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1、(10)授权公告号 CN 102796704 B (45)授权公告日 2014.06.25 CN 102796704 B (21)申请号 201210320799.3 (22)申请日 2012.08.31 C12N 5/09(2010.01) C12N 5/071(2010.01) C12N 5/02(2006.01) (73)专利权人 北京天辰空间生物医药研发有限 公司 地址 100900 北京市海淀区知春路 61 号院 科研楼 2 层 (72)发明人 党磊 张美姿 赵仁滨 (74)专利代理机构 北京华谊知识产权代理有限 公司 11207 代理人 刘月娥 CN 101434932 A,200。
2、9.05.20, 全文 . CN 101965394 A,2011.02.02, 全文 . CN 102154197 A,2011.08.17, 全文 . (54) 发明名称 一种温度控制细胞培养方法 (57) 摘要 一种温度控制细胞培养方法， 属于细胞生物 学技术领域。工艺步骤为 ： 微载体准备、 细胞接 种、 细胞培养的温度控制、 细胞增殖情况检测。优 点在于， 在一些特殊条件下， 如空间细胞搭载时， 在飞行器入轨前， 通过温度控制， 使细胞处于休眠 状态， 细胞不受外界环境影响， 飞行器入轨后再通 过温度控制激活细胞， 这样不仅能获得较多的活 细胞， 保证了有足够的实验材料进行后续实验，。
3、 同 时细胞只受空间环境的影响， 减少了在飞船入轨 前细胞受到的影响， 更能准确反应空间环境对细 胞的影响， 同时不需要航天员额外的操作， 较少了 航天员的工作量及工作难度。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 劳芳 权利要求书 2 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书3页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102796704 B CN 102796704 B 1/2 页 2 1. 一种温度控制细胞培养方法， 其特征在于， 工艺步骤如下 ： （1） 微载体准备 称取 100-500 毫克微载体于离心管中。
4、， 加入 10-40 毫升磷酸盐缓冲液 DPBS， 室温浸泡 1-4 小时后， 更换新的磷酸盐缓冲液 DPBS 进行清洗 2 次后， 去除磷酸盐缓冲液 DPBS， 放入高 压灭菌锅115-121灭菌15-30分钟 ； 取出后去除多余水分， 加入含体积百分数5-10胎牛 血清的完全培养基平衡 10-24h， 得到用于细胞生长的微载体 ； （2） 细胞接种 取处于对数生长期的肿瘤细胞或原代培养细胞， 细胞数量为 1-10106个， 用 0.05-0.25的胰蛋白酶消化后， 用细胞计数板计数细胞数量， 使用含 1-15胎牛血清的完 全培养基调整细胞数量为 0.5-2105个细胞 / 毫升， 加入步骤。
5、 （1） 得到的用于细胞生长的 微载体， 使其浓度为1-10毫克/毫升， 得到细胞与微载体的混合物 ； 将该混合物置于培养皿 内， 放入 37、 5 CO2的培养箱中， 1-5 小时内每 15-30 分钟摇晃一次培养皿， 使细胞与微 载体完全接触 ； 培养 4-16 小时后， 细胞已全部贴附于微载体上生长 ； （3） 细胞培养的温度控制 将步骤(2)得到的已生长于微载体上的细胞， 转入新的培养皿中， 加入含1或10胎 牛血清的完全培养基， 盖上盖子， 封口膜封口， 含 1胎牛血清的完全培养基的细胞放置于 20-25温度控制器内， 含 10胎牛血清的完全培养基的细胞放置于 37温度控制器内 ; 。
6、(4) 细胞增殖情况检测 生长于微载体上的细胞， 在 20-25及 37温度控制器内放置 24-240 小时后， 取出摇 匀， 取 100-1000 微升细胞悬液， 加入 1-15的 CCK-8， 25-37孵育 1-4 小时， 取上清液于酶 标板中， 使用酶标仪在 450-550 纳米波长下检测上清液的 OD 值， OD 值反应细胞的増殖 ； 此 时， 初始培养温度在 20-25条件下的细胞不増殖， 细胞处于休眠状态， 但仍有活性 ； 将含 1胎牛血清的培养基换成含 10胎牛血清的完全培养基， 将温度控制器升温至 37继续培养24-240小时， 一直在37温度控制器内培养的细胞， 继续在37。
