部的一段序列。杂交结果显示， 一部分草丁膦抗性藻株的基因组， 杂交后出现了 说 明 书 CN 102618566 A 7 6/6 页 8 一条约 550bp。
34、 的条带， 与质粒酶切后的条带大小一致， 而未转化的藻株的基因组中没有这 个条带 ( 参见图 7)， 这表明在一些阳性藻株中， 质粒 pPSCB 已经整合到叶绿体基因组中。 0070 上述所得亚心型扁藻叶绿体表达系统可用于构建微藻反应器， 高效生产工业及医 药用重组蛋白， 例如酶、 药用蛋白及疫苗。由于亚心型扁藻是一种应用非常广泛的饵料藻， 也可以通过在叶绿体中高效表达抗菌药物或生长激素， 并经口服饲喂， 以实现新型渔药的 开发。另外， 还可应用本系统对叶绿体编码的内源基因进行定点修饰， 从而调控光合固碳、 以及油脂代谢的通路与终端产物， 获得表达新性状的工程藻株。 0071 上述实施例为本发。
35、明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102618566 A 8 1/3 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102618566 A 9 2/3 页 10 0003 序 列 表 CN 102618566 A 10 3/3 页 11 序 列 表 CN 102618566 A 11 1/5 页 12 说 明 书 附 图 CN 102618566 A 12 2/5 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 102618566 A 13 3/5 页 14 图 2 说 明 书 附 图 CN 102618566 A 14 4/5 页 15 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102618566 A 15 5/5 页 16 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102618566 A 16 。