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1、(10)授权公告号 CN 102851211 B (45)授权公告日 2014.04.16 CN 102851211 B (21)申请号 201210298905.2 (22)申请日 2012.08.22 C12N 1/12(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (73)专利权人 王培磊 地址 276000 山东省临沂市双岭路中段临沂 大学 (72)发明人 王培磊 (54) 发明名称 微拟球藻培养基配方及三级培养方法 (57) 摘要 本发明提供了一种微拟球藻培养基配方及 三 级 培 养 方 法， 配 方 如 下 ： NaNO3 7.510-2g， KH2PO4 110-2g，。
2、 NaHCO3 510-1g，柠 檬 酸 铁 (FeC6H5O7.5H2O)210-4g， VB12 510-7g， VB1 110-4g， VH 510-7g， 九 二 0 植 物 生 长 刺 激 素 ( 即赤霉素 )5 国际单位， 人尿 2mL， 消毒海水 1000mL。实验结果表明， 使用优化培养基并采用 三级培养微拟球藻具有生长速度快、 产量高、 成本 低、 易于操作、 不易污染的优点。 (51)Int.Cl. 审查员 董桂灵 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 (10)授权公告号 CN 1028512。
3、11 B CN 102851211 B 1/1 页 2 1. 培养微拟球藻的三级培养方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 配 置 一 种 微 拟 球 藻 培 养 基， 该 微 拟 球 藻 培 养 基 配 方 如 下 ： NaNO37.510-2g， KH2PO4110-2g， NaHCO3510-1g， 柠檬酸铁 210-4g， VB12510-7g， VB1110-4g， VH510-7g， 九二 0 植物生长刺激素 5 国际单位， 人尿 2mL， 消毒海水 1000mL ； 还包括微量元素 0.55 2.25ml/L， 所述微量元素配方为 ： 磷酸二氢钠 32 40g/L、 硫 酸铜 1.2。
4、 3.2g/L、 硫酸锌 4.2 6.2g/L、 氯化钴 4 6g/L、 氯化锰 30 45g/L 加水定容 至 1L ； 所述微量元素溶液中加入乙二胺四乙酸二钠 3 10g/L ； 微拟球藻的三级培养步骤为 ： 1) 一级培养容器为 5000mL 三角烧瓶， 烧瓶用洗液洗涤、 晾干、 120恒温消毒 ； 培养用 的海水比重1.0151.018， 盐度3032， 经过经脱脂棉过滤、 煮沸、 冷却后加入营养盐 ； 室 内培养， 室温20-26， 室内自然光+辅助日光灯管光源照射， 光强3000-10000Lx， 光暗周期 14L ： 10D， 指数增长期藻种接种， 接种密度 300-350104。
5、cell/mL， 不充气 ； 培养期间每天 摇动 6 次， 密度达 3000104cell/mL， 即转入二级培养 ； 2) 二级培养容器为 50L 白塑料桶， 白塑料桶刷干净、 漂白粉消毒后用消毒水冲干净备 用 ； 二级培养用的海水经漂白粉消毒、 硫代硫酸钠处理后加入营养盐 ； 将一级培养的藻液 按 1 10 的比例接种到白桶 ； 室内培养， 室温 20-26， 室内自然光 + 辅助日光灯管光源照 射， 光强 3000-10000Lx， 光暗周期 14L ： 10D， 充气培养， 充气量以能将藻细胞冲起悬浮即 可 ； 3) 三级培养容器为水泥池 ； 面积 20-30m2， 池深 50cm， 。
6、水深 20-30cm， 内贴白色瓷 砖， 三级培养用水经漂白粉消毒、 硫代硫酸钠处理 ； 将二级培养的藻液作藻种转入水泥 池培养， 室外培养， 自然光照射， 充气， 接种密度 200-300104cell/mL， 培养至密度达 2000-3000104cell/mL 即可收获 ； 在步骤 2) 中充气培养时同时施加臭氧， 臭氧的浓度为 0.5 微克 / 升空气 0.8 微克 / 升空气。 权 利 要 求 书 CN 102851211 B 2 1/3 页 3 微拟球藻培养基配方及三级培养方法 技术领域 0001 本发明属于海洋微藻养殖领域， 尤其涉及一种微拟球藻培养基配方及三级培养方 法。 背景。
