技术领域
本发明涉及转基因技术，具体涉及一种人血清白蛋白的表达水平高的利 用转基因动物的乳腺生产人血清白蛋白的方法以及其中所用到的表达载体。
背景技术
人血清白蛋白是血浆中最为丰富的蛋白质,对维持血浆胶体渗透压、营 养和体内物质运输等具有重要的作用,并广泛应用于烧伤、休克、营养不良、 慢性消耗性疾病等的治疗。目前临床上所需的白蛋白，几乎全部采用献血员 的血浆。然而由于血源不足的困难，尤其是采用献血员的血浆有感染肝炎 HIV1病毒、艾滋病毒等危险，因此大量生产安全的白蛋白一直是一个难以 达到又迫切需要达到的目标。
《山羊β酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异 性表达》（遗传HEREDITAS(Beijing)23(6):518~520,2001），介绍了一种山 羊beta酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因的表达载体，利用该载体 制备转基因动物，通过转基因动物来生产人血清白蛋白。但是该技术中，人 血清白蛋白的产量极低，达不到具有商业意义的浓度水平。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有的利用转基因动物的乳腺生产人 血清白蛋白的方法中人血清白蛋白的表达水平低下的不足，提供一种人血清 白蛋白的表达水平高的利用转基因动物的乳腺生产人血清白蛋白的方法以 及其中所用到的表达载体。
为此，本发明的技术方案之一是：一种利用转基因动物的乳腺组织生产 人血清白蛋白的方法，包括利用含有人血清白蛋白基因表达盒的载体将人血 清白蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，使该转基因动 物分泌乳汁，从乳汁中获得人血清白蛋白，其中，所述的人血清白蛋白基因 表达盒还包括人血清白蛋白基因3’旁侧序列M2和β-酪蛋白基因的3’旁 侧序列B3中的一种或两种。
本发明中，所述的人血清白蛋白基因3’旁侧序列M2是本领域常规， 较佳的，所述M2的序列如Genebank数据库中的序列AC108157.3的第86983 位到第93655位所示。
所述的β-酪蛋白基因的3’旁侧序列B3是本领域常规，较佳的是牛β- 酪蛋白基因的3’旁侧序列B3或者羊β-酪蛋白基因的3’旁侧序列B3。更 佳的，所述B3的序列如Genebank数据库中的序列AY154895.1的第15803 位到第21170位所示。
所述的人血清白蛋白基因3’旁侧序列M2或β-酪蛋白基因的3’旁侧 序列B3在人血清白蛋白基因表达盒中位于终止子之后。
本发明中，所述的人血清白蛋白基因表达盒是本领域常规，包括启动子、 人血清白蛋白基因和终止子。其中，所述的启动子是本领域常规，只要能够 在哺乳动物细胞中启动下游基因的表达即可，较佳的是在哺乳动物乳腺组织 中启动表达效率高的启动子，较佳的是β-酪蛋白基因启动子，更佳的是山羊 β-酪蛋白基因启动子。
所述的人血清白蛋白基因是本领域常规，较佳的是人血清白蛋白的编码 序列或者是含有内含子I的人血清白蛋白的编码序列。更佳的，所述hAlb cDNA片段的序列如Genebank数据库中的序列NM 000477.5所示。
所述的终止子是本领域常规。
本发明中，所述的含有人血清白蛋白基因表达盒的载体的载体骨架是本 领域常规，只要能够在哺乳动物中表达即可，优选真核表达载体、逆病毒载 体或者慢病毒载体，最优选质粒pcDNA3.1（-）。
本发明中，所述将人血清白蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得 转基因动物的方法是常规，较佳的是将真核表达载体原核显微注射入哺乳动 物的受精卵中，然后移植入假受孕动物中，从而得到转基因动物；或者是慢 病毒载体显微注射哺乳动物受精卵的卵周隙，将感染的受精卵移植入假受孕 动物中，从而得到转基因动物。
本发明中所述的哺乳动物是常规，较佳的是小鼠或奶牛，不包括人。
本发明的技术方案之二是：一种用于制备转基因哺乳动物使其乳腺组织 高表达人血清白蛋白的载体，其含有人血清白蛋白基因表达盒，其中，所述 的人血清白蛋白基因表达盒还包括人血清白蛋白基因3’旁侧序列M2和β- 酪蛋白基因的3’旁侧序列B3中的一种或两种。
