利用高产富硒功能杂交红米米糠自发酵液生产松茸多糖.pdf

利用高产富硒功能杂交红米米糠自发酵液生产松茸多糖，属于生物工程技术领域。本发明主要包括高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液的制备，松茸菌种的培养，发酵工艺，菌丝体和发酵液的收集，松茸胞内粗多糖和胞外粗多糖的提取，并将二者合并得到产品松茸粗多糖。其中高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠是杂交红米611A/R319在加工过程中的副产物，但富含有适宜松茸菌生长所需的微量元素，利用其自身的酶类水解后制备成米糠自发酵液，再用于松茸菌的深层液体发酵培养，使松茸菌充分利用该红米米糠中的营养元素，从而快速大量生长出松茸菌丝体。用本发明方法生产松茸多糖，周期短，成本低，工艺简便，有效成分含量高，附加值高，适宜工业化生产。

1.  利用高产富硒功能杂交红米米糠自发酵液生产松茸多糖，其特征是高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液的制备和深层液体发酵法培养松茸菌丝体，其中高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠富含有适宜松茸菌生长所需的微量元素，利用其自身的酶类水解后制备成高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液；将松茸菌孢子接种至新鲜的试管斜面上进行培养，待斜面长好后接种至液体培养基中进行种子液的培养；再通过三级培养，最后转至3000L发酵罐中进行深层液体发酵培养，其中发酵液体培养基中的土豆汁用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液替代，使松茸菌充分利用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠中的营养元素，从而快速大量生长出松茸菌丝体；发酵结束后，收集菌丝体和发酵液，并分别用超声波辅助热水浸提法和乙醇醇提法从菌丝体和发酵液中提取松茸胞内粗多糖和胞外粗多糖，将二者合并得到产品松茸粗多糖；步骤为：
1)高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液制备：
取一定量高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠，60目过筛，按1∶15的料液比加水混合均匀，于40℃水浴保温3h，利用米糠自身的酶类水解淀粉和蛋白质等，后纱布过滤得红米糠自发酵液；
2)菌种培养：
出发菌株为松茸(Tricholoma matsutake Sing.)；
①斜面培养：
培养基配方以g/L计：葡萄糖20，硫酸镁2.38，氯化钙1，磷酸二氢钾0.5，磷酸二氢铵0.4，硝酸钾0.5，土豆汁200，麦芽汁120，维生素B₁0.01，琼脂20，pH自然；
培养方法：将保存的松茸菌种斜面接种到新鲜的空白斜面上，在24℃下培养7-10天；
②500mL一级摇瓶种子培养，装液量200mL：
培养基配方以g/L计：葡萄糖20，硫酸镁2.38，氯化钙1，磷酸二氢钾0.5，磷酸二氢铵0.4，硝酸钾0.5，土豆汁200，麦芽汁120，维生素B₁0.01，pH自然；
培养方法：将培养好的菌种斜面接种至已灭菌的摇瓶中，在24℃，转速120rpm下培养7天；
③5000mL二级摇瓶种子培养，装液量2000mL：
培养基配方以g/L计：葡萄糖20，硫酸镁2.38，氯化钙1，磷酸二氢钾0.5，磷酸二氢铵0.4，硝酸钾0.5，土豆汁200，麦芽汁120，维生素B₁0.01，pH自然；
培养方法：将培养好的一级种子按10％的接种量接种至已灭菌的摇瓶中，在24℃，转速120rpm下扩大培养5天，即成摇瓶种子液；
3)三级发酵培养：
①50L一级发酵种子罐培养，装液量25-30L：
一级发酵种子罐培养基配方以g/L计：高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液200，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁，玉米粉5，麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa下灭菌30min，冷却后按10％的接种量接入摇瓶种子，温度24℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3(V/V)，搅拌转速120rpm，转罐标准：发酵时间45-48h，菌丝球上浮三分之一，镜检有锁状联合，无杂菌；
②500L二级发酵种子罐培养，装液量250-300L：
二级发酵种子罐培养基配方以g/L计：高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液200，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁，玉米粉5，麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa下灭菌30min，冷却后按15％的接种量接入一级种子，温度24℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3(V/V)，搅拌转速120rpm，转罐标准：发酵时间35-40h，菌丝球上浮三分之一，镜检有锁状联合，无杂菌；
③3000L发酵罐培养，装液量1800L：
发酵培养基配方以g/L计：高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液200，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁，玉米粉5，麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa下灭菌30min，冷却后按15％的接种量接入二级种子，温度24℃，罐压0.05Mpa，通气量.1∶0.3(V/V)，搅拌转速120rpm，转罐标准：发酵时间55-60h，pH5.0，平板无杂菌，菌丝球上浮二分之一，镜检有锁状联合，菌丝球不能自溶；
