技术领域
本发明涉及一种生物医学领域，特别是一种关于避孕的多肽疫苗。
背景技术
计划生育是我国的基本国策，为有效地控制人口过度增长，开发新型的安全、可逆 避孕措施一直是计划生育研究的重要课题。目前男性避孕只能在避孕套和输精管结扎手 术之间选择。前者失败率较高，后者具有不可逆性，且可能产生预想不到的严重免疫学 后果，如持续高水平的抗精子抗体滴度和/或睾丸形态学的改变，故两者均无法令人满意。 20多年来，国内外科学家一直在努力研制避孕疫苗，试图促使男性的免疫系统破坏精子， 使其暂时失去生育能力。开展的研究主要集中于针对居留于精子和男性生殖道的特异性 靶抗原制备疫苗，如PH-20、受精抗原-1，顶体抗原SP-10，受精素β等，尤其是多价疫 苗的开发可明显抑制动物的精卵结合与融合，但受孕抑制率仍停留在50％左右。鉴于此， 开发创新性避孕措施是当前避孕研究的迫切需要。由于受精起源于两性配子细胞的结 合，设想以射精后精子的自我保护分子机制为立足点，靶向性破坏精子受精能力，可以 在保证生活质量的前提下有效遏制精卵结合，将可能成为男性避孕的新理念。
研究表明：射精后的精液中，精子表面的Eppin与精囊蛋白Semenogelin(Sg)相 结合。精子最初呈不动状态，随后前列腺分泌的丝氨酸蛋白激酶前列腺特异性抗原 (PSA)水解其生理底物Sg，释放活动的精子，精液开始液化，精子开始获能，期间精 子膜表面发生一系列的改变，其表面的粘附分子经过一系列修饰和/或脱失，以及膜外 周蛋白(失能因子)被移除。
Eppin-Sg复合物结合在射出的精子表面，其生理意义可能在于保护精子，Eppin含 有两个功能结构域，分别具有抗菌和抑制蛋白酶水解作用，为精子在女性生殖道中保持 生育能力起到天然免疫作用，同时保护精子免遭蛋白酶水解。其中29～73氨基酸残基 之间为乳清酸蛋白(whey a2 cidic protein，WAP)结构域，77～127之间为牛胰蛋白酶抑 制蛋白(bovine panocreatic trypsin inhibitor，BPTI)结构域，又称Kunitz抑制蛋白结构域。 抗Eppin抗体可直接破坏Eppin-Sg复合体，干扰Eppin调控PSA对Sg的水解作用，是 抗Eppin抗体造成免疫性不育的分子基础。
疫苗促使机体产生高滴度抗体的前提是疫苗具有强免疫原性。现代保护性免疫理论 认为，有效的保护性免疫源于一组表位的合理组合和搭配。蛋白质抗原并非通过其完整 分子发挥功能，而是通过其表位体现其特异性。就某一蛋白质抗原而言，它不仅含有B 细胞表位、Th细胞表位、CTL表位、NK细胞表位、MHC限制位等与免疫识别密切相 关的结构，同时还含有毒性或抑制性表位、优势非中和性表位、病理与自身抗原交叉反 应性表位等，它们可引起免疫偏移、免疫颠覆等不利的免疫反应而导致免疫耐受。由于 许多天然抗原引发的免疫反应不能满足预防感染或预防发病的需要，因此，为了提高蛋 白质抗原的保护性，就必须在表位水平上做出选择，摒除后者，保留、改善前者以得到 更理想的疫苗分子。我们既往提出了用模拟抗原(Mimogen)进行特异性免疫的思路和 创立了“Epitope-based Vaccine Design，EBVD(根据抗原表位设计疫苗)”技术路线，并在乙 肝和肿瘤模型的mimogen设计上得到成功验证。模拟抗原在抗原特性上与天然抗原不 同，而引起的免疫反应特异性与天然抗原无异。它摒除了致病性表位、优势非保护性表 位、亚优势保护性表位、交叉反应性表位等不利组分，具有更好的针对性。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效的人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，它避孕效 率高，而且无毒副作用。
本发明的目的是通过这样的技术方案实现的：一种人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕 多肽，它基本的氨基酸序列为：氨基端-LSEIKGVIVHRLEGVGGG-羧基端；以赖氨酸 为接头，将多个该基本的氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。
本发明的基本的氨基酸序列来源于GENBANK报道的人附睾蛋白酶抑制基因的氨 基酸序列(GENBANK登录号为AF286368，公开日为2001年6月14日)，如图1所示， 采用蛋白质表位分子设计的原理和方法，对图1所示的蛋白质序列进行二级结构、抗原 性、B细胞表位、亲水性质、疏水性质的分析研究，找到了具有功能的本发明所指的基 本的氨基酸序列。
氨基酸序列为 MGSSGLLSLLVLFVLLANVQGPGLTDWLFPRRCPKIREECEFQERDVCTKDRQCQDN KKCCVFSCGKKCLDLKQDVCEMPKETGPCLAYFLHWWYDKKDNTCSMFVYGGCQ GNNNNFQSKANCLNTCKNKRFP
本发明所指的基本的氨基酸序列的用途：
按80微克/只/次的剂量与福氏佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股沟皮下组织部位； 7天后，按同样的方法，以50微克/只/次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位； 再过7天，按同样的方法，50微克/只次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。 末次免疫后14天，将接受免疫的小鼠尾静脉取血，收集其血清，按酶联免疫吸附实验 (ELISA法)检测小鼠血清中的抗体滴度，显著高于空白对照组、PBS对照组和无关肽 对照组，取得了明显的疫苗效果，见图1。
另外，取健康人志愿者精液提取蛋白，与本发明的基本的氨基酸序列作为疫苗免疫 上述小鼠的血清反应，酶联免疫吸附实验(ELISA法)结果为阳性，可以中和精液中的 抗原成分，见图2。