7、温度控制器 内培养24-240小时 ； 取出摇匀， 取100-1000微升细胞悬液用上述CCK-8方法检测细胞增殖 情况， 此时， 初始培养温度在 20-25条件下的细胞已开始増殖， 且与一直放置于 37培养 的对照组细胞在细胞增殖情况及形态上没有显著差异。 2. 根据权利要求 1 所述的温度控制细胞培养方法， 其特征在于， 所述的微载体为球形， 直径在 60-87 微米。 3.根据权利要求1所述的温度控制细胞培养方法， 其特征在于， 所述的CCK-8是一种用 于测定细胞増殖或毒性实验中活细胞数目的高灵敏度的比色检测法， 其颜色变化与细胞数 量成正比。 4. 根据权利要求 1 所述的温度控制细。
8、胞培养方法， 其特征在于， 所述的微载体由纤维 素、 粘多糖、 胶原、 聚苯乙烯、 硅、 丙烯酰胺中的一种或几种制成。 5. 根据权利要求 1 所述的温度控制细胞培养方法， 其特征在于， 所述的磷酸盐缓冲液 DPBS 由 1-8 克 / 升的氯化钠、 0.1-0.2 克 / 升的氯化钾、 1-2 克 / 升的磷酸氢二钠、 0.1-0.2 克 / 升的磷酸二氢钾制成。 6. 根据权利要求 1 所述的温度控制细胞培养方法， 其特征在于， 所述的肿瘤细胞为小 鼠黑色素瘤细胞 B16 细胞、 肾上皮细胞 293 细胞、 人肺癌细胞 H1299。 权 利 要 求 书 CN 102796704 B 2 2。
9、/2 页 3 7. 根据权利要求 1 所述的温度控制细胞培养方法， 其特征在于， 所述的原代培养细胞 为人皮肤成纤维细胞 ESF 细胞、 小鼠胚胎成纤维细胞 3T3-L1 细胞。 权 利 要 求 书 CN 102796704 B 3 1/3 页 4 一种温度控制细胞培养方法 技术领域 0001 本发明属于细胞生物学技术领域， 特别是提供了一种温度控制细胞培养方法， 适 用于空间搭载细胞培养。 技术背景 0002 随着中国航天事业的发展， 空间生物学效益的研究越来越深入， 目前利用返回式 卫星和神舟飞船搭载植物种子和微生物已进行了大量研究， 但对于人和动物细胞， 由于培 养条件所限， 研究的较少。
10、， 特别是经过卫星和飞船搭载得到活细胞的研究更是鲜有报道。 0003 由于飞行器在发射和入轨前条件较为复杂， 会使细胞受到影响， 研究人员往往希 望在此阶段细胞处于休眠状态， 在飞行器入轨后再对细胞进行激活。目前国内也有一些细 胞搭载培养装置， 但都需要航天员人工操作， 需要航天员定时加入激活剂以保证在轨阶段 细胞的生长。 发明内容 0004 本发明的的目的在于提供一种温度控制细胞培养方法， 通过温度控制进行细胞培 养， 工艺步骤如下 ： 0005 1. 微载体准备 0006 称取 100-500 毫克微载体 （由纤维素、 粘多糖、 胶原、 聚苯乙烯、 硅、 丙烯酰胺中的 一种或几种制成） 于。
11、离心管中， 加入 10-40 毫升磷酸盐缓冲液 （DPBS， 由 1-8 克 / 升的氯化 钠、 0.1-0.2克/升的氯化钾、 1-2克/升的磷酸氢二钠、 0.1-0.2克/升的磷酸二氢钾制成） ， 室温浸泡 1-4 小时后， 更换新的磷酸盐缓冲液进行清洗 2 次后， 去除磷酸盐缓冲液， 放入高 压灭菌锅 115-121灭菌 15-30 分钟。取出后去除多余水分， 加入含体积百分数 5-10胎 牛血清的完全培养基平衡 10-24h， 得到可以用于细胞生长的微载体 ； 0007 2. 细胞接种 0008 取处于对数生长期的肿瘤细胞如小鼠黑色素瘤细胞 （B16 细胞） 、 肾上皮细胞 （293 。
12、细胞） 、 人肺癌细胞 （H1299） 等， 或原代培养细胞如人皮肤成纤维细胞 （ESF 细胞） 、 小鼠胚胎 成纤维细胞 （3T3-L1 细胞） ， 细胞数量为 1-10106个， 用 0.05-0.25 （体积百分数） 的胰蛋 白酶消化后， 用细胞计数板计数细胞数量， 使用含 1-15（体积百分数） 胎牛血清的完全培 养基调整细胞数量为0.5-2105个细胞 /毫升， 加入步骤1得到的可用于细胞生长的微载 体， 使其浓度为 1-10 毫克 / 毫升， 得到细胞与微载体的混合物。将该混合物置于培养皿内， 放入 37、 5 CO2的培养箱中， 1-5 小时内每 15-30 分钟摇晃一次培养皿，。
13、 使细胞与微载体 完全接触。培养 4-16 小时后， 细胞已全部贴附于微载体上生长 ； 0009 3. 细胞培养的温度控制 0010 将步骤2得到的已生长于微载体上的细胞， 转入新的培养皿中， 加入含1或10 （体积百分数） 胎牛血清的完全培养基， 盖上盖子， 封口膜封口， 分别放置于 20-25及 37 温度控制器内。 说 明 书 CN 102796704 B 4 2/3 页 5 0011 4. 细胞增殖情况检测 0012 生长于微载体上的细胞， 在 20-25及 37温度控制器内放置 24-240 小时后， 取 出摇匀， 取 100-1000 微升细胞悬液， 加入 1-15（体积百分数） 。