该人血清白蛋白基因表达盒的其它优选方式如上所述。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：利用乳腺生物反应器获得药用人血清白蛋 白，是一种安全高效且高利润的方法。乳腺生物反应器产业的特点是成本固 定化，即在原料一致的情况下其成本是不变的。所以当提高了乳汁中的蛋白 表达量时，提高量获得的将会是药品的净利润。所以业界一般认为只要有50% 的蛋白提高，利润就能翻倍。目前已有的人血清白蛋白载体，其蛋白表达约 在1g/L，勉强能够达到产业化的标准。而本发明提供的方法，在动物的乳汁 中人血清白蛋白的浓度至少可达到4.6-6.7g/L，则利润可提高约7-11倍。因 此本发明从转基因牛的牛奶中分离获得人血清白蛋白给人血清白蛋白的生 产提供了一种低成本，高产量的好方法。
附图说明
图1为本发明载体构建示意图。
图2是对照载体构建示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种乳腺高表达的人血清白蛋白载体。本发明改进了载体 使表达水平更高。
首先，本发明用hAlb cDNA序列替换了带有intron I的hAlb序列，发 现能够防止异常剪接的发生，提高hAlb的表达效率。本发明还在hAlb cDNA 之后加入人hAlb的旁侧序列M2、以及牛β酪蛋白基因的旁侧序列B3中的 任何一种或两种，发现无论是在细胞水平还是在个体水平hAlb的表达都有 显著提高。
M2序列为人血清白蛋白基因3’旁侧序列，本发明人发现其中富含多 个CPG岛，将其用于本发明的转基因载体后，发现可以用于提高转基因动 物乳腺中hAlb的表达。B3序列为牛β酪蛋白基因的3’旁侧序列，本发明人 发现其中富含NFI、C/EBP、STAT5及GR等多种重要转录因子的结合位点， 将其用于本发明的转基因载体后，发现其可以提高转基因动物乳腺中山羊β 酪蛋白启动子的表达强度，提高hAlb的表达水平。
本发明的载体提高了人血清白蛋白在转基因动物乳腺中的表达，而在体 内其它组织中的表达基本没有提高。
本发明人首先制备了3个构建载体的片段，然后用这些片段构建了4种 可在哺乳动物细胞中表达人血清白蛋白的表达载体，用这些表达载体转染哺 乳动物细胞，并制备转基因动物，使这些转基因动物受孕泌乳，从乳汁中提 取得到人血清白蛋白，发现人血清白蛋白的产量较现有技术提高可达100多 倍，从而完成了本发明。
制备3个构建载体的片段
人外周血细胞cDNA为模板，利用引物PCR扩增获得hAlb cDNA片段 (2.5kb)，测序所得序列与序列NM 000477.5（人血清白蛋白cDNA序列）比 对完全一致。
人外周血细胞DNA为模板，利用引物PCR扩增获得M2片段（6.7kb）， 测序所得序列与序列AC108157.3（人血清白蛋白3’基因旁侧序列）比对完 全一致。
奶牛外周血细胞DNA为模板，利用引物PCR扩增获得B3片段（5.4kb）， 测序所得序列与序列AY154895.1（牛β酪蛋白基因的3’旁侧序列）比对完 全一致。
构建4种人血清白蛋白的表达载体
用PmeI、BamHI酶切pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-IntronI，回收12.2Kb 的DNA片段，补平，与hAlb cDNA片段连接，获得pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb 载体（后简称hAlb）。
BamHI切开质粒pcDNA3.1-Bp6.7-hAlb，补平，与5.4Kb B3片段连接， 获得pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-B3载体（后简称hAlb-B3）。
将6.7Kb M2片段与BamHI切开的载体pcDNA3.1-Bp6.7-hAlb连接，获 得pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-M2载体（后简称hAlb-M2）。
BamHI切开质粒pcDNA3.1-Bp6.7-hAlb-M2，补平，5.4Kb B3片段连接， 获得pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-M2-B3载体。