避孕观察：将实验组抗原肽免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、 空白对照组和无关肽对照组)免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组 雌小鼠的产仔率。可以获得高效的避孕效果，见图6。
实验例1：本发明的基本的氨基酸序列免疫小鼠的实验结果
主要试剂及其配制：
包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)组成：
Na2CO31.5gNaHCO32.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6；
封闭液(5％小牛血清/PBS溶液)组成：
小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml；
磷酸盐缓冲液(PBS)：
A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成：NaH2PO4，H2O27.6g溶于超纯水1000ml。
B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成：Na2HPO4·7H2O53.6g(或Na2HPO4·12H2O 71.6g或Na2HPO4.2H2O35.6g)溶于超纯水1000ml。
样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分：PBA液19ml：PBB液 81ml：NaGl18.5；超纯水1000ml。
洗涤液(PBST，pH7.4)组成：PBS液1000ml加Tween20 0.5ml，硫柳汞0.1g， 调至pH7.4。
底物液(OPD-H2O2)组成及其来源：OPD(邻苯二胺<盐酸盐>)(Sigma公司，USA)
A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成：柠檬酸19.2g，加蒸馏水至1000ml。
B液(0.2mol/LNa2HPO4溶液)组成：Na2HPO4·12H2O71.7g，加蒸馏水至1000ml。
终止液(2mol/LH2SO4溶液)组成：双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断 搅拌)，加双蒸水至900ml。
新生小牛血清(Hyclone公司，USA)：原装进口，已经过56℃，30分钟水浴灭活 补体，批号：AJH10710。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。
福氏完全佐剂(CFA)：
RPMI gedium1640(Hyclone公司，USA)；
Hanks液(hyclone公司，USA)；
Hepes(GmbH公司，Germany)。
主要仪器：
酶标仪(Thermolab systems multiskan spectrum，USA)、电子天平(AEL-160， LIBROR，日本产)、pH测定仪(～ODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶联板 (Labsystern公司，USA)、电热恒温水热箱(S648，上海医疗器械七厂，中国)。
实验方法：
实验动物分组：健康Balb/c小鼠(北京军事医学科学院实验动物中心提供)40只， 雄性，6～8周龄，10～16g，随机分为6组：对照组3只，权利要求1～5的氨基酸序列作 为疫苗分别分成组，按相同的方法和剂量免疫小鼠，每组10只。
免疫程序：按80微克/只/次的剂量与福氏佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股沟皮 下组织部位；7天后，按同样的方法，以50微克/只.次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的 皮下组织部位；再过14天，按同样的方法，50微克/次.只的剂量注射Balb/c小鼠腹股 沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾静脉放血，收集其血清。
标本的采集和分离：将免疫小鼠尾静脉放血，分离血清，并冻存于一20℃冰箱保 存备用。
间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体：采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴 度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊 抗小鼠IgG，底物为OPD；用96孔酶联板包被抗原浓度为10μg/mL，100μl/孔，置37℃ 恒温水浴箱4小时后，弃去孔中液体；用5％BSA-PBS封闭酶标反应孔，37℃恒温水 浴箱40分钟后，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比例加 入各孔，100μl/L，37℃恒温水浴箱1小时后洗涤3遍；加入酶标二抗，37℃恒温水浴 箱40分钟，加入底物液OPD，100μl/孔，置37℃蔽光显色反应20分钟，终止反应，于 20分钟内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。结果以 双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照OD值>2.1判定为阳性。
实验例2，免疫小鼠的抗体与人精液蛋白抽提液反应
间接酶联免疫(ELISA)方法同实验例1，取健康志愿者精液，蛋白抽提离心后取 上清液体，与小鼠血清反应，用ELISA的方法检测，鉴定的方法同实验例1，结果以双 复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照OD值>2.1判定为阳性。
实验例3，多肽疫苗的合成
