技术领域
本发明涉及细胞学领域，尤其涉及一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞 系及其构建方法。
背景技术
Numb是第一个被发现决定多细胞生物不对称细胞分裂的信号蛋白。在果蝇 中，Numb通过促进Notch泛素化拮抗Notch信号通路，从而决定子细胞的命运。 后来的研究表明Numb是细胞内吞调节蛋白，并用通过内吞参与调节神经细胞 的粘附，轴突的生长及细胞迁移等过程。然而，Numb可能还有一些附加功能， 以证明Numb被认为在乳腺癌细胞中是肿瘤抑制剂。在乳腺癌细胞中常表现 Numb低表达，而研究表明在主要的乳腺癌细胞中Numb低表达导致了p53水平 的降低并升高了药物抗性，同时这种Numb的低表达也提高了Notch受体的活 性。因此，在这一类癌症中，Numb低表达这一单独的事件就决定了一个致癌基 因（Notch）的激活和p53肿瘤抑制通路的衰减。后来研究发现Numb与肿瘤抑 制基因p53、泛素化蛋白HDM2形成三聚体抑制p53的泛素化，从而调节肿瘤 的恶性程度。
Numb的抑癌作用还不止于。研究表明，小脑颗粒细胞前体细胞(granulecell progenitors,GCPs)来源的肿瘤细胞中的Numb水平是下调的。进一步的研究表 明，Numb通过Itch依赖的泛素化，调控Hedgehog的转录因子Gli1的降解，从 而抑制Hedgehog信号通路，而这一调控机制的失去平衡将成为肿瘤发生的诱因 之一。
Numb既可以拮抗Notch信号，又可以维持p53的稳定性，还可以抑制 Hedgehog信号通路，是一个潜在的抑癌分子。
d-Numb在脊椎动物中有两个同源基因Numb基因和Numblike基因， Numblike基因的C端序列与Numb基因也有46.7%的同源性，这表明Numb基 因与Numblike基因在功能上有一定的重叠性但又不完全相同。在发育中的新皮 质，Numb在从VZ区到CP(cortical plate)的各层都有表达，而Numblike则主要 表达在CP层。在神经发生的早期，几乎所有CNS发育的区域，Numb和Numblike 可能对于维持神经前体细胞的命运都是必须的。Numb和Numblike对于维持神 经上皮结构的完整性是必需的，Numb对于(感觉)神经的形态发育也是必需的。 在感觉神经中，Numb和Numblike有可能通过内吞体-溶酶体途径，控制Notch1 是进入早期内吞体抑或晚期内吞体，来实现对Notch1的精细调控，并由此影响 感觉神经元轴突等。
Numb和Numblike共同发挥着许多重要的作用，Numb和Numblike共同低 表达在模拟体内乳腺癌细胞蛋白表达状态上更加合理。
发明内容
基于此，有必要提供一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系及其构建方 法。
一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系，包括真核表达载体，所述真核 表达载体包括用于抑制Numb表达的序列、以及U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列。
在一个实施例中，所述用于抑制Numb表达的序列为SEQ ID No.1所示的核 苷酸序列。
在一个实施例中，所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列 为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
在一个实施例中，所述细胞系为MCF-10A细胞系。
在一个实施例中，所述真核表达载体为pGIPZ质粒。
在一个实施例中，所述用于抑制Numb表达的序列插入到所述pGIPZ质粒 的shRNA插入区。
在一个实施例中，所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列 插入到所述pGIPZ质粒的XbaⅠ位点。
一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系的构建方法，括如下步骤：
构建包括用于抑制Numb表达的序列的真核表达载体，同时制备U6启动子 和用于抑制Numb Numblike表达的序列；
将所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列酶切后连接到所 述包括用于抑制Numb表达的序列的真核表达载体，得到包括用于抑制Numb 表达的序列、以及U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列的真核表 达载体；
将所述包括用于抑制Numb表达的序列、以及U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列的真核表达载体转染到细胞中，得到所述稳定敲低Numb 和Numblike的细胞系。