用Xho I线性化市售常见的乳腺表达载体pBC1，补平，与hAlb cDNA 片段连接，获得pBC1-hAlb载体，作为对照载体。
表达载体转染哺乳动物细胞
将上述5种表达载体，再加pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-IntronI，转染 HC11细胞，抽提RNA，利用定量PCR方法检测Alb表达，结果无内含子 hAlb、M2、B3都能提高表达量，尤其是hAlb的B3组合表达量最高，而 hAlb-M2-B3的表达量提高没有hAlb的B3组合明显。
表达载体制备转基因动物
将四种载体用Sal I线性化，获得DNA溶液；采集受精卵，将DNA溶 液显微注射入小鼠受精卵；将受精卵吹入输卵管，移植入假受孕鼠；提取鼠 尾组织DNA，利用PCR鉴定Alb阳性转基因小鼠；取转基因母鼠配种，待 分娩后，挤压乳腺，使乳汁从乳头中溢出，用移液枪收集乳液，检测乳汁中 的人血清白蛋白表达，结果和上述细胞水平的结果相同。
下面用实施例进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和 条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
一、片段合成
1）hAlb cDNA片段的扩增。
用上游引物Alb-F：5’－CTGTCAACCCCACACGCCTT－3’（SEQ ID NO.1），下 游引物Alb-R：5’－TTTTCATTTTCTTTCT－3’（SEQ ID NO.2），人外周血 细胞cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系如下：
总共做4个反应管，反应条件为94℃5min；(94℃45sec,56℃45sec,72℃ 3min)×32个循环；72℃10min。扩出约2.5kb的hAlb cDNA片段，将反应液 混合后，取5μL送至上海博尚生物技术公司进行测序，余下产物产物经琼脂 糖电泳，切胶并用试剂盒回收2.5kb的hAlb cDNA片段。然后将测序所得序 列与Genebank数据库中的序列NM 000477.5进行比对，发现完全一致。
2）M2片段的扩增。
用上游引物M2-F：5’－TTATTCATCTGTTTTTCTTT－3’（SEQ ID NO.3），下 游引物M2-R：5’－GAGATTTTGGTGCCAT－3’（SEQ ID NO.4），人外周血 细胞DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系如下：
总共做4个反应管，反应条件为94℃5min；(94℃45sec,56℃45sec,72℃ 5min)×32个循环；72℃10min。扩出约6.7kb的M2片段，将反应液混合后， 取5μL送至上海博尚生物技术公司进行测序，余下产物产物经琼脂糖电泳， 切胶并用试剂盒回收6.7kb的M2片段。测序后进行序列比对，发现所得序 列与Genebank数据库中的序列AC108157.3的第86983位到第93655位完全 一致。
3）B3片段的扩增。
用上游引物B3-F：5’－AGAAGAAACTTATTGGGAAG－3’（SEQ ID NO.5），下游 引物B3-R：5’－ATTAAATGGCTCTAT－3’（SEQ ID NO.6），奶牛外周血细 胞DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系如下：
总共做4个反应管，反应条件为94℃5min；(94℃45sec,56℃45sec,72℃ 5min)×32个循环；72℃10min。扩出约5.4kb的B3片段，将反应液混合后， 取5μL送至上海博尚生物技术公司进行测序，余下产物产物经琼脂糖电泳， 切胶并用试剂盒回收5.4kb的B3片段。测序后进行序列比对，发现所得序 列与Genebank数据库中的序列AY154895.1的第15803位到第21170位完全 一致。
为了确保之后载体构建的方便，在上述三个片段的尾部，都引入一个 BamHI位点。
二、载体构建
1）pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb的构建，见图1中的①。