14、的 CCK-8， 25-37孵育 1-4 小时， 取上清液于酶标板中， 使用酶标仪在 450-550 纳米波长下检测上清液的 OD 值， OD 值 反应细胞的増殖。此时细胞不増殖， 细胞处于休眠状态， 但仍有活性。 0013 将含 1胎牛血清的培养基换成含 10胎牛血清的完全培养基， 将温度控制器升 温至 37继续培养 24-240 小时， 取 100-1000 微升细胞悬液用上述 CCK-8 方法检测细胞增 殖情况， 此时细胞已开始増殖， 且与一直放置于 37培养的对照组细胞没有显著差异。 0014 本发明所述的微载体为球形， 直径在 60-87 微米。 0015 本发明所述的所述的 CCK。
15、-8 是一种用于测定细胞増殖或毒性实验中活细胞数目 的高灵敏度的比色检测法， 其颜色变化与细胞数量成正比。 0016 本发明的优点在于， 在一些特殊条件下， 如空间细胞搭载时， 在飞行器入轨前， 通 过温度控制， 使细胞处于休眠状态， 细胞不受外界环境影响， 飞行器入轨后再通过温度控制 激活细胞， 这样不仅能获得较多的活细胞， 保证了有足够的实验材料进行后续实验， 同时细 胞只受空间环境的影响， 减少了在飞船入轨前细胞受到的影响， 更能准确反应空间环境对 细胞的影响， 同时不需要航天员额外的操作， 较少了航天员的工作量及工作难度。 附图说明 0017 图 1 为 B16 细胞使用温度控制方法培。
16、养细胞的増殖。 0018 图 2 为 ESF 细胞使用温度控制方法培养细胞的増殖。 0019 在 20-23培养 5 天后， B16 细胞和 ESF 细胞基本不增殖， 处于休眠状态， 但细胞仍 有活性。使用 1胎牛血清的培养基培养的 B16 细胞， 也无明显増殖， 但在升温至 37前需 换用含 10胎牛血清的完全培养基。在 37放置的细胞有明显増殖。当温度控制器升温 到 37后， 原来放于 20-23的细胞被激活， 开始增殖。 具体实施方式 0020 实施例 ： 0021 1. 微载体准备 0022 称取 500 毫克微载体于离心管中， 加入 40 毫升磷酸盐缓冲液， 室温浸泡 2 小时后， 。
17、更换新的磷酸盐缓冲液进行清洗2次后， 去除磷酸盐缓冲液， 放入高压灭菌锅120灭菌20 分钟。取出后去除多余水分， 加入含 10胎牛血清的完全培养基平衡 16h， 得到可以用于细 胞生长的微载体 ； 0023 2. 细胞接种 0024 取处于对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞 （B16细胞） 以及原代培养人皮肤成纤维细 胞 （ESF 细胞） ， 用 0.25的胰蛋白酶消化后， 用细胞计数板计数细胞数量， 使用含 10胎牛 血清的完全培养基调整细胞数量为 1105个细胞 / 毫升， 加入可用于细胞生长的微载体， 使其浓度为 5 毫克 / 毫升， 得到细胞与微载体的混合物。将该混合物置于培养皿内， 放入。
18、 37、 5 CO2的培养箱中， 3 小时内每 20 分钟摇晃一次培养皿， 使细胞与微载体充分接触。 培养 16 小时后， 细胞已全部贴附于微载体上生长 ； 说 明 书 CN 102796704 B 5 3/3 页 6 0025 3. 细胞培养的温度控制 0026 将已生长于微载体上的细胞， 转入新的培养皿中， 加入含 1或 10胎牛血清的 完全培养基， 盖上盖子， 封口膜封口， 分别放置于 20-23及 37温度控制器内。 0027 4. 细胞增殖情况检测 0028 生长于微载体上的细胞， 在20-23及37温度控制器内放置120小时后， 取出摇 匀， 取 180 微升细胞悬液， 加入 10。
19、的 CCK-8， 37孵育 1 小时， 取上清液于酶标板中， 使用 酶标仪在 450 纳米波长下检测上清液的 OD 值， OD 值反应细胞的増殖。此时细胞不増殖， 细 胞处于休眠状态， 但仍有活性。 0029 将含 1胎牛血清的完全培养基换成含 10胎牛血清的完全培养基， 将温度控制 器升温至 37继续培养 96 小时， 取 180 微升细胞悬液用上述 CCK-8 方法检测细胞增殖情 况， 此时细胞已开始増殖， 且与一直放置于 37培养的对照组细胞没有显著差异。 说 明 书 CN 102796704 B 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102796704 B 7 。