采用标准Fmoc方案，起始选用0.0125mmol，PSC树脂(ABI公司产品)，分别按 照权利要求1所述的序列特征、权利要求2所述的序列特征、权利要求3所述的序列特 征、权利要求4所述的序列特征、权利要求5所述的序列特征，使肽链从C端逐个向N 端延伸，各氨基酸原料(美国ABI公司生产)的用量为0.1mmol。各种氨基酸保护基团 是：各氨基酸的α氨基为Pmoc保护，其余侧链保护基团，Arg(Mtr)、tyr(tBu)、Thr(tBu)、 Tyr(tBu)、Asp(OtBu)。每步缩合都加入HoBt/Dcc活化保护氨基酸的羧基。每步缩合用 含有20％六氢吡啶的NMP溶液去除Fmoc保护基，肽链合成后，按照ABI公司推荐的 步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分：结晶苯酸 0.75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)0.5ml、去离子水0.5ml、 三氟乙酸10ml。在室温条件下持续搅拌，反应时间为4.5小时，把肽链从树脂上裂解下 来，同时去除多种保护基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护 基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至1～2ml，加乙醚50ml 使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是肽产品。以上过程都是在 ABI-431A固相自动肽合成仪(美国生产)上完成。图4为按照权利要求1所述的序列 特征所合成多肽疫苗的高压液相色谱仪(HPLC)分析结果，图5为按照权利要求1所 述的序列特征所合成多肽疫苗的质谱图。
本发明的有益效果是：本发明涉及的各氨基酸原料可以室温保存、运输；本发明涉 及的合成多肽疫苗可以室温保存、运输；本发明涉及的合成多肽疫苗可以自动化批量生 产；本发明涉及的合成多肽疫苗均属机体成分，无毒副作用。总之，本发明具有便于运 输保存和自动化批量生产的优点，它具有显著免疫原性和抗原性，免疫效果明显，而且 无毒副作用。
附图说明
本发明的附图说明如下：
图1为本发明的基本的氨基酸序列作为疫苗免疫小鼠的结果；
图2为本发明基本的氨基酸序列免疫小鼠血清与人精子液的反应结果；
图3为本发明的5项权利要求疫苗免疫小鼠的结果；
图4为本发明的基本的氨基酸序列的纯度分析(HPLC测定)；HPLC纯度鉴定结果， 纯度为≥90％。
图5为本发明的基本的氨基酸序列的质谱分析；
图6为本发明的避孕效果分析。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
实施例1：本发明基本的氨基酸序列为：氨基端- LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该基 本的氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。
本发明所指的基本的氨基酸序列的用途：
按80微克/只/次的剂量与福氏佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股沟皮下组织部位； 7天后，按同样的方法，以50微克/只/次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位； 再过14天，按同样的方法，50微克/次/只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部 位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾静脉放血，收集其血清，按酶联免疫吸附实验(ELISA 法)检测小鼠血清中的抗体滴度，显著高于各个对照组，取得了明显的疫苗效果，见图1。
另外，取健康志愿者精液抽提的上清液，与本发明的基本的氨基酸序列作为疫苗免 疫上述小鼠的血清反应，酶联免疫吸附实验(ELISA法)结果为阳性，可以中和人精液 中的抗原成分，见图2。
实验1，本发明的基本的氨基酸序列免疫小鼠的实验结果
主要试剂及其配制
包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)组成：
Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至PH9.6。
封闭液(5％小牛血清/PBS溶液)组成：
小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。
磷酸盐缓冲液(PBS)：
A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成：Na2PO4.H2O27.6g溶于超纯水1000ml。
B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成：Na2HPO4·7H2O53.6g(或Na2HPO4·12H2O 71.6g或Na2HPO4.2H2O35.6g)溶于超纯水1000ml。
样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分：PBA液19ml；PBB液 81ml；Na以18.5；超纯水1000ml。
洗涤液(PBST，pH7.4)组成：PBS液100ml加Tween20 0.5ml，硫柳汞0.1g， 调至pH7.4。
底物液(OPD-H2O2)组成及其来源：0PD(邻苯二胺盐酸盐)(Sigma公司，USA)： 北京鼎国生物技术发展中心分装，原批号：P1526。
A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成：柠檬酸19.2g，加蒸馏水至1000ml。
B液(0.2mol/LNa2HPO4溶液)组成：Na2HPO4·12H2O71.7g，加蒸馏水至1000ml。
终止液(0.2mol/L H2SO4溶液)组成：双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并 不断搅拌)，加双蒸水至900ml。
