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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610209316.0 (22)申请日 2016.04.06 (71)申请人 常熟浸大科技有限公司 地址 215513 江苏省苏州市常熟经济技术 开发区生态园路8号 (72)发明人 杨智钧张友源吕爱平卞兆祥 (74)专利代理机构 常州佰业腾飞专利代理事务 所(普通合伙) 32231 代理人 滕诣迪 (51)Int.Cl. C07J 71/00(2006.01) (54)发明名称 一种脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离 方法 (57)摘要 本发明公开了一种脂蟾毒配基和华蟾酥毒 。
2、基单体的分离方法， 属于药品技术领域。 其制备 方法为： 中药蟾酥粉碎， 乙醇加热提取， 提取液减 压干燥， 得提取物， 提取物水中分散， 加入乙酸乙 酯萃取， 收集上部萃取液， 减压干燥得萃取物， 运 用硅胶柱色谱技术， 可以获得脂蟾毒配基和华蟾 酥毒基高纯度混合物， 也可以获得两者单体， 单 体纯度均大于98。 本发明可以同时分离提取脂 蟾毒配基和华蟾酥毒基单体， 可以提高治疗的精 确性， 对不良反应的成分源及时定位， 本方法生 成的单体纯度高， 无有机溶剂残留， 操作简便， 能 耗低， 产品质量易于控制， 适合工业化生产。 权利要求书1页 说明书4页 CN 105859824 A 201。
3、6.08.17 CN 105859824 A 1.一种脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法， 其特征在于按照如下步骤进行： (1)取蟾酥样品粉碎后， 用乙醇加热回流提取， 过滤液减压回收乙醇， 得粗提物； (2)将所述的步骤(1)中粗提物在水中分散， 成悬浊液， 加入的乙酸乙酯， 静置萃取， 收 集上部萃取液， 减压回收溶剂， 得萃取物； (3)连续运用硅胶柱色谱技术对萃取物进行分离， 流动相包含： 石油醚、 乙酸乙酯、 二氯 甲烷、 甲醇和乙酸乙酯比例混合溶剂， 分别得到脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体； (4)除去单体中痕量有机溶剂残留。 2.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离。
4、方法， 其特征在于： 所述 的步骤(3)中， 连续两次使用硅胶柱色谱技术， 在第一次使用， 获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒 基的高纯度混合品， 第二次时获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的单体。 3.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法， 其特征在于： 所述 的步骤(1)中， 乙醇浓度80-95， 体积70-80ml/g。 4.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法， 其特征在于： 所述 的步骤(1)中， 加热温度80， 提取时间1.5-2小时， 提取次数3-4次。 5.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法， 其特征在于： 所述 的步骤(2)中， 乙。
5、酸乙酯与水体积比3:1-1:1。 6.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法， 其特征在于： 所述 的步骤(2)中， 静置30分钟， 萃取次数4-5次。 7.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法， 其特征在于： 所述 的步骤(2)可以获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒基高纯度的混合物。 8.根据权利要求1或2所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法， 其特征在于： 所述的步骤(3)中， 色谱柱硅胶为200-300目。 9.根据权利要求1或2所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法， 其特征在于： 所述的步骤(3)中， 流动相包括： 石油醚、 二氯甲烷、 乙酸乙酯。