分子克隆中的所有限制性内切酶和连接酶均购自TAKARA公司。
首先用PmeI部分酶切pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-IntronI（参见文献山 羊β酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异性表达， 遗传HEREDITAS(Beijing)23(6):518~520,2001），打开hAlb-IntronI的3’ 端。酶切体系为：质粒15μg，PmeI（20U/μL）2μL，10×K buffer 15μL，补 H2O至150μL。30℃水浴15分钟，乙醇沉淀DNA。再次重溶于20μL ddH2O 中，而后用BamHI切下hAlb-IntronI片段，酶切体系为：质粒15μg，BamHI （20U/μL）2μL，10×K buffer 15μL，补H2O至150μL。30℃水浴3h，酶切 产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收12.2Kb的DNA片段，经补平后在TE中 溶解。
连接反应体系为200ng的2.5Kb hAlb cDNA片段，100ng 12.2Kb的载 体片段，5μL 2×ligation buffer I，加H2O至10μL。16℃连接过夜后，转化入 TOP10感受态细胞，涂Amp抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质 粒，酶切鉴定，测序确认。最终获得pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb载体（后简 称hAlb）。
2）pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-B3的构建，见图1中的②。
用BamHI切开质粒pcDNA3.1-Bp6.7-hAlb，酶切体系为：质粒15μg， BamHI（20U/μL）2μL，10×K buffer 15μL，补H2O至150μL。30℃水浴3h， 酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收14.7Kb的DNA片段，经补平后在 TE中溶解。
连接反应体系为200ng的5.4Kb B3片段，100ng 14.7Kb的载体片段， 5μL 2×ligation buffer I，加H2O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10 感受态细胞，涂Amp抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶 切鉴定，测序确认。最终获得pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-B3载体（后简称 hAlb-B3）。
3）pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-M2的构建，见图1中的③。
连接反应体系为200ng的6.7Kb M2片段，100ng 14.7Kb的载体 pcDNA3.1-Bp6.7-hAlb（BamHI切开）片段，5μL 2×ligation buffer I，加H2O 至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10感受态细胞，涂Amp抗性平板， 挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定，测序确认。最终获得 pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-M2载体（后简称hAlb-M2）。
4）pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-M2-B3的构建，见图1中的④。