在一个实施例中，所述真核表达载体为pGIPZ质粒。
在一个实施例中，所述用于抑制Numb表达的序列插入到所述pGIPZ质粒 的shRNA插入区，所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列插入 到所述pGIPZ质粒的XbaⅠ位点。
这种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系，通过抑制Numb和Numblike 的mRNA的转录，以明显降低Numb和Numblike的蛋白表达量。该稳定表达细 胞系的建立，不仅成功在体外模拟了乳腺癌细胞Numb和Numblike的表达状态 为研究Numb和Numblike在乳腺癌中的作用提供了模型，而且也为Numb和 Numblike的功能的研究提供了帮助。
附图说明
图1为原始的pGIPZ质粒的图谱；
图2为一实施方式的稳定敲低Numb和Numblike的细胞系的构建方法；
图3为用293T细胞在pH为7.07的情况下感染病毒24h和48h的荧光图；
图4为用AD293细胞在pH为7.07的情况下感染病毒24h和48h的荧光图；
图5为培养基中不同浓度的Puromycin的选择的筛选结果图；
图6为Q-PCR结果示意图；
图7为Numb和Numblike的蛋白表达电泳图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对 本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以 便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实 施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发 明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的稳定敲低Numb和Numblike的细胞系，包括真核表达载体。
真核表达载体包括用于抑制Numb表达的序列、U6promoter和用于抑制 Numb Numblike表达的序列。
用于抑制Numb表达的序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
U6启动子（U6promoter）和用于抑制Numb Numblike表达的序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
细胞系可以为MCF-10A细胞系，其原始来源为人乳腺细胞，购买自美国菌 种保藏中心(ATCC)。
真核表达载体可以为pGIPZ质粒。
如图1所示，具体来说，用于抑制Numb表达的序列插入在pGIPZ质粒的 shRNA插入区，U6promoter和用于抑制Numb Numblike表达的序列插入在 pGIPZ质粒的XbaⅠ位点。
如图2所示的上述稳定敲低Numb和Numblike的细胞系，包括如下步骤。
S10、构建包括用于抑制Numb表达的序列的真核表达载体，同时制备U6 promoter和用于抑制Numb Numblike表达的序列。
本实施方式中，直接从Open Biosystems公司购入包括用于抑制Numb表达 的序列的真核表达载体（pGIPZ质粒）及shRNA Numblike。
原始的pGIPZ质粒的图谱如图1所示，其中用于抑制Numb表达的序列插 入到shRNA插入区。
用于抑制Numb表达的序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
将shRNANumblike反转录得到序列为后SEQ ID No.3所示的核苷酸序列， 将该SEQ ID No.3所示的核苷酸序列通过病毒感染插入到包含有U6promoter的 pLKO载体的AgeⅠ和EcoRI两个酶切位点之间。
接着将整合了反转录的shRNA Numblike的pLKO载体直接用感受态细胞转 化，涂到有氨苄抗性的平板上，12h~16h小时后，收取平板，挑取10个单克隆 分别放入5ml含有氨苄的LB液体培养基内，置于37℃摇床内摇菌16-20个小时， 之后收取菌液做质粒的少量抽提并用酶切和测序的方法验证正确的连接产物。
确定得到正确的连接产物后，设计引物如下：
F：5’GCTCTAGAGAGGGCCTATTTCCCATGATT3’（SEQ ID No.4）；
R：5’GCTCTAGAGTGGATGAATACTGCCATTTG3’（SEQ ID No.5）。
采用上述引物PCR扩增上述质粒抽提产物，得到U6promoter和用于抑制 Numb Numblike表达的序列，为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