6、、 丙酮、 乙醇和甲醇各比例的混 合溶剂。 10.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法， 其特征在于： 所 述的步骤(4)中， 除去有机溶剂的仪器可以是冷冻干燥器和真空干燥器。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105859824 A 2 一种脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法 技术领域 0001 本发明涉及一种华蟾酥毒基和脂蟾毒配基单体的分离方法， 属于药品技术领域。 背景技术 0002 蟾酥(Venenumbufonis)是蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufobufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(B.melanostictusSchneider)的耳后腺。
7、及皮肤腺分泌的白色浆液干 燥而成， 最早记录于 本草衍义 ，“有消积杀虫、 温暖通行之功， 能发散一切风火抑郁、 大热 痈肿之候， 为拔疔散毒之神药” 。 现代中医配方中多用此药， 具有解毒、 消肿、 强心和止痛之 效， 现代药理实验证明， 其活性成分具有抗肿瘤、 促进癌细胞凋零和防止癌细胞转移等作 用， 因此被广泛地应用于心脑血管疾病和癌症治疗当中。 0003 蟾酥中的药用成分主要是华蟾酥毒基和脂蟾毒配基，中国药典 也将两种化合物 的总含量列为蟾酥质量标准之一。 两种化合物同属于蟾毒配基类成分， 结构相似， 无法通过 简单的分离手法将两者分开， 所以目前蟾酥多采用两种成分混合， 以粗提物的形。
8、式入药， 包 含杂质较多， 药理作用不稳定， 无法广泛应用于注射等西药治疗手段， 且一旦发生不良反 应， 无法及时定位成分源， 造成病情延误， 阻碍了蟾酥这一传统中药在临床上的进一步应 用。 本发明运用色谱柱分析法将华蟾酥毒基和脂蟾毒配基分开， 分别得到两种单体， 流程精 简， 可重复性和可操作性极高， 可广泛应用于工厂化生产。 0004 现有专利CN103191132A公开了一种从蟾酥中提取脂蟾毒配基的方法， 该方法中仅 用乙醇对样品进行处理， 无法将两种单体华蟾酥毒基和脂蟾毒配基单体同时分离获取。 发明内容 0005 1、 本发明的目的。 0006 本发明为了提高治疗的精确性， 对不良反应。
9、的成分源及时定位， 而提出了一种华 蟾酥毒基和脂蟾毒配基单体的分离方法。 0007 2、 本发明所采用的技术方案。 0008 本发明是提供一种操作简单， 保留原有有效成份， 不含有机溶剂的华蟾酥毒基和 脂蟾毒配基的制备方法。 其具体步骤如下： (1)取蟾酥样品粉碎后， 乙醇加热回流提取， 过滤液减压回收乙醇， 得粗提物； (2)将(1)中粗提物在水中分散， 形成悬浊液， 加入乙酸乙酯， 静置萃取， 收集上部萃取 液， 减压回收溶剂， 得萃取物； (3)连续运用硅胶柱色谱技术对萃取物进行分离， 流动相包括石油醚、 二氯甲烷、 乙酸 乙酯、 丙酮和甲醇各比例混合溶剂， 通过TLC薄层层析检测， 得。
10、到华蟾酥毒基和脂蟾毒配基 单体。 0009 (4)用冷冻干燥器或者真空干燥器除去有机溶剂残留。 0010 更进一步的具体实施例中， 所述的步骤(3)， 连续两次使用硅胶柱色谱技术， 在第 说明书 1/4 页 3 CN 105859824 A 3 一次使用， 获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的高纯度混合品， 第二次时获得脂蟾毒配基和华 蟾酥毒基的单体。 0011 更进一步的具体实施例中， 所述的步骤(1)， 乙醇浓度80-95%， 体积70-80ml/g。 0012 更进一步的具体实施例中， 所述的步骤(1)， 加热温度80， 提取时间1.5-2小时， 提取次数3-4次。 0013 更进一步的具体实施。
