技术领域
本发明涉及微生物防治领域，具体为一种解淀粉芽孢杆菌Lh-1及其应用。
背景技术
公知，解淀粉芽孢杆菌在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，这些代谢产物使其能够广泛地抑制作物病源真菌和细菌的活性，利用解淀粉芽孢杆菌进行有效的生物防治，安全高效无污染，开发潜力巨大。目前已报道的解淀粉芽孢杆菌合成菌剂活菌数低，抗菌物质提取不便，如：CN100999667公开了一种设施菜地土壤改良剂及其制备方法与应用，强调作为土壤改良剂，菌剂中菌种的配比和固体菌剂载体的配比，但菌剂单独发酵活菌数仅为10亿/ml。其发酵液菌数明显偏低，在实际应用中用量太大，综合成本偏高。CN 102485880A公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，但菌株所产生的抗菌物质只存在于细胞内，提取工艺繁琐，生产成本增大，且没有在田间实际生产的应用。
此外，壳寡糖是水溶性好、功能作用大、生物活性高的低分子量产品，可以提高植物本身的免疫能力，有效提高作物产量，防治病虫害，增殖土壤和生物肥中的有益菌，被誉为不是农药的农药、不是化肥的化肥，壳寡糖的这种药肥双效的特殊作用决定了它在农业领域的广泛应用。
棉花黄萎病是危害棉花生产的主要病害之一，被称为“棉花癌症”，是棉花生长发育过程中发生最普遍、损失严重的重要病害。在现代农业生产中，由于化学农药的过量使用，造成病原菌耐药性增强，耕层结构失衡土地污染，棉花质量产量下降等问题日益严重。随着人们环保意识的增强，微生物制剂因其高效安全，绿色环保等优势，应用越来越广。但是到目前为止，未见有将解淀粉芽孢杆菌与壳寡糖组合应用于棉花黄萎病以及其他大白菜软腐病菌、桃树腐烂病菌、苹果腐烂病菌等的防治。
发明内容
本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌Lh-1及其应用。
本发明是采用如下技术方案实现的：一种解淀粉芽孢杆菌（bacillusamyloliquefaciens subsp）Lh-1, 保藏编号为CGMCC No.8548，主要生物学特性为，革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，有鞭毛，具有运动性，好氧生长，可形成内生芽孢，在PDA培养基上呈橙红色不透明菌落，表面褶皱，边缘不规则。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期是2013年12月6日。
一种解淀粉芽孢杆菌Lh-1在防治棉花黄萎病、大白菜软腐病、青枯病、桃树腐烂病、苹果腐烂病、辣椒疫霉病、番茄灰霉病方面的应用。
利用所述的解淀粉芽孢杆菌Lh-1制成的微生态菌剂。
利用解淀粉芽孢杆菌Lh-1制成的微生态菌剂，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌含量为8×109 cfu/g。
利用解淀粉芽孢杆菌Lh-1制成的微生态菌剂的制备方法，包括以下步骤：（1）将冰箱保藏的解淀粉芽孢杆菌Lh-1划线接种到PDA固体斜面培养基上，31℃培养48小时活化；将活化后的菌种接种于PDA液体培养基中，31℃震荡培养24小时，菌液作为种子液备用；（2）扩大发酵生产的原料以及重量百分比如下：玉米粉2%，豆饼0.5%，鱼粉0.5%，红糖1%，氯化钠0.1%，其余为水，将原料按配比溶于水加入发酵罐中，高压蒸汽灭菌，将步骤（1）得到的种子液接种到发酵罐中，接种量占原料总体积的2-5%，搅拌速度180r/min，31℃，pH6.8，溶氧相对值20%-40%，发酵36-48小时；（3）当发酵罐内活菌数达到8×109 cfu/g时，将壳寡糖粉加入步骤（2）得到的发酵液中混合均匀，壳寡糖粉的加入量占步骤（2）所得发酵液总重量的1%-2%，装瓶制得解淀粉芽孢杆菌Lh-1微生态菌剂。
上述微生态菌剂中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens subsp) Lh-1具有广谱抑菌活性，对棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）、大白菜软腐病菌（Erwinia carotovora）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、桃树腐烂病菌（Valsa leucostoma）、苹果腐烂病菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、番茄灰霉菌（Phytophthora infestans）都能产生较强的抑制作用，尤其对棉花黄萎病菌具有非常强烈的抑制作用，因此表明此拮抗菌的生物活性具有广谱、高效的特点；壳寡糖为现有公知产品，可改变土壤菌群, 促进有益微生物的生长，壳寡糖还可诱导植物的抗病性, 对多种真菌、细菌和病毒产生免疫和杀灭作用，本发明利用壳寡糖兼具防病促生的功效。