4)松茸多糖的提取：将培养好的发酵液在5000-6000rpm下离心处理，分别收集好发酵液和菌丝体，菌丝体冻干保存；
①胞内粗多糖的获取：将收集到的菌丝体粉末按1∶30的料液比加入蒸馏水，用频率25Hz、功率400W的超声波处理30min，后于90℃水浴中浸提多糖1.5h，然后于4800rpm离心15min，弃沉淀，上清液在0.095MPa，50℃下浓缩至原体积的1/2，再将浓缩液与95％乙醇按1∶3(v/v)混合，置4℃下沉淀12h，在4800rpm离心15min，弃上清液，沉淀中加50mL蒸馏水使其重新溶解，按5∶1加入Sevag试剂(即氯仿∶异戊醇＝4∶1)脱蛋白，然后加3倍体积的乙醇在4℃下沉淀12h，4800rpm离心15min，沉淀经真空冷冻干燥后得松茸胞内粗多糖；
②胞外粗多糖的获取：将收集到的离心后的发酵液减压浓缩为原体积的五分之一后，用3倍体积的95％乙醇醇提12-16h，然后用5000-6000rpm离心20-30min，收集沉淀，将沉淀用少量蒸馏水复溶后冷冻干燥，即得松茸胞外粗多糖；
③产品的获得：将提取得到的松茸胞内粗多糖和松茸胞内粗多糖二者合并，即得产品松茸粗多糖。

利用高产富硒功能杂交红米米糠自发酵液生产松茸多糖
一、技术领域
利用高产富硒功能杂交红米米糠自发酵液生产松茸多糖，属于生物工程技术领域。涉及高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液的制备和深层液体发酵法培养松茸菌丝体，其中高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠富含有适宜松茸菌生长所需的微量元素，利用其自身的酶类水解后制备成高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液；发酵液体培养基中的土豆汁用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液替代，使松茸菌充分利用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠中的营养元素，从而快速大量生长出松茸菌丝体；然后收集菌丝体和发酵液，并分别用超声波辅助热水浸提法和乙醇醇提法从菌丝体和发酵液中提取松茸胞内粗多糖和胞外粗多糖，将二者合并得到产品松茸粗多糖。
二、背景技术
松茸(Tricholoma matsutake Sing)，又名松菌、松覃、松口蘑，属担子菌门(Basidiomycota)，担子菌纲(Basidiomycetes)，伞菌目(Agaricales)，口蘑科(Tricholomataceae)，口蘑属(Tricholoma)。该菌菇体肥大，肉质细嫩，香味浓郁，别具风味，具有很高的营养价值和特殊的药用效果。其子实体富含蛋白质、脂肪和人体必须的8种氨基酸，含有丰富的维生素B1、维生素B2、维生素C及维生素PP，还含有菌类中少有的B-G酸、核酸衍生物、肽类、有机锗、多糖等。是世界上享有很高声誉的名贵食用菌。据分析，鲜松茸约含水分89.9％、在菌子中粗蛋白17％、纯蛋白8.7％、粗脂肪5.8％、可溶性无氮化合物总量61.5％、粗纤维8.6％、灰分7.1％。另外，松茸菌丝体中含有一种蒎稀(α-Pinene)的抗菌物质，能够阻止病毒的繁殖。松口蘑具有强身、益肠胃、止痛、理气化痰之功效。现代科学研究表明，松茸还具有治疗糖尿病、抗癌等特殊作用，其主要药理活性成分为多糖类物质。
松茸一般采用固体栽培法生产，但传统的固体栽培法有周期长、质量不易控制等诸多弊端，而采用液体深层发酵技术，菌种经种子的多次扩大培养进入发酵罐，菌丝体在较短时间得以迅速扩增，比传统的食用菌生产方法有明显的优越性。而且研究表明，常以子实体用药的真菌，在它们的菌丝体中亦含有与子实体相同的药效成分和相似有效成分含量，这就给液体发酵法生产松茸多糖提供了理论依据。
米糠是稻谷加工的副产品，是稻谷脱壳后附着在糙米上的表皮层，由稻谷的种皮、外胚层、糊粉层、胚和少量胚乳构成，约占稻谷总量的5％-7％。国外最新研究证明，米糠含有稻米64％的营养成分及90％以上的人体所需元素，其中蛋白质含量约12％～18％、脂肪16％～20％、矿物质12％、膳食纤维约14％、碳水化合物总量约50％，另外还含有如膳食纤维、维生素、谷维素、矿物质、植酸和肌醇等多种功能物质，是极具开发潜力的一种高附加值资源。
有色稻米是由于在果皮和种皮上沉积色素而显示出特定颜色的，它富含特殊的微量元素和营养物质，且其含量与色素密切相关。高产富硒功能杂交红米611A/R319是四川大学与四川农业大学水稻研究所共同研究的高产杂交红米，该杂交稻富含硒、锗等有益微量元素；高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠是杂交红米611A/R319在加工过程中的副产物，但富含有适宜大型真菌生长所需的微量元素，因此利用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠发酵培养松茸并提取松茸粗多糖具有很高的应用价值。
三、发明内容
本发明的目的是提供一种利用高产富硒功能杂交红米米糠自发酵液生产松茸多糖的方法，采用先进的生物技术，制备出高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液，再利用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液深层发酵培养松茸菌丝体，使松茸菌充分利用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠中的营养元素，从而快速大量生长出松茸菌丝体，大大缩短了生产周期，本发明的生产周期为5-7天(传统的固体培养子实体的周期一般在30-50天左右)。本发明全部采用粮食原料，污染小，技术含量高，松茸多糖得率高，产品附加值高。