11、例中， 所述的步骤(2)中， 乙酸乙酯与水体积比3:1-1:1。 0014 更进一步的具体实施例中， 所述的步骤(2)中， 静置30分钟， 萃取次数4-5次。 0015 更进一步的具体实施例中， 所述的步骤(2)可以获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒基高 纯度的混合物。 0016 更进一步的具体实施例中， 所述的步骤(3)中， 色谱柱硅胶为200-300目。 0017 更进一步的具体实施例中， 所述的步骤(3)中， 流动相包括： 石油醚、 二氯甲烷、 乙 酸乙酯、 丙酮、 乙醇和甲醇各比例的混合溶剂。 0018 更进一步的具体实施例中， 所述的步骤(4)中， 除去有机溶剂的仪器可以是冷冻干 燥器和真空干。
12、燥器。 0019 3、 本发明的有益效果。 0020 （1） 本发明在乙醇处理除去蟾酥中部分大分子蛋白之后， 用乙酸乙酯对样品进行 再处理， 进一步除去大极性杂质， 富集目标化合物， 同时用色谱柱进行预分离， 除去色素， 因 此得到的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的混合品浓度较高， 且可以同时得到两种单体成分， 减 少了样品损耗， 精简了分离工艺， 提高了单体得率， 其纯度均在98%以上。 0021 （2） 脂蟾毒配基和华蟾酥毒基两种化合物同属于蟾毒配基类成分， 结构相似， 传统 两相系统分离度差， 得率低， 本发明采用三相系统 （石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯,石油醚-二 氯甲烷-甲醇） ， 通过TLC。
13、检测， 分离度高， 减少分离过程中样品吸附。 0022 （3） 本发明中蟾酥样品， 采用 中国药典 2005版蟾酥质量检测目录下所述流程， 运 用HPLC进行检测， 脂蟾毒配基含量为27%， 华蟾酥毒基含量37%， 符合国家要求。 在本发明所 述流程结果中， 脂蟾毒配基单体获得量22-26mg/g， 华蟾酥毒基单体获得量31-35mg/g， 得率 均在80%以上。 0023 （4） 本发明得到脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体， 满足载药量小的剂型的制剂要求， 防止在临床应用中， 多种成分之间相互拮抗， 从而降低药效， 也为两种化合物进一步生物活 性测试， 发掘更多更优秀的药理作用奠定基础。 进行整个。
14、实验流程操作简单， 重复性高， 质 量易于控制， 打破了传统意义上的蟾酥混合物入药的局限性， 同时也可大规模运用于工厂 生产。 0024 （5） 传统除去样品溶剂的方法主要是采用旋转蒸发仪， 虽会除去大部分溶剂， 但仍 然会有残留， 这会影响后续生物活性测试以及临床应用， 所以本发明在利用旋转蒸发仪除 去大部分溶剂之后， 采用冷冻干燥器和真空干燥器对样品中的有机溶剂进行处理， 消除残 留。 具体实施方式 0025 实施例1 取蟾稣样品1g， 加入70倍80%乙醇， 80加热回流提取3次， 每次90分钟， 过滤液减压浓 说明书 2/4 页 4 CN 105859824 A 4 缩， 得乙醇提取物。
15、； 乙醇提取物在水中分散， 加入1倍乙酸乙酯进行萃取， 静置30分钟， 萃取3 次， 取上部萃取液， 减压浓缩， 得乙酸乙酯萃取物； 60倍200-300目柱色谱硅胶， 流动相二氯 甲烷-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 （5:1:1） 梯度冲洗， 得脂蟾毒配基25mg， 华 蟾酥毒基32mg。 0026 实施例2 取蟾稣样品1g， 加入70倍90%乙醇， 80加热回流提取4次， 每次90分钟， 过滤液减压浓 缩， 得乙醇提取物； 乙醇提取物在水中分散， 加入2倍乙酸乙酯进行萃取， 静置30分钟， 萃取4 次， 取上部萃取液， 减压浓缩， 得乙酸乙酯萃取物； 60倍200-300目柱色谱。
16、硅胶， 流动相石油 醚-丙酮以及石油醚-二氯甲烷-甲醇 （5:2:1） 冲洗， 得脂蟾毒配基24mg， 华蟾酥毒基31mg。 0027 实施例3 取蟾稣样品1g， 加入70倍95%乙醇， 80加热回流提取3次， 每次100分钟， 过滤液减压浓 缩， 得乙醇提取物； 乙醇提取物在水中分散， 加入3倍乙酸乙酯进行萃取， 静置30分钟， 萃取3 次， 取上部萃取液， 减压浓缩， 得乙酸乙酯萃取物； 60倍200-300目柱色谱硅胶， 流动相石油 醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-甲醇 （6:3:1） 冲洗， 得脂蟾毒配基26mg， 华蟾酥毒基 33mg。 0028 实施例4 取蟾稣样品1g， 加入7。