7、技术 0002 微拟球藻 (Nannochloropsis oculata) 又称微绿球藻， 是一种广泛分布的海水藻 类， 直径为 2-4 微米， 细胞球形， 淡绿色， 富含不饱和脂肪酸及其它营养元素， 其中 EPA 含量 占脂肪酸总量的 30。EPA 能降低胆固醇和甘油三酯的含量， 促进体内饱和脂肪酸代谢， 从而降低血液粘稠度， 增进血液循环， 提高组织供氧而消除疲劳， 并防止脂肪在血管壁的沉 积， 预防动脉粥样硬化的形成和发展、 预防脑血栓、 脑溢血、 高血压等心脑血管疾病。EPA 在 减轻炎症方面也起着重要的作用。 另外， 微拟球藻油脂含量占干重的68以上， 是提炼生物 柴油的理想微藻。。
8、 0003 目前， 微拟球藻规模化培养存在的主要问题是生长缓慢， 生物量低， 易污染， 特别 是梅雨季节， 不利于大规模培养。 以前使用的微拟球藻培养基没有加入碳酸氢钠， 但我的实 验表明， 微拟球藻除了能利用空气中游离的 CO2， 还能有效地利用培养液中的 HCO3- 作为碳 源。大量实验表明 ： 添加 0.5g/L 的碳酸氢钠能能很好地促进微拟球藻的生长。另外， 我还 在培养基中补充了柠檬酸铁、 维生素 H、 赤霉素和人尿， 能将产量提高 54。 0004 总之， 使用优化培养基并采用三级培养微拟球藻方法具有生长速度快、 产量高、 成 本低、 不易污染的优势。 发明内容 0005 为了克服。
9、目前技术的不足， 本发明提供了一种微拟球藻配方及三级培养方法， 具 体技术方案如下 ： 0006 一种微拟球藻培养基， 配方如下 ： NaNO3 7.510-2g， KH2PO4 110-2g， NaHCO3 510-1g， 柠檬酸铁 (FeC6H5O7.5H2O)210-4g， VB12 510-7g， VB1 110-4g， VH 510-7g， 九二 0 植物生长刺激素 ( 即赤霉素 )5 国际单位， 人尿 2mL， 消毒海水 1000mL。 0007 优选地， 还包括微量元素 0.55 2.25ml/L， 所述微量元素配方为 ： 磷酸二氢钠 32 40g/L、 硫酸铜 1.2 3.2g。
10、/L、 硫酸锌 4.2 6.2g/L、 氯化钴 4 6g/L、 氯化锰 30 45g/L 加水定容至 1L。 0008 优选地， 所述微量元素溶液中加入 120 140g/L 的磷酸二氢钠溶液。 0009 优选地， 所述微量元素溶液中加入乙二胺四乙酸二钠 3 10g/L。 0010 应用本发明所提供的培养基对微拟球藻进行三级培养， 包括如下步骤 ： 1) 一级 培养容器为 5000mL 三角烧瓶， 烧瓶用洗液洗涤、 晾干、 120恒温消毒 ； 培养用的海水比 重 1.015 1.018， 盐度 30 32， 经过经脱脂棉过滤、 煮沸、 冷却后加入营养盐 ； 室内培 养， 室温 20-26， 室。
11、内自然光 + 辅助日光灯管光源照射， 光强 3000-10000Lx， 光暗周期 14L:10D， 指数增长期藻种接种， 接种密度 300-350104cell/mL， 不充气。培养期间每天摇 说 明 书 CN 102851211 B 3 2/3 页 4 瓶 6 次。密度达 3000104cell/mL， 即可转入二级培养。2) 二级培养容器为 50L 白塑料 桶， 白塑料桶刷干净、 漂白粉消毒后用消毒水冲干净备用。二级培养用的海水经漂白粉消 毒、 硫代硫酸钠处理后加入营养盐 ； 将一级培养的藻液按 1 10 的比例接种到白桶。室内 培养， 室温20-26， 室内自然光+辅助日光灯管光源照射，。
12、 光强3000-10000Lx， 光暗周期 14L:10D， 充气培养， 充气量以能将藻细胞冲起悬浮即可。3) 三级培养容器为水泥池。面积 20-30m2， 池深 50cm， 水深 20-30cm， 内贴白色瓷砖， 三级培养用海水经漂白粉消毒、 硫代硫酸 钠处理。 将二级培养的藻液作藻种转入水泥池培养， 室外培养， 自然光照射， 充气， 接种密度 200-300104cell/mL， 培养至密度达 2000-3000104cell/mL 即可收获。 0011 优选地， 包括在步骤 2) 中充气培养时同时施加臭氧。 0012 优选地， 臭氧的浓度为 0.5 微克 / 升空气 0.8 微克 / 升。