本发明利用解淀粉芽孢杆菌Lh-1与药肥双效的壳寡糖组合制成Lh-1微生态菌剂，活菌数高，用量小，生产工艺简单，成本低，具有防病促生的双重作用，经过苗圃试验验证，大大降低了农作物的发病率，尤其是对于棉花黄萎病的防治，发病率降至6%，防治效果显著；此外，由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于农作物的无公害生产，农民可以不用或减少化学农药的用量，大大节省了开支，而且有利于农产品的出口。
附图说明
图1为基于16S rDNA部分序列构建的系统发育树图谱；
图2为Lh-1的生长曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步阐述，但并不用来限定本发明。
实施例1：
本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens subsp) LH-1的分离与鉴定
1、样品采集
从山西省农业科学院试验田土壤表层到15cm处取样100g，60℃条件下烘干24小时，取1g做分离用。
2、菌株的分离和抗性筛选
(1)菌种稀释：称取1g溶解到装有100ml灭菌蒸馏水的三角瓶中，制成土壤悬浮液，然后梯度稀释至10-9土壤悬浮液。
(2)菌种分离与筛选: 吸取土壤悬浮液50ul与液体培养3天的棉花黄萎病菌50ul加入至冷却好的PDA培养基中，均匀涂布，放置30℃培养箱中倒置培养24h，观察并挑选拮抗菌落(抑制圈大的菌落)；
(3)拮抗菌株纯化:将所挑选菌落在PAD培养基上进行划线纯化，再将得到的纯菌株与棉花黄萎病菌进行拮抗验证，得到一株对棉花黄萎病菌拮抗能力的较强的细菌菌株，命名为Lh-1。
3、菌株的鉴定
对菌株LH-1 进行形态学、生理生化鉴定及系统发育分析。
菌株LH-1革兰氏染色阳性，硝酸盐还原试验阳性，接触酶反应阳性，淀粉水解反应阳性，葡萄糖发酵试验阳性，淀粉水解试验阳性。显微镜下菌体呈杆状，有鞭毛，具有运动性，好氧生长，可形成内生芽孢，在PDA培养基上呈橙黄色不透明菌落，表面褶皱，边缘不规则。该菌株在5-45℃均可以在LB培养基、PDA培养基等培养基上繁殖生长。该菌实验室最适培养基为PDA培养基，最适生长温度31℃，最适Ph值6.8。
收集指数生长期菌体，用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以其为模板采用16S rDNA通用引物扩增16S rDNA基因片段。正向引物：5’-AGTTTGATCCTGGCTCA-3’；反向引物：5’-TACCTTGTTACGACTTCA-3’。PCR反应采用25uL体系：10×缓冲液2.5uL；2 uL （25mmol/L）MgCl2；4 uL（1.25 mmol/L）dNTP；2 uL（100 umol/L）引物；0.4 uL（5U/uL）Taq酶；DNA模板1μL(0.05-1μg/μL)；去离子水13.1 uL 。PCR扩增条件： 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性1 min; 50 ℃退火1 min； 72 ℃延伸3min,共30个循环, 72 ℃延伸5 min。扩增的PCR产物纯化后与pMD18-T载体连接并转化E.coli DH5α,抽提有16S rDNA插入的质粒并交由上海生工生物技术有限公司测序，将测定得到的16SrDNA的序列与NCBI数据库中的相关菌的16SrDNA用Clustal X1.8进行比对分析，并利用Mega4.0构建进化树 (图1)。
根据对菌株的形态学、培养特征、生理生化和16S rDNA的研究结果，菌株LH-1鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens subsp)。解淀粉芽孢杆菌Lh-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所) 保藏登记号为CGMCC No.8548。
