一种利用微生物降解甲醛的方法.pdf

本发明公开一种利用微生物降解甲醛的方法，步骤为：(1)以活性污泥作为细菌分离源，采用涂布平板及分区划线法经多次纯化分离，最终筛选出一株具有较高降解甲醛效果的菌株，该菌株为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis，将其接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基，4℃保存；(2)将步骤(1)中的菌体活化后接种到装有培养基的无菌三角瓶中，在30℃、150r/min条件下震荡培养10～12h后，细菌进入对数增长期，得菌液，根据含有甲醛的水体中的甲醛含量，将菌液按一定比例投加到含有甲醛的水体中，可以使水体中的甲醛含量降低。本发明利用微生物降解甲醛，能够环保、安全、高效且耗能小的降解甲醛，降解去除率高。

1.  一种利用微生物降解甲醛的方法，其特征在于：其步骤包括：
(1)以活性污泥作为细菌分离源，采用涂布平板及分区划线法经多次纯化分离，最终筛选出一株具有较高降解甲醛效果的菌株，该菌株为苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis，命名为Bacillus thuringiensis str9，将其接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基，于冰箱中4℃保存；
(2)利用菌株Bacillus thuringiensis str9对甲醛的降解，将步骤(1)中在冰箱内保藏的菌体活化后接种到装有培养基的无菌三角瓶中，在30℃、150r/min条件下震荡培养10～12h后，细菌进入对数增长期，得到含有菌株Bacillus thuringiensis str9的菌液，根据含有甲醛的水体中的甲醛含量，将菌液按照一定比例投加到含有甲醛的水体中，可以使水体中的甲醛含量降低。

2.  根据权利要求1所述的一种利用微生物降解甲醛的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的培养基为：MgSO₄0.1g CaCl₂·2H₂O 0.02g KH₂PO₄0.68g MnSO₄·H₂O 0.001g K₂HPO₄1.73g FeSO₄·7H₂O 0.03g NH₄NO₄1.0g，H₂O 1000mL的MS培养基。