新生小牛血清(Hyclone公司，USA)：原装进口，已经过56℃，30分钟水浴灭活 补体，批号：AJH10710。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。
福氏完全佐剂(CFA)组成：羊毛脂70g加液体石蜡30ml，充分混匀后分装于10Qnl 清洁玻璃瓶中，8磅灭菌15分钟后4保存待用。卡介苗(批号；991106，成都生物制 品研究所)。
RPM工Medium1640(Hyclone公司，USA)。
Hanks液(Hyclone公司，USA)。
Hepes(GmhH公司，Germany)。
主要仪器：
酶标仪(Thermolabsystemsmultiskanspectrum，USA)、电子天平
(AEL-160，LIBROR，日本产)、pH测定仪(MODEL450，BI0—RAD，USA)、 96孔聚苯乙烯酶联板(Labsystern公司，USA)、电热恒温水热箱(S648，上海医疗器 械七厂，中国)、微量多头细胞收集器(卫星牌ZT一口型，绍兴卫星机械公司)。
实验方法：
实验动物分组：健康Balb/c小鼠(第三军医大学实验动物中心提供)43只，雌性， 6～8周龄，10～16g，随机分为6组：正常对照组3只，权利要求1～5的氨基酸序列作为 疫苗分别分成组，按相同的方法和剂量免疫小鼠，每组10只。
免疫程序：按1加微克/只.次的剂量与福氏佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股沟 皮下组织部位；14天后，按同样的方法，以50微克/只.次的剂量注射Balb/c小鼠腹股 沟的皮下组织部位：再过14天，按同样的方法，50微克/次。只的剂量注射Balb/c小鼠 腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠眼眶放血，收集其血清。标本 的采集和分离：将免疫小鼠眶静脉放血，分离血清，并冻存于-20℃冰箱保存备用。间 接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体：采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度，分 别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊抗小鼠 IgG，底物为OPD；用96孔酶联板包被抗原浓度为10μg/ml，100μl/孔，置37℃恒温水 浴箱4小时后，弃去孔中液体：用5％BSA—PBS封闭酶标反应孔，37℃恒温水浴箱40 分钟后，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比例加入各孔， 100μl/L，37℃恒温水浴箱1小时后洗涤3遍：加入酶标二抗，37℃恒温水浴箱40分 钟，加入底物液OPD，100μl/L，置37℃蔽光显色反应20分钟，终止反应，于20分钟 内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。结果以双复孔 平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照OD值>2.1判定为阳性。
实验2，免疫小鼠的抗体与人精液蛋白抽提液反应
间接酶联免疫(ELISA)方法同实验例1，取健康志愿者精液，蛋白抽提离心后取 上清液体，与小鼠血清反应，用ELISA的方法检测，鉴定的方法同实验例1，结果以双 复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照OD值>2.1判定为阳性。
实验3，多肽疫苗的合成采用标准Fmoc方案，起始选用0.0125mmol，PSC树脂(ABI 公司)，分别按照权利要求1所述的序列特征、权利要求2所述的序列特征、权利要求3 所述的序列特征、权利要求4所述的序列特征、权利要求5所述的序列特征，使肽链从 C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国AB工公司生产)的用量为0.1mmol。各种 氨基酸保护基团是：各氨基酸的β氨基为Pmoc保护，其余侧链保护基团，Arg(Mtr)、 tyr(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)、Asp(OtBu)。每步缩合都加入HoBt/Dcc活化保护氨基酸的 羧基。每步缩合用含有20％六氢吡啶的NMP溶液去除Fmoc保护基，肽链合成后，按 照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液 的成分：结晶苯酸0.75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole) 0.5ml、去离子水0.5ml、三氟乙酸10ml。在室温条件下持续搅拌，反应时间为4-5小 时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤， 以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压 蒸发至1～2ml，加乙醚50ml使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是 肽产品。以上过程都是在ABI～431A固相自动肽合成仪(美国生产)上完成。图4为按照 权利要求1所述的序列特征所合成多肽疫苗的高压液相色谱仪(HPLC)分析
结果：图5为按照权利要求1所述的序列特征所合成多肽疫苗的质谱图。
实施例2：本发明的基本氨基酸序列也可以为：
主要试剂及其配制：
包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pU9.6)组成：Na2CO31.5g， NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6。
封闭液(5％小牛血清/PBS溶液)组成：