用BamHI切开质粒pcDNA3.1-Bp6.7-hAlb-M2，酶切体系为：质粒15μg， BamHI（20U/μL）2μL，10×K buffer 15μL，补H2O至150μL。30℃水浴3h， 酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收21.4Kb的DNA片段，经补平后在 TE中溶解。
连接反应体系为200ng的5.4Kb B3片段，100ng 21.4Kb的载体片段， 5μL 2×ligation buffer I，加H2O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10 感受态细胞，涂Amp抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶 切鉴定，测序确认。最终获得pcDNA3.1（-）-Bp6.7-hAlb-M2-B3载体。
5）pBC1-hAlb的构建，见图2（⑤）。
pBC1是一种市售常见的乳腺表达载体，目录号K27001，购自Invitrogen 公司。
用Xho I线性化pBC1载体，酶切体系为：质粒15μg，Xho I（20U/μL） 2μL，10×H buffer 15μL，补H2O至150μL。30℃水浴3h，酶切产物经琼脂 糖电泳，用试剂盒回收21.6Kb的DNA片段，经补平后在TE中溶解。
连接反应体系为200ng的hAlb cDNA片段，100ng 21.6Kb的载体片段， 5μL 2×ligation buffer I，加H2O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10 感受态细胞，涂Amp抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶 切鉴定，测序确认。最终获得pBC1-hAlb载体。
三、细胞转染
（1）细胞株：HC11细胞株购自中科院上海生化细胞所；
（2）细胞培养基：高糖DMEM、小牛血清分别购自Gibco、民海公司。 人胰岛素由上海生化制药厂生产，人表皮生长因子（EGF）购自中科院上海 生化所。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。
（3）细胞培养方法：液氮中取HC11细胞冻存管，快速置37℃水中冻 融。冻融细胞1000rpm 5min，倾去上清，可见细胞沉淀，再加约5mL全培 养液，轻轻重悬细胞。加入培养瓶中，镜下可见分散均匀的细胞。放置37℃， 5%CO2及饱和湿度条件下培养。HC11细胞用含10%小牛血清的DMEM培 养基（含青链霉素）培养。两天后用0.25%胰酶将培养瓶中细胞消化下，转 入6孔板中继续培养，每孔加入培养基1.5ml，次日用于转染。
（4）基因转染
1）转染液的制备：
取青霉素小瓶（玻璃离心管）稀释A液和B液。
A液：1.6μgAlb表达载体（分别是hAlb-IntronI，hAlb，hAlb-M2，hAlb-B3， hAlb-M2-B3，pBC 1-hAlb），用Opti-MEM培养液分别定容稀释到100μL， 轻摇。室温放置5min。
B液：3μL Lipofectamine TM 2000质脂体转染试剂（Invitrogen公司）用 Opti-MEM培养液定容稀释到100μL，轻摇。室温放置5min。
将100μL B液分别加入到A液中，轻轻摇匀，室温静置20min，即得转 染液。
2）转染：
HC11细胞悬液用1mL不含血清DMEM培养液漂洗细胞二次，倾去培 养液。每孔中加入200μL转染液，前后摇几次。使培养液完全覆盖细胞。37℃， 5%CO2下培养6h。
3）吸除转染液，加1.5mL完全培养液。
4）37℃，5%CO2及饱和湿度下培养66h。
5）弃去培养液，用0.25%胰酶消化下HC11细胞，抽提RNA，利用定 量PCR方法检测Alb表达。
四、HC11细胞中hAlb表达测定
1）取抽提得到的细胞RNA，同一样本分别用引物beta-actin-RP和引物 hAlb-RP进行逆转录（RT）得到cDNA。两个反应的体系和反应条件完全相 同，包括样本中的RNA用量也是相同的，唯一不同的是所用引物不同。
2）利用荧光定量PCR手段来检测两种cDNA中各自目的基因的拷贝数。 定量PCR获得cDNA的拷贝数的方法采用现有技术，按照文献进行。文献 为：应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率，生命 科学研究，2009，13（5）：394-398。本发明在定量PCR体系中所用的引物 对和探针见下表。