4、解淀粉芽孢杆菌Lh-1的生长动力学研究
对解淀粉芽孢杆菌Lh-1的生长动力学研究将为Lh-1微生态菌剂的规模化发酵生产提供基础数据。将经PDA固体斜面培养基活化后的菌种接种于PDA液体培养基中，31℃，震荡培养。在 0、 4、8、 12、16、 20 、 24、28、32小时取样, 用 752 紫外分光光度计 (λ= 6 10 nm) 测定OD值,制作Lh-1的生长曲线图（图2）
实施例2 解淀粉芽孢杆菌Lh-1抑菌谱测定
将棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）、大白菜软腐病菌（Erwinia carotovora）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、桃树腐烂病菌（Valsa leucostoma）、苹果腐烂病菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、番茄灰霉菌（Phytophthora infestans）作为指示菌，测定解淀粉芽孢杆菌Lh-1抑菌效果。具体方法如下:在无菌条件下，将培养48h，稀释105倍50ul解淀粉芽孢杆菌Lh-1菌液均匀涂布到PDA平板培养基上，31℃培养箱中倒置培养48h。氯仿熏蒸菌落20min灭活后，用含指示菌的软琼脂将菌落表面薄铺一层，继续培养24h，每处理重复3次，测定抑菌指数。抑菌指数=抑菌圈直径/Lh-1菌落直径。
表1 Lh-1抑菌指数测定
结果表明解淀粉芽孢杆菌Lh-1对上述指示菌产生较强的抑制作用，尤其对棉花黄萎病菌具有非常强烈的抑制作用，因此表明此拮抗菌的生物活性具有广谱、高效的特点。
实施例3
解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens subsp) Lh-1微生态菌剂的制备
（1）将-80℃冰箱保藏的Lh-1菌种划线接种到PDA固体斜面培养基上，31℃培养48小时活化。将活化后的菌种接种于PDA液体培养基中，31℃震荡培养24小时，菌液作为种子液备用；（2）扩大发酵生产的原料以及重量百分比如下：玉米粉2%，豆饼0.5%，鱼粉0.5%，红糖1%，氯化钠0.1%，其余为水，将原料按配比溶于水加入发酵罐中，高压蒸汽灭菌，将步骤（1）得到的种子液接种到发酵罐中，接种量占原料总体积的2-5%，优选为3%，搅拌速度180r/min，31℃，pH6.8，溶氧相对值20%-40%，发酵36-48小时；（3）当发酵罐内活菌数达到8×109 cfu/g时，将壳寡糖粉加入步骤（2）得到的发酵液中混合均匀，壳寡糖粉的加入量占步骤（2）所得发酵液总重量的1%-2%，优选为1.5%，装瓶制得解淀粉芽孢杆菌Lh-1微生态菌剂。
实施例4
解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens subsp) Lh-1微生态菌剂的苗圃试验
试验设5个处理（表2），采用营养钵育苗的方法,营养钵中底肥施用比例为1%,营养钵育苗至2-3片真叶时移栽到装有5kg土的盆中，每组处理50盆。盆中底肥施用比例为1%,处理间养分差异用尿素、过磷酸钙和氯化钾补齐。盆钵中病原菌接种方法：将棉花黄萎病病原菌的抱子悬液与盆栽土混合均匀装盆(最终浓度为104 cfu/g土)；Lh-1纯菌液（该纯菌液是实施例3中下罐以后不加壳寡糖的纯菌液）接种方法：将菌液与盆中的土混合均匀以达到107 cfu/g土； Lh-1微生态菌剂接种方法：将菌剂与盆中的土混合均匀以达到107 cfu/g土（菌剂中的微生物有8×109 cfu/g，按比例添加到盆土中，使菌剂中活菌含量满足要求）；盆钵试验进行50d后收获。
表2.苗圃试验处理表
防治效果：
将所有处理的棉株收获后，以发病株数，发病率和每组处理总鲜重为指标，衡量防治效果（表3），
发病率=（发病株数/每组总株数）x100%。
表3防治效果表
由上表可知，实验组1空白对照中，由于种子可能带有致病菌，有1株发病。实验组2由于加入黄萎病菌发病率高达98%，且对比实验组1总鲜重下降明显。实验组3中加入黄萎病菌与Lh-1取得不错的防治效果，发病率由98%下降到22%。实验组4中加入黄萎病菌与壳寡糖有一定的防治效果，虽然发病率高于实验组3，但是实验组4中未发病植株长势很好，总鲜重与组3相当，说明壳寡糖兼具防病促生的功效。实验组5中我们用Lh-1与壳寡糖组合的Lh-1微生态菌剂对黄萎病进行防治，发病率降至6%，且总鲜重要高于实验组1空白对照3360g，防病促生效果显著。