小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。
磷酸盐缓冲液(PBS)：
A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成：NaH2PO4·H2O27.6g溶于超纯水1000ml。
B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成：Na2HPO4·7H2O53.6g(或Na2HPO4·12H2O 71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g)溶于超纯水1000ml。
样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分：PBA液19ml：
PBB液81ml；NaCl18.5；超纯水1000ml。
洗涤液(PBST，pH7.4)组成：PBS液1000ml加Tween200，5ml，硫柳汞0.1，调 至pH7.4。
底物液(0PD—H2O2)组成及其来源：OPD(邻苯二胺<盐酸盐>)(Sigma公司， USA)：北京鼎国生物技术发展中心分装，原批号：P1526。
A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成：柠檬酸19.2g，加蒸馏水至1000ml。
B液(0.2mol/LNa2HPO4溶液)组成：Na2HPO4·12H2O71.7g，加蒸馏水至1000ml。
终止液(2mol/L H2SO4溶液)组成：双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并 不断搅拌)，加双蒸水至900ml。
新生小牛血清(Hyclone公司，USA)：
已经过56℃，30分钟水浴灭活补体。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。
福氏完全佐剂(CFA)：Sigma F5881
福氏不完全佐剂(CFA)组成：Sigma F009-1。
RPMI Medium1640(Hyclone公司，USA)。
Hanks液(Hyclone公司，USA)。
Hepes(GmbH公司，Germany)。
主要仪器：
酶标仪(Thermolab systemsmultiskan spectrum，USA)、电子天平(AEL-160， LIBROR，日本产)、pH测定仪(MODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶联 板(Labsystern公司，USA)、电热恒温水热箱(S648，上海医疗器械七厂，中国)。
实验方法：
实验动物分组：健康Balb/c小鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，雌性，6～8 周龄，10～16g，随机分组：正常对照组5只，按权利要求2的氨基酸序列作为疫苗，按 相同的方法和剂量免疫10只小鼠。
免疫程序：按80微克/只/次的剂量与福氏完全佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股 沟皮下组织部位；7天后，按同样的方法与福氏不完全佐剂等量混合，以50微克/只/次 的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位；再过14天，按同样的方法，50微克/ 次/只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾 静脉放血，收集其血清。
标本的采集和分离：将免疫小鼠尾静脉放血，分离血清，并冻存于-20℃冰箱保存 备用。
间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体：采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴 度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊 抗小鼠IgG，底物为OPD；用96孔酶联板包被抗原浓度为10μg/ml，如100μl/孔，置 37℃恒温水浴箱4小时后，弃去孔中液体：用5％BSA-PBS封闭酶标反应孔，37℃恒 温水浴箱40分钟后，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比 例加入各孔，100μl/孔，37℃恒温水浴箱1小时后洗涤3遍；加入酶标二抗，37℃恒温 水浴箱40分钟，加入底物液OPD，100μl/孔，置37℃蔽光显色反应20分钟，终止反 应，于20分钟内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。 结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照0D值>2.1判定为阳性。
避孕观察：将实验组抗原肽免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、 空白对照组和无关肽对照组)免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组 雌小鼠的产仔率。
实施例3：本发明的基本氨基酸序列也可以为：
主要试剂及其配制：
包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pU9.6)组成：Na2CO31.5g， NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6。
封闭液(5％小牛血清/PBS溶液)组成：
小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。
磷酸盐缓冲液(PB)：
A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成：NaH2PO4·H2027.6g溶于超纯水1000ml。