13、空气。 0013 有益效果 ： 0014 实验结果表明， 使用优化培养基并采用三级培养微拟球藻具有生长速度快、 产量 高、 成本低、 易于操作、 不易污染的优点。 具体实施方式 0015 培养基配制方法 0016 1 柠檬酸铁较难溶解， 可加少量自来水在火炉上微热至 80-90， 并不断搅拌至全 部融化 ； 0017 2 赤霉素为白色结晶粉末， 不易溶解于水， 可先用酒精充分溶解 ( 一般每 g 用 50mL 酒精或 60 度白酒溶解 1 小时以上 )， 再按所需浓度兑水稀释。 0018 3 加营养盐的过程中需不断搅水， 而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入， 以免 发生化学反应 ； 0019。
14、 4 各种营养盐可先配成浓度较高的母液， 再依次添加 ； 0020 5 三级培养各阶段营养盐配方和浓度相同。 0021 一 种 微 拟 球 藻 培 养 基， 其 特 征 在 于 该 微 拟 球 藻 培 养 基 配 方 如 下 ： NaNO3 7.510-2g， KH2PO4 110-2g， NaHCO3 510-1g，柠 檬 酸 铁 (FeC6H5O7.5H2O)210-4g， VB12 510-7g， VB1 110-4g， VH 510-7g， 九二 0 植物生长刺激素 ( 即赤霉素 )5 国际单位， 人尿 2mL， 消毒海水 1000mL。 0022 优选地， 还包括微量元素 0.55 。
15、2.25ml/L， 所述微量元素配方为 ： 磷酸二氢钠 32 40g/L、 硫酸铜 1.2 3.2g/L、 硫酸锌 4.2 6.2g/L、 氯化钴 4 6g/L、 氯化锰 30 45g/L 加水定容至 1L。 0023 优选地， 所述微量元素溶液中加入 120 140g/L 的磷酸二氢钠溶液。 0024 优选地， 所述微量元素溶液中加入乙二胺四乙酸二钠 3 10g/L。 0025 微拟球藻三级培养方法 0026 1 一级培养 0027 一级培养容器为 5000mL 三角烧瓶， 烧瓶用洗液洗涤、 晾干、 120恒温消毒 ； 培 养用的海水比重 1.015， 盐度 30， 经过经脱脂棉过滤、 煮沸。
16、、 冷却后加入营养盐 ； 室内培 养， 室温 20-26， 室内自然光 + 辅助日光灯管光源照射， 光强 3000-10000Lx， 光暗周期 14L:10D， 指数增长期藻种接种， 接种密度 300-350104cell/mL， 不充气。培养期间每天摇 说 明 书 CN 102851211 B 4 3/3 页 5 瓶 6 次。密度达 3000104cell/mL， 即可转入二级培养。 0028 2 二级培养 0029 二级培养容器为 50L 白塑料桶， 白塑料桶刷干净、 漂白粉消毒后用消毒水冲干净 备用。 二级培养用的海水经漂白粉消毒、 硫代硫酸钠处理后加入营养盐 ； 将一级培养的藻液 按 。
17、1 10 的比例接种到白桶。室内培养， 室温 20-26， 室内自然光 + 辅助日光灯管光源照 射， 光强 3000-10000Lx， 光暗周期 14L:10D， 充气培养， 充气量以能将藻细胞冲起悬浮即 可。 0030 3 三级培养 0031 三级培养容器为水泥池。面积 20-30m2， 池深 50cm， 水深 20-30cm， 内贴白色瓷 砖， 三级培养用水经漂白粉消毒、 硫代硫酸钠处理。将二级培养的藻液作藻种转入水泥 池培养， 室外培养， 自然光照射， 充气， 接种密度 200-300104cell/mL， 培养至密度达 2000-3000104cell/mL 即可收获。 0032 优选。
18、地， 包括在步骤 2) 中充气培养时同时施加臭氧。 0033 优选地， 臭氧的浓度为 0.5 微克 / 升空气 0.8 微克 / 升空气。 0034 上述所有的区间都可以实现， 不止端点和中点能实现， 在此特别说明。 0035 最后应说明的是 ： 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制 ； 尽 管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解 ： 其依然 可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换 ； 而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范 围。 说 明 书 CN 102851211 B 5 。