oligo dT、各种限制性内切酶和Taq酶均购自TaKaRa公司，T4DNA连接 酶购自NEB公司，胶回收试剂盒和质粒少量抽提试剂盒购自OMEGA公司，质 粒大量抽提试剂盒购自Nucleo Bond公司。
S20、将U6promoter和用于抑制Numb Numblike表达的序列酶切后连接到 S10得到的包括用于抑制Numb表达的序列的真核表达载体，得到包括用于抑制 Numb表达的序列、以及U6promoter和用于抑制Numb Numblike表达的序列的 真核表达载体。
将U6promoter和用于抑制Numb Numblike表达的序列酶切后连接到S10 得到的pGIPZ载体的Xba I位点上。
通过PCR在Numblike shRNA两端引入酶切位点Xba1以及U6promoter， 利用该酶切位点将shRNA连入真核表达载体pGIPZ，获得真核表达Numblike shRNA质粒pGIPZ-U6promoter-Numblike shRNA。
同时，构建表达Homo Sapiens的Numblike cDNA的载体，通过共转染用于 检测numblike shRNA的效率：抽提人源细胞的总RNA，设计引物RT-PCR得到 numblike cDNA，通过PCR在Numblike cDNA两端引入酶切位点EcoR1和 BamH1，然后酶切连接到pDendra2-C的MCS的EcoRI和BamHI位点上。
将以上两种质粒共转染于细胞中，检测Numblike shRNA的敲除效率。分 别用293T和AD293两种细胞在pH为7.07的情况下感染病毒48小时，以获得 大量带有我们所需的shRNA的病毒以用来感染MCF-10A细胞从而获得 Numb/Numblike knockdown稳定细胞系，结果如图3和图4所示，可以看出 Numblike shRNA效率高，说明质粒构建成功。
制得的包括用于抑制Numb表达的序列、以及U6promoter和用于抑制Numb Numblike表达的序列的真核表达载体记为质粒pGIPZ-Numblike knockdown。
S30、将S20得到的包括用于抑制Numb表达的序列和用于抑制Numb Numblike表达的序列的真核表达载体转染到细胞中，得到稳定敲低Numb和 Numblike的细胞系。
DMEM1640培养基、胎牛血清均购自HyClone公司，转染试剂Magetran 购自Origene公司，Puromycin购自Sigma公司。倒置显微镜为Olympus产品， 荧光倒置显微镜为Nikon公司产品。
本实施方式中采用原始来源为人乳腺细胞的MCF10A细胞，购买自美国菌 种保藏中心(ATCC)。用含10%胎牛血清及100ng/ml霍乱霉素的DMEM1640培 养液培养MCF10A细胞。
确定筛选培养基中合适浓度的Puromycin浓度。
MCF10A细胞接种24孔板细胞培养板，待长至80%满时加入Puromycin使 其浓度分别为0.5、1和2μg/ml，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，培养24小 时后观察细胞死亡情况，结果如图5所示。
由图5可以看出，Puromycin浓度为0.5μg/ml时即可杀死无抗性细胞。因 此选择0.5μg/ml为实验中MCF10A细胞转染后培养基中Puromycin的筛选浓度。
Magetran试剂转染贴壁细胞及抗性细胞克隆的筛选。
接种MCF10A细胞至6孔板，用含10%胎牛血清及100ng/ml霍乱霉素的 DMEM1640培养基培养至密度约为70%~80%时可用于转染。将Magetran试剂 及质粒pGIPZ-Numblike knockdown溶液平衡至室温，在离心管内准备下列混合 液：200μl opti-DMEM、2μg质粒、6μl Magetran转染试剂，震荡混匀后静置室 温孵育15min。给细胞更换新的培养基后将混合液加入培养盘中，摇匀。置于 37℃、5%CO2培养箱中培养，培养12小时候移除培养基，更换为新鲜的含10% 胎牛血清及100ng/ml霍乱霉素的DMEM1640培养基继续培养，24小时后用荧 光显微镜观察转染效率并加入puromycin筛选24小时后，可见无抗性的细胞死 亡只留下有抗性的细胞。再更换新鲜的含10%胎牛血清及100ng/ml霍乱霉素的 DMEM1640培养基，带细胞长至80%时，收细胞做Western Blot检测。
根据目的蛋白敲低的效果选择最佳的质粒开始构建稳定细胞系。本实验选 择的用慢病毒侵染的方法将含shRNA Numb&Numblike的真核表达载体整合到 细胞的基因组中，从而通过RNAi干扰的原理抑制目的蛋白的表达。此技术是目 前较为常用的载体整合技术。