B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成：Na2HPO4·7H2O53.6g(或Na2HPO4·12H2O 71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g)溶于超纯水1000ml。
样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分：PBA液19ml； PBB液81ml；NaCl18.5；超纯水1000ml。
洗涤液(PBST，pH7.4)组成：PBS液1000ml加Tween200，5ml，硫柳汞0.1，调 至pH7.4。
底物液90PD—H2O2)组成及其来源：OPD(邻苯二胺<盐酸盐>)(Sigma公司，USA)： 北京鼎国生物技术发展中心分装，原批号：P1526。
A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成：柠檬酸19.2g，加蒸馏水至1000ml。
B液(0.2mol/LNa2HPO4溶液)组成：Na2HPO4·12H2O71.7g，加蒸馏水至1000ml。
终止液(2mol/L H2SO4溶液)组成：双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不 断搅拌)，加双蒸水至900ml。
新生小牛血清(Hyclone公司，USA)：
已经过56℃，30分钟水浴灭活补体。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。
福氏完全佐剂(CFA)：Sigma F5881
福氏不完全佐剂(CFA)组成：Sigma F009-1。
RPMI Medium1640(Hyclone公司，USA)。
Hanks液(Hyclone公司，USA)。
Hepes(GmbH公司，Germany)。
主要仪器：
酶标仪(Thermolab systemsmultiskan spectrum，USA)、电子天平
(AEL-160，LIBROR，日本产)、pH测定仪(MODEL450，BIO-RAD，USA)、96 孔聚苯乙烯酶联板(Labsystern公司，USA)、电热恒温水热箱(S648，上海医疗器械七 厂，中国)。
实验方法：
实验动物分组：健康Balb/c小鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，雌性，6～8周 龄，10～16g，随机分组：正常对照组5只，按权利要求2的氨基酸序列作为疫苗，按相 同的方法和剂量免疫10只小鼠。
免疫程序：按80微克/只/次的剂量与福氏完全佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股 沟皮下组织部位；7天后，按同样的方法与福氏不完全佐剂等量混合，以50微克/只/次 的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位；再过14天，按同样的方法，50微克/ 次/只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾 静脉放血，收集其血清。
标本的采集和分离：将免疫小鼠尾静脉放血，分离血清，并冻存于-20℃冰箱保存 备用。
间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体：采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴 度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊 抗小鼠IgG，底物为OPD；用96孔酶联板包被抗原浓度为10μg/ml，如100μl/孔，置 37℃恒温水浴箱4小时后，弃去孔中液体：用5％BSA-PBS封闭酶标反应孔，37℃恒 温水浴箱40分钟后，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比 例加入各孔，100μl/孔，37℃恒温水浴箱1小时后洗涤3遍；加入酶标二抗，37℃恒温 水浴箱40分钟，加入底物液OPD，100μl/孔，置37℃蔽光显色反应20分钟，终止反 应，于20分钟内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。 结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照0D值>2.1判定为阳性。
避孕观察：将实验组抗原肽免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、 空白对照组和无关肽对照组)免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组 雌小鼠的产仔率。
实施例4：本发明的基本氨基酸序列也可以为：
主要试剂及其配制：
包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pU9.6)组成：Na2CO31.5g， NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6。
封闭液(5％小牛血清/PBS溶液)组成：
小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。
磷酸盐缓冲液(PB)：
A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成：NaH2PO4·H2O27.6g溶于超纯水1000ml。
B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成：Na2HPO4·7H2053.6g(或Na2HPO4·12H2O 71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g)溶于超纯水1000ml。