将hAlb数值除以beta-actin数值即可得该种细胞的hAlb相对表达量。
3）细胞的hAlb mRNA表达量如表1。可见，每个表达载体分别获得4 个转基因阳性HC11细胞，这些细胞中hAlb的mRNA相对表达量平均分别 为：hAlb 0.02，hAlb-B30.33，hAlb-M20.11，hAlb-M2-B30.19。空白 细胞对照（即未转基因的HC11细胞）中hAlb的mRNA相对表达量为0。 对于《山羊β酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异 性表达》（遗传HEREDITAS(Beijing)23(6):518~520,2001）中的载体（记为 载体intronI-hAlb），它和载体hAlb的区别在于，其中所用的是带有intronI的 hAlb cDNA序列，而载体hAlb中用的是hAlb cDNA。由此可见，M2、B3 都能提高人血清白蛋白的表达量，尤其是B3，而M2，B3组合后对表达量 的提高没有B3明显。
表1.载体转染的HC11细胞中hAlb mRNA的相对表达量
五、hAlb转基因小鼠制备及乳汁的获取
将六种载体用Sal I线性化，而后用显微注射方式得到转基因小鼠。通 过对鼠尾DNA的PCR检测，确认阳性小鼠。具体方法如下：
一）受精卵供体鼠
选择动情期间的雌鼠（7周龄）于第一日采用腹腔注射方法对雌鼠分别 注射10U孕马血清促性腺激素（PMS），于第三日对已注射PMS的雌鼠腹 腔注射10U人促绒毛膜性激素（HCG），然后与雄鼠以1:1合笼。第四日早 晨检查雌鼠阴栓，有阴栓说明已经交配，将有阴栓的雌鼠可作为受精卵供体 鼠。
二）假孕受体鼠
在供体母鼠注射HCG当日，选择动情期的雌鼠和结扎输精管的雄鼠以 1:1或2:1比例合笼。第二日同供体鼠一起检查阴栓，将有阴栓的雌鼠即作 为假孕受体鼠。
三）受精卵的采集和显微注射
1）受精卵的采集
实验前，所用的物品高压灭菌，实验房间消毒。
培养液准备：
体外培养：超净台环境下，用移液枪吸取KSOM培养液（不含透明质 酸）于一次性塑料培养皿中，在不同位置上滴约40μL的数个液滴（培养皿 背面相应位置编号），再加入胚胎级石蜡油将KSOM液滴全部覆盖，然后将 培养皿置于37°C，5%CO2的培养箱平衡其湿度和pH值，以便将洗涤后的 受精卵放置在此培养皿中进行体外培养。
体外操作：在培养皿中滴加M2培养液、含透明质酸酶M2液滴，将剪 取的输卵管放入其中。
颈椎脱臼法处死受精卵供体小鼠，背侧朝上置于一培养皿盖上，75%乙 醇消毒待切口处的皮毛，在小鼠背侧近中部脊椎一侧纵向剪开，用眼科剪将 皮肤与腹壁分离，再将腹壁同样剪开一小口，用眼科镊将卵巢、输卵管及子 宫提出，再用眼科剪将输卵管完整地剪下来，放在盛有透明质酸酶培养液的 液滴中，同样取对侧及另外供体雌鼠的输卵管。
体视镜下用眼科镊撕开输卵管壶腹部，用移卵管（Transfer pipette）依 次将受精卵收集转移到M2培养液中。在M2液滴中逐个将受精卵吸起，移 入下一个液滴中，如此将每个受精卵清洗数次，这样在选择合适的卵细胞的 同时也将尽量去除透明质酸（注意：载物台上有热光源或放置恒温微热板， 使细胞处于合适的温度环境中）。
从CO2培养箱中取出含有培养液滴和石蜡油的培养皿，用移卵管将洗涤 过的受精卵转移到KSOM液滴中，若受精卵原核发育仍未达到理想状态， 可放入CO2培养箱培养一定时间。
此过程供体鼠每侧输卵管可得到超排受精卵20～80枚不等。理想的受 精卵细胞形态饱满正常，透明带完整，雄原核和雌原核清晰。
2）受精卵的微注射
将先制备好的固定受精卵的胚胎固定管（holding pipette）安置在显微注 射仪的左侧。将DNA溶液从预制好的注射针（Microinjection needle）尾部 加入，在体视镜下检查DNA溶液中有无气泡产生（质粒DNA稀释成4ng/μL， 注射前解冻后离心1-2min）。然后将注射针安置在显微注射仪的右侧，并使 注射针内处于正压状态。
在凹孔载玻片中央滴20～30μL M2，覆盖石蜡油，用移卵管移入待注射 的受精卵。将载玻片移入显微操作仪的载物台上。