将选出的敲低效果最佳的慢病毒载体与包装成分的2个质粒共转染细胞人 肾293T细胞，以产出病毒。共转48小时后收取病毒，即培养基上清液。之后 再获取的病毒感染MCF10A细胞，将正常的MCF10A细胞铺于6孔板中，每孔 铺100,000个细胞，每孔加入2ml病毒悬液。感染24小时后，再加入用2ml病 毒悬液经行二次感染。48小时后去上清，1×PBS清洗一次，再加入新鲜的含10% 胎牛血清及100ng/ml霍乱霉素的DMEM1640培养基恢复24小时。获得的细 胞进行Q-PCR和蛋白表达量检测。
MCF-10A Numb&Numblike knock-down稳定细胞系蛋白表达量的检测。
用Western Blot的方法检测我们所构建好的稳定敲低Numb和Numblike （Numb&Numblike knock-down）的MCF-10A细胞系的Numb和Numblike蛋白 表达情况。我们使用了Cell Signaling公司的Numb2756#抗体，此抗体同时识别 Numb和Numblike，荧光显色用胶片曝光后可见两条带。我们将正常的MCF-10A 细胞与我们所构建的稳定敲低Numb和Numblike（Numb&Numblike knock-down） 的MCF-10A细胞系同时收样做蛋白检测。首先，去除培养基后加入4℃PBS将 细胞用细胞刮刮下来放入15ml离心管中，2000转5min离心，去除上清，再每 管加入1ml4℃PBS把细胞沉淀吹匀后转移到1.5ml EP管内再次离心并去上清。 接着开始裂解细胞，将RAPA强裂解液与蛋白酶抑制剂，100:1的比例混合后加 到细胞沉淀中，4℃摇晃裂解1h后，4℃14000转离心，取上清即样品。最后测 样品蛋白浓度，并加入Loading buffer煮沸8min，再调平上样量用SDS-聚丙烯 凝胶电泳跑胶。电泳3小时，转膜2小时，之后抗体孵育，一抗2小时，二抗1 小时，显色曝光。
结果
筛选培养基中Puromycin浓度的选择
我们选择刚好能够杀死无抗性细胞的临界浓度作为筛选浓度。如图5所示， 0.5μg/ml Puromycin即可杀死无抗性细胞。因此选择0.5μg/ml为实验中MCF10A 细胞转染后培养基中Puromycin的筛选浓度。
Q-PCR鉴定结果
MCF-10A细胞瞬时转染我们构建好的双敲载体72h后，裂解细胞提取RNA 在反转录成cDNA，最后用实时荧光定量PCR方法检测反转录后的cDNA，从 而测定敲低细胞内Numb和Numblike转录水平变化。
由图6可见，Q-PCR结果显示，Numb和Numblike敲除后与对照相比，表 达量明显降低。说明我们转入的shRNA已整合到MCF10A细胞基因组内并稳定 表达，抑制了mRNA转录。
目的细胞的筛选
正常的MCF10A细胞近似菱形，贴壁生长。转染质粒后，使用Puromycin 浓度为0.5μg/ml的10%胎牛血清及100ng/ml霍乱霉素的DMEM1640培养基进 行筛选，获得抗性克隆。在含Puromycin的培养液中，未转染质粒的细胞死亡。 将获得的抗性细胞混合克隆再用G418进行系列稀释、鉴定、选择后得到单克隆 抗性细胞株。荧光显微镜下可见清晰绿色荧光，证明eGFP表达，也间接证明目 的基因Numb&Numblike shRNA的表达成功，Numb&Numblike knock-down MCF10A细胞与正常MCF10A未见明显的形态差异。
持续传代过程中我们使用无Puromycin和G418的培养基培养仍可见绿色 荧光的表达，同时Q-PCR检测结果显示mRNA转录明显降低。
由图7可见，蛋白表达量检测结果可见Numb和Numblike表达量比正常细 胞明显降低，说明目的基因已整合进MCF10A细胞基因组中可持续表达。
这种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系，通过抑制Numb和Numblike 的mRNA的转录，以明显降低Numb和Numblike的蛋白表达量。该稳定表达细 胞系的建立，不仅成功在体外模拟了乳腺癌细胞Numb和Numblike的表达状态 为研究Numb和Numblike在乳腺癌中的作用提供了模型，而且也为Numb和 Numblike的功能的研究提供了帮助。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体 和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对 于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若 干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围 应以所附权利要求为准。
参考文件：
1Olivier ter B.,Karen＇tH.,Y.Liu1,MireilleC.,KarinJ.and Ben B.LentiviralVector Designfor Multiple shRNA Expression and Durable HIV-1Inhibition.Molecular Therapy,2008,vol.16(3):557-564.