样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分：PBA液19ml：
洗涤液(PBST，pH7.4)组成：PBS液1000ml加Tween200，5ml，硫柳汞0.1，调 至pH7.4。
底物液(0PD—H2O2)组成及其来源：OPD(邻苯二胺<盐酸盐>)(Sigma公司， USA)：北京鼎国生物技术发展中心分装，原批号：P1526。
A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成：柠檬酸19.2g，加蒸馏水至1000ml。
B液(0.2mol/LNa2HPO4溶液)组成：Na2HPO4·12H2O71.7g，加蒸馏水至1000ml。
终止液(2mol/L H2SO4溶液)组成：双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并 不断搅拌)，加双蒸水至900ml。
新生小牛血清(Hyclone公司，USA)：
已经过56℃，30分钟水浴灭活补体。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。
福氏完全佐剂(CFA)：Sigma F5881
福氏不完全佐剂(CFA)组成：Sigma F009-1。
RPMI Medium1640(Hyclone公司，USA)。
Hanks液(Hyclone公司，USA)。
Hepes(GmbH公司，Germany)。
主要仪器：
酶标仪(Thermolab systemsmultiskan spectrum，USA)、电子天平(AEL-160， LIBROR，日本产)、pH测定仪(MODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶联 板(Labsystern公司，USA)、电热恒温水热箱(S648，上海医疗器械七厂，中国)。
实验方法：
实验动物分组：健康Balb/c小鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，雌性，6～8 周龄，10～16g，随机分组：正常对照组5只，按权利要求2的氨基酸序列作为疫苗，按 相同的方法和剂量免疫10只小鼠。
免疫程序：按80微克/只/次的剂量与福氏完全佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股 沟皮下组织部位；7天后，按同样的方法与福氏不完全佐剂等量混合，以50微克/只/次 的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位；再过14天，按同样的方法，50微克/ 次/只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾 静脉放血，收集其血清。
标本的采集和分离：将免疫小鼠尾静脉放血，分离血清，并冻存于-20℃冰箱保存 备用。
间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体：采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴 度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊 抗小鼠IgG，底物为OPD；用96孔酶联板包被抗原浓度为10μg/ml，如100μl/孔，置 37℃恒温水浴箱4小时后，弃去孔中液体：用5％BSA-PBS封闭酶标反应孔，37℃恒 温水浴箱40分钟后，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比 例加入各孔，100μl/孔，37℃恒温水浴箱1小时后洗涤3遍；加入酶标二抗，37℃恒温 水浴箱40分钟，加入底物液OPD，100μl/孔，置37℃蔽光显色反应20分钟，终止反 应，于20分钟内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。 结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照0D值>2.1判定为阳性。
避孕观察：将实验组抗原肽免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、 空白对照组和无关肽对照组)免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组 雌小鼠的产仔率。
实施例5：本发明的基本氨基酸序列也可以为：
主要试剂及其配制：
包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pU9.6)组成：Na2CO31.5g， NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6。
封闭液(5％小牛血清/PBS溶液)组成：
小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。
磷酸盐缓冲液(PB)：
A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成：NaH2PO4·H2O27.6g溶于超纯水1000ml。
B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成：Na2HPO4·7H2053.6g(或Na2HPO4，12H2O 71.6g或Na2HPO4·2H2035.6g)溶于超纯水1000ml。
样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分：PBA液19ml；PBB液 81ml；NaCl18.5；超纯水1000ml。
洗涤液(PBST，pH7.4)组成：PBS液1000ml加Tween200，5ml，硫柳汞0.1，调 至pH7.4。