17、5倍80%乙醇， 80加热回流提取4次， 每次120分钟， 过滤液减压浓 缩， 得乙醇提取物； 乙醇提取物在水中分散， 加入3倍乙酸乙酯进行萃取， 静置30分钟， 萃取4 次， 取上部萃取液， 减压浓缩， 得乙酸乙酯萃取物； 60倍200-300目柱色谱硅胶， 流动相二氯 甲烷-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 （3:1:1） 冲洗， 得脂蟾毒配基23mg， 华蟾酥 毒基34mg。 0029 实施例5 取蟾稣样品1g， 加入75倍95%乙醇， 80加热回流提取4次， 每次120分钟， 过滤液减压浓 缩， 得乙醇提取物； 乙醇提取物在水中分散， 加入1倍乙酸乙酯进行萃取， 静置30分钟， 。
18、萃取4 次， 取上部萃取液， 减压浓缩， 得乙酸乙酯萃取物； 60倍200-300目柱色谱硅胶， 流动相石油 醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(4:1:1)冲洗， 得脂蟾毒配基25mg， 华蟾酥毒 基35mg。 0030 实施例6 取蟾稣样品1g， 加入75倍90%乙醇， 80加热回流提取3次， 每次90分钟， 过滤液减压浓 缩， 得乙醇提取物； 乙醇提取物在水中分散， 加入1倍乙酸乙酯进行萃取， 静置30分钟， 萃取3 次， 取上部萃取液， 减压浓缩， 得乙酸乙酯萃取物； 60倍200-300目柱色谱硅胶， 流动相石油 醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(5:1:1)冲洗，。
19、 得脂蟾毒配基23mg， 华蟾酥毒 基34mg。 0031 实施例7 取蟾稣样品1g， 加入80倍80%乙醇， 80加热回流提取3次， 每次100分钟， 过滤液减压浓 缩， 得乙醇提取物； 乙醇提取物在水中分散， 加入2倍乙酸乙酯进行萃取， 静置30分钟， 萃取4 次， 取上部萃取液， 减压浓缩， 得乙酸乙酯萃取物； 60倍200-300目柱色谱硅胶， 流动相石油 醚-丙酮以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(6:3:2)梯度冲洗， 得脂蟾毒配基25mg， 华蟾酥毒 基33mg。 说明书 3/4 页 5 CN 105859824 A 5 0032 实施例8 取蟾稣样品1g， 加入80倍90%乙醇， 。
20、80加热回流提取4次， 每次100分钟， 过滤液减压浓 缩， 得乙醇提取物； 乙醇提取物在水中分散， 加入1倍乙酸乙酯进行萃取， 静置30分钟， 萃取4 次， 取上部萃取液， 减压浓缩， 得乙酸乙酯萃取物； 60倍200-300目柱色谱硅胶， 流动相石油 醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-甲醇(6:1:1)梯度冲洗， 得脂蟾毒配基22mg， 华蟾酥毒 基34mg。 0033 实施例9 取蟾稣样品1g， 加入80倍95%乙醇， 80加热回流提取4次， 每次120分钟， 过滤液减压浓 缩， 乙醇提取物； 乙醇提取物在水中分散， 加入1倍乙酸乙酯进行萃取， 静置30分钟， 萃取4 次， 取上部萃取液， 减压浓缩， 得乙酸乙酯萃取物； 60倍200-300目柱色谱硅胶， 流动相石油 醚-乙酸乙酯和石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(4:1:1)梯度冲洗， 得脂蟾毒配基23mg， 华蟾酥 毒基33mg。 0034 结果与分析 根据多次试验结果分析， 本发明涉及的实验流程中， 提取过程中乙醇最优浓度为90- 95%， 乙酸乙酯萃取体积最佳为1倍， 此时脂蟾毒配基和华蟾酥毒基均分布在萃取液中， 流动 相最佳选择为石油醚-乙酸乙酯和石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯， 此时两种单体得率最高， 分 别是均在92%以上。 说明书 4/4 页 6 CN 105859824 A 6 。