一种利用微生物降解甲醛的方法
技术领域
本发明涉及环保技术领域，具体涉及一种利用微生物降解甲醛的方法。
背景技术
甲醛(HCHO)又名蚁醛，具有强烈的致癌和促癌作用，环境中甲醛的主要污染来源是有机合成、化工、合成纤维、染料、木材加工及制漆等行业排放的废水、废气等。另，某些有机化合物在环境中降解也会产生甲醛。进入水体环境中的甲醛可被腐生菌氧化分解，因而能消耗水中的溶解氧。随着经济的发展，我国环境中的甲醛污染问题日益严重，在我国有毒化学品优先控制名单上甲醛高居第二位，所以，去除环境中的甲醛，已是迫在眉睫的问题。
目前，治理甲醛污染的方法主要有化学反应方法、物理吸附技术、臭氧负离子技术、纳米光催化技术、低温等离子技术、植物净化和生物降解等方法。但化学反应法大量反复使用会造成新的二次污染；物理吸附法需要动力，能耗大；臭氧氧化法对无机物无效，有副产物，臭氧浓度太高时对人体有害；纳米光催化法效率较低、性能不稳定；低温等离子法耗电量大而且作用时间较短，需要不定期进行处理；植物净化法摆放过多，夜间使房内的二氧化碳浓度过高，影响健康；目前采用的生物降解法主要采用多菌株混合降解的方式，菌种之间复杂的关系也为菌株培养和降解效率提高制造了一定的障碍。但由于生物法降解甲醛具有降解效果好、投资费用低、占地面积小、工艺流程简单、无二次污染等优点，因此，急待开发出一种可以使用单一菌株就可以有效降解甲醛，且环保、安全、高效、耗能小的微生物菌种。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的上述不足，提供一种环保、安全、高效且耗能小的利用微生物降解甲醛的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种利用微生物降解甲醛的方法，其步骤包括：
(1)以活性污泥作为细菌分离源，采用涂布平板及分区划线法经多次纯化分离，最终筛选出一株具有较高降解甲醛效果的菌株，该菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，命名为Bacillus thuringiensis str9，保藏号为：CGMCC NO.3072，保藏日期：2009.05.18，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，将其接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基，于冰箱中4℃保存。
具体筛选过程如下：取活性污泥悬浮液10ml于牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃、150r/min的摇床上培养16～24h后，吸取10ml富集液于装有100ml MS培养基的250ml三角摇瓶中，培养基成分为MgSO₄ 0.1g  CaCl₂·2H₂O 0.02g  KH₂PO₄ 0.68gMnSO₄·H₂O 0.001g K₂HPO₄ 1.73g FeSO₄·7H₂O 0.03g NH₄NO₄ 1.0g，H₂O 1000mL；并向摇瓶中加入80μL质量浓度为37％～40％的甲醛溶液，最后将三角摇瓶用锡纸包住瓶口(以防甲醛挥发)；在30℃、150r/min的摇床上培养16～24h。取菌悬液，稀释涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，30℃恒温培养24h。在平板上挑选出各单菌落菌种，接种于加有240μL甲醛溶液的MS培养基中，MS培养基放置于三角摇瓶中(共16个摇瓶)，在30℃、150r/min的摇床上培养16～24h。分别从16个摇瓶中取样，测定其溶液中的甲醛浓度，选出甲醛浓度最低的摇瓶，用棉签接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃恒温培养24h，分离出一株细菌，命名为str9株，转接牛肉膏蛋白胨斜面2-3次纯化，4℃保存；
(2)利用菌株Bacillus thuringiensis str9对甲醛的降解，将步骤(1)中在冰箱内保藏的菌体活化后接种到装有培养基的无菌三角瓶中，在30℃、150r/min条件下震荡培养10～12h后，细菌进入对数增长期，得到含有菌株Bacillus thuringiensis str9的菌液，根据含有甲醛的水体中的甲醛含量，将菌液按照一定比例投加到含有甲醛的水体中，可以使水体中的甲醛含量降低，并具有随时间的变化特征，该菌株对甲醛的降解率达到72％以上。
上述步骤(2)中的培养基为：MgSO₄ 0.1g CaCl₂·2H₂O 0.02g KH₂PO₄ 0.68gMnSO₄·H₂O 0.001g K₂HPO₄ 1.73g FeSO₄·7H₂O 0.03g NH₄NO₄ 1.0g，H₂O 1000mL的MS培养基。
本发明的优点：本发明利用微生物降解甲醛，能够环保、安全、高效且耗能小的降解甲醛，降解去除率高(可达72％以上)。
附图说明
图1为本发明的str9株的生长曲线，纵坐标为OD值，横坐标为培养时间。
图2为利用本法明的微生物降解甲醛的曲线图，其中纵坐标左侧为甲醛浓度，右侧为甲醛降解率，横坐标为作用时间。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细描述，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
用于降解甲醛的菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis.)，命名为Bacillus thuringiensis str9；保藏号为：CGMCCNO.3072，保藏日期：2009.05.18，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
实施例
(1)降解甲醛的细菌分离纯化
取活性污泥悬浮液10ml于牛肉膏蛋白胨培养基(为行业内通用的牛肉膏蛋白胨培养基)中，在30℃、150r/min的摇床上培养16～24h后，吸取10ml富集液于装有100ml MS培养基(培养基成分MgSO₄ 0.1g CaCl₂·2H₂O 0.02g KH₂PO₄ 0.68g MnSO₄·H₂O 0.001g K₂HPO₄ 1.73g FeSO₄·7H₂O 0.03g NH₄NO₄ 1.0g，H₂O 1000mL)的250ml三角摇瓶中，并加入80μL质量浓度为37％～40％的甲醛溶液)，最后将三角摇瓶用锡纸包住瓶口(以防甲醛挥发)；在30℃、150r/min的摇床上培养16～24h。取菌悬液，稀释涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，30℃恒温培养24h。在平板上挑选出各单菌落菌种，接种于加有240μL甲醛溶液的MS培养基中，在30℃、150r/min的摇床上培养16～24h。分别取样，测定其溶液中的甲醛浓度，从16个摇瓶中选出甲醛浓度最低的摇瓶，用棉签接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃恒温培养24h，分离出一株细菌，命名为str9株。转接牛肉膏蛋白胨斜面2-3次纯化，4℃保存。
(2)降解甲醛细菌的鉴定
对分离出的菌株进行一系列形态特征及生理生化特征鉴定，结果见表1。并进行DNA提取，16S rDNA序列的扩增，琼脂糖凝胶电泳及PCR产物纯化、测序，确立同源性，结果见表2。
PCR反应条件为：95℃ 4min；95℃ 1min，48℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min
PCR引物(正向引物Pf：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
反向引物Pr：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′)
菌株的生理生化特征基本符合《伯杰细菌鉴定手册》中芽孢杆菌属的特征，从测序结果也可以看出，str9株的DNA序列和苏云金芽孢杆菌的2株菌具有100％的同源性。str9株的测序由上海捷瑞生物工程有限公司完成，结果如下：
ACTCGGTACCCGGGGATCCAAGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTG
GCGGCGTGCCTAAIACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGA
AGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGAT
AACTCCGGGAAACCGGGGCTAAIACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAA
TTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTT
GGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATC
GGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG
AATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGG
CTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCT
GGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG
CGGTAAIACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCA
GGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTG
GAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGT
GAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGT
AACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTA
GTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCT
GAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTC
AAGGGATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAA
表1菌株形态及生理生化特性测定

表2DNA序列同源性比对