在低倍镜下调节焦距，用持卵管将受精卵置于视野的适当位置，再将持 卵管和注射针调节至合适位置（与玻片底部平面呈10°角），通过微调左右臂 使持卵管、注射针和受精卵在一条直线并清晰可见。
将注射针的尖端在持卵管上轻轻碰撞，以碰断注射针的少许尖端，以让 DNA溶液溢出。
在高倍镜下，用持卵管反复吹吸受精卵将其调至合适位置，通过负压将 欲注射的受精卵在左侧持卵管的顶端。受精卵的最佳位置是极体位于正上方， 其雄原核的位置对应于持卵管的中央且近右侧。
将注射针快速刺入雄原核，勿碰触核仁，适当加压，使DNA注入，待 核膨大为原来体积的一倍后迅速将注射针拔出，将受精卵转移。如此反复， 对其它受精卵逐个进行注射，尽可能在较短时间内完成。
将注射完毕的受精卵可置于37°C 5%CO2培养箱中培养一段时间，挑 选出形态较好的受精卵用于移植。
3）受精卵的移植
腹腔注射方法，用戊巴比妥钠溶液（10mg/mL）按1mg/10g体重的剂量 将假孕母鼠麻醉。
将已经麻醉的小鼠背部向上置于培养皿盖上，在最后一根肋骨将凹陷处 去毛，75%乙醇消毒。按常规外科手术在小鼠消毒处行以与脊椎平行的纵切 口，手术镊伸入腹腔，将脂肪及包裹在膜囊中的卵巢、输卵管和子宫一并提 出，并用脂肪镊固定。
将注射后受精卵吸入同一移卵管内，管中吸入气泡作为标志。
在血管稀疏处用眼科镊轻轻撕开卵巢和输卵管之间的囊膜，将镊子伸入 囊膜内，轻轻地将卵巢和输卵管分开，夹住输卵管伞部，提到裂口处，找到 游离端。将充有受精卵的移卵管从输卵管伞部轻轻插入到漏斗部，用口慢慢 地将受精卵吹入输卵管，可见输卵管明显地膨胀及移卵管中气泡移至伞口内。
将移卵管轻轻从输卵管中拔出，将卵巢和输卵管放回腹腔，缝合伤口后 放回洁净鼠笼中，注意保暖，待其苏醒后按常规饲养。植入后19～20天， 受精卵可发育成小鼠出生。
四）转基因小鼠的鉴定
1）鼠尾组织DNA提取
小鼠出生后三周剪取1cm尾组织置于1.5mL EP管中。
在EP管中加400μL消化液buffer，10μL（20mg/mL）蛋白酶K，56°C 消化过夜。
加等体积酚，振荡，混匀后13000rpm离心12min。
取上清液加等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）振荡混匀后13000rpm离 心6min。
取上清液加等体积氯仿:异戊醇（24:1）振荡混匀后13000rpm离心4min。
取上清液加1/10体积3mol/L NaAC及2倍体积无水乙醇混匀室温放置 10min后13000rpm离心10min。
80%乙醇洗二次，真空抽干后溶解于200μL pH 8.0TE中。
2）利用PCR方法检测Alb阳性小鼠。PCR体系见下表。
六、hAlb转基因小鼠乳汁中hAlb表达的检测
取转基因母鼠配种，待分娩后，采用腹腔注射方法，用戊巴比妥钠溶液 （10mg/mL）按1mg/10g体重的剂量将哺乳期（8-10天左右）母鼠麻醉。麻 醉后乳腺注射催产素(0.03IU），等待5min后，用拇指食指挤压乳腺，使乳汁 从乳头中溢出，用移液枪收集乳液于0.5ml EP管内。
选用购自Alpha Diagnostic International,Inc.（6203Woodlake Center San Antonio,TX 78244USA）的Human Serum Albumin ELISA Kit（Catalog#1190） 来检测小鼠乳汁中的人血清白蛋白表达情况，具体操作见Kit说明书，测得 结果如表2。
表2.转基因小鼠乳汁中人血清白蛋白的表达浓度。
由表2可见，每个表达载体分别获得转基因母鼠各4只，它们的乳液中 hAlb表达量平均分别为：hAlb，1.12g/L；hAlb-B3，6.70g/L；hAlb-M2， 4.60g/L；hAlb-M2-B3，5.40g/L。由此可见，M2、B3都能提高人血清白 蛋白的表达量，尤其是B3，而M2，B3组合后对表达量的提高没有B3明显。
从上述结果可见，本发明提供的载体，包括hAlb-M2，hAlb-B3， hAlb-M2-B3，hAlb无论是在mRNA转录水平还是在小鼠乳液蛋白表达水平 都高于已报道的hAlb-Intron I载体和市售的pBC1-hAlb载体。由此可见，本 发明的载体具有非常高的实用价值，可推广于大动物如牛、羊的乳腺生物反 应器。