2Li,MJ，Kim，J，Li,S，Zaia，J，Yee，JK，Anderson，J et al.(2005).Long-terminhibition of HIV-1infectioninprimaryhematopoieticcellsbylentiviralvectordeliveofatriplecombination of anti-HIV shRNA,anti-CCR5ribozyme,and a nucleolar-localzing TAR decoy.MolTher12: 900-909.
3Anderson,J，Li，MJ，Palmer B，Remling L,Li，S，Yam,Pet al.(2007).Safety and effcacy ofalentiviral vector containing three anti-HIVgenes-CCR5ribozyme，tat-rev siRNA，andTAR decoy-in SCID-hu mouse-derivedTcells.MolTher15:1182-1188.
4Castanotto，D，Sakurai，K,Lingeman，R，Li，H,Shively L，Aagaard，Let al.(2007). Combinatorialdeiveryofsmallinterfering RNAs reduces RNAi efficacybyselective incorporation into RISC NucleicAcids Res35:5154-164.
5Berges，BK，Wheat，WH，Palmer，BE，Connic-E andAkkina，R(2006).HIV-1infection and CD4Tcelldepletion inthehumanizedRag2/gamma c-/-(RAG-hu)mouse model. Retrovirology3:76
6IvanN.Colaluca，Daniela TOsoni，Paolo Nuciforo,Francesca Senic-Matuglia，Numb controls p53tumour suppressor activitynature,January2008，VOl451|3.
7Salvatore Pece，StefanoConfalonieri，Pascale R.Romano，Pier Paolo Di Fiore，NUMB-ing down cancerby morethan just a NOTCH，Biochimica et BiophysicaActa1815 (201112643.
8UemuraT，Shepherd S，AckermanL,JanLY，Jan YN.numb,agenerequired in determination of cell fate during sensory organformation in Drosophila embryos.Cell1989;58(2): 349-60.
9RhyuMS，JanLY，Jan YN.Asymmetric distributionofnumbproteinduring divisionofthe sensoryorganprecursor cell confers distinctfates to daughter cells.Cell1994;76(3):477-91.
10Spana EP，Kopczynski C，GoodmanCS，Doe CQ.Asymmetric localization of numb autonomously determines sibling neuron identityinthe DrosophilaCns.Development1995; 121(11):3489-94.
11PedersenWA，Chan SL，ZhuHY，Abdur-RahmanLA,Verdi JM，MattsonMP.Numb isoforms containingashortPTB domainpromoteneurotrophic factor-induced differentiattion and neurotrophic factor withdrawal-induced deathofPC12cells.JNeurochem2002;82(4):976-86.
12Toriya M，TokunagaA,SawamotoK，NakaoK，OkanoH.Distinct functions of human Numbisoforms revealed by misexpression in theneural stem cell lineageinthe Drosophilalarval brain.Dev Neurosci2006;28(1-2):142-55.
13Pece S，SerresiM，Santolni E，Capra M，HullemanE，GalimbertiV，et al.Lossof negative regulationbyNumbover Notchisrelevant tohumanbreast carcinogenesis.J CellBiol 2004;167(2):215-21.
14ChennA,Mcconnell SK.Cleavage orientation andthe asymmetricinheritance ofNotch1 immunoreactivityin mammalianneurogenesis.Cell1995;82(4):631-41.
15Dho SE，French MB,Woods SA,McGlade CJ.Characterization offour mammaliannumb proteinisoforms-Identfication of cytoplasmic and membrane-associa ted variantsofthe phosphotyrosine binding domain.JBiol Chem1999;274(46):33097-104.