底物液(0PD—H2O2)组成及其来源：OPD(邻苯二胺<盐酸盐>)(Sigma公司， USA)：北京鼎国生物技术发展中心分装，原批号：P1526。
A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成：柠檬酸19.2g，加蒸馏水至1000ml。
B液(0.2mol/LNa2HPO4溶液)组成：Na2HPO4·12H2O71.7g，加蒸馏水至1000ml。
终止液(2mol/L H2SO4溶液)组成：双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并 不断搅拌)，加双蒸水至900ml。
新生小牛血清(Hyclone公司，USA)：
已经过56℃，30分钟水浴灭活补体。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。
福氏完全佐剂(CFA)：Sigma F5881
福氏不完全佐剂(CFA)组成：Sigma F009-1。
RPMI Medium1640(Hyclone公司，USA)。
Hanks液(Hyclone公司，USA)。
Hepes(GmbH公司，Germany)。
主要仪器：
酶标仪(Thermolab systemsmultiskan spectrum，USA)、电子天平(AEL-160，LIBROR， 日本产)、pH测定仪(MODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶联板(Labsystern 公司，USA)、电热恒温水热箱(S648，上海医疗器械七厂，中国)。
实验方法：
实验动物分组：健康Balb/c小鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，雌性，6～8 周龄，10～16g，随机分组：正常对照组5只，按权利要求2的氨基酸序列作为疫苗，按 相同的方法和剂量免疫10只小鼠。
免疫程序：按80微克/只/次的剂量与福氏完全佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股 沟皮下组织部位；7天后，按同样的方法与福氏不完全佐剂等量混合，以50微克/只/次 的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位；再过14天，按同样的方法，50微克/ 次/只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾 静脉放血，收集其血清。
标本的采集和分离：将免疫小鼠尾静脉放血，分离血清，并冻存于-20℃冰箱保存 备用。
间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体：采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴 度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊 抗小鼠IgG，底物为OPD；用96孔酶联板包被抗原浓度为10μg/ml，如100μl/孔，置 37℃恒温水浴箱4小时后，弃去孔中液体：用5％BSA-PBS封闭酶标反应孔，37℃恒 温水浴箱40分钟后，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比 例加入各孔，100μl/孔，37℃恒温水浴箱1小时后洗涤3遍；加入酶标二抗，37℃恒温 水浴箱40分钟，加入底物液OPD，100μl/孔，置37℃蔽光显色反应20分钟，终止反 应，于20分钟内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。 结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照0D值>2.1判定为阳性。
避孕观察：将实验组抗原肽免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、 空白对照组和无关肽对照组)免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组 雌小鼠的产仔率，见图6。
实验4：对上述实施例1-5所述产品进行生殖力回复实验，结果如下：
生殖力回复实验：初次免疫后18—20周后抗体滴度下降明显，从40万下降到2—8 万，26周后抗体滴度低于5000，按雄雌比例1：2进行雌雄小鼠合笼，将实验组抗原肽 免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、空白对照组和无关肽对照组)免 疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组雌小鼠的产仔率。
实验结果表明：免疫雄性小鼠其生殖力回复，肽免疫组的雌小鼠与对照组雌小鼠的 产仔率和受孕率差异不显著，参见表1。
表1、免疫雄鼠抗体滴度下降后合笼情况
免疫分组雄鼠(n)配雌鼠(n)产仔雌鼠产仔率平均产仔数PBS对照组20403680％8.5无关肽组20403989.5％7.0肽组20403785.5％7.7
序列表
<110>中国人民解放军第三军医大学
<120>一种人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽
<160>2
<210>1
<211>13
<212>PRT
<213>智人(Human)
<400>1
Met Phe Val Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Asn Asn Asn
1 5 10
<210>2
<211>15
<212>PRT
<213>麻疹病毒(morbillivirus)
<400>2
Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val
1 5 10 15