本发明的技术方案：利用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠中自身的酶类水解后制成高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液，用于松茸菌液体深层发酵培养；将松茸菌孢子接种至新鲜的试管斜面上进行培养，待斜面长好后接种至液体培养基中进行种子液的培养；再通过三级培养，最后转至3000L发酵罐中进行深层液体发酵培养，其中发酵液体培养基中的土豆汁用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液替代，使松茸菌充分利用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠中的营养元素，从而快速大量生长出松茸菌丝体；发酵结束后，收集菌丝体和发酵液，并分别用超声波辅助热水浸提法和乙醇醇提法从菌丝体和发酵液中提取松茸胞内粗多糖和胞外粗多糖，将二者合并得到产品松茸粗多糖。
步骤为：
1)高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液制备：
取一定量高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠，60目过筛，按1∶15的料液比加水混合均匀，于40℃水浴保温3h，利用米糠自身的酶类水解淀粉和蛋白质等，后纱布过滤得红米糠自发酵液。
2)菌种培养：
出发菌株为松茸(Tricholoma matsutake Sing.)；
①斜面培养：
培养基配方以g/L计：葡萄糖20，硫酸镁2.38，氯化钙1，磷酸二氢钾0.5，磷酸二氢铵0.4，硝酸钾0.5，土豆汁200，麦芽汁120，维生素B₁0.01，琼脂20，pH自然；
培养方法：将保存的松茸菌种斜面接种到新鲜的空白斜面上，在24℃下培养7-10天；
②500mL一级摇瓶种子培养，装液量200mL：
培养基配方以g/L计：葡萄糖20，硫酸镁2.38，氯化钙1，磷酸二氢钾0.5，磷酸二氢铵0.4，硝酸钾0.5，土豆汁200，麦芽汁120，维生素B₁0.01，pH自然；
培养方法：将培养好的菌种斜面接种至已灭菌的摇瓶中，在24℃，转速120rpm下培养7天；
③5000mL二级摇瓶种子培养，装液量2000mL：
培养基配方以g/L计：葡萄糖20，硫酸镁2.38，氯化钙1，磷酸二氢钾0.5，磷酸二氢铵0.4，硝酸钾0.5，土豆汁200，麦芽汁120，维生素B₁0.01，pH自然；
培养方法：将培养好的一级种子按10％的接种量接种至已灭菌的摇瓶中，在24℃，转速120rpm下扩大培养5天，即成摇瓶种子液；
3)三级发酵培养：
①50L一级发酵种子罐培养，装液量25-30L：
一级发酵种子罐培养基配方以g/L计：高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液200，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁，玉米粉5，麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa下灭菌30min，冷却后按10％的接种量接入摇瓶种子，温度24℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3(V/V)，搅拌转速120rpm，转罐标准：发酵时间45-48h，菌丝球上浮三分之一，镜检有锁状联合，无杂菌；
②500L二级发酵种子罐培养，装液量250-300L：
二级发酵种子罐培养基配方以g/L计：高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液200，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁，玉米粉5，麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa下灭菌30min，冷却后按15％的接种量接入一级种子，温度24℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3(V/V)，搅拌转速120rpm，转罐标准：发酵时间35-40h，菌丝球上浮三分之一，镜检有锁状联合，无杂菌；
③3000L发酵罐培养，装液量1800L：
发酵培养基配方以g/L计：高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液200，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁，玉米粉5，麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa下灭菌30min，冷却后按15％的接种量接入二级种子，温度24℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3(V/V)，搅拌转速120rpm，转罐标准：发酵时间55-60h，pH5.0，平板无杂菌，菌丝球上浮二分之一，镜检有锁状联合，菌丝球不能自溶；
4)松茸多糖的提取：将培养好的发酵液在5000-6000rpm下离心处理，分别收集好发酵液和菌丝体，菌丝体冻干保存；
①胞内粗多糖的获取：将收集到的菌丝体粉末按1∶30的料液比加入蒸馏水，用频率25Hz、功率400W的超声波处理30min，后于90℃水浴中浸提多糖1.5h，然后于4800rpm离心15min，弃沉淀，上清液在0.095MPa，50℃下浓缩至原体积的1/2，再将浓缩液与95％乙醇按1∶3(v/v)混合，置4℃下沉淀12h，在4800rpm离心15min，弃上清液，沉淀中加50mL蒸馏水使其重新溶解，按5∶1加入Sevag试剂(即氯仿∶异戊醇＝4∶1)脱蛋白，然后加3倍体积的乙醇在4℃下沉淀12h，4800rpm离心15min，沉淀经真空冷冻干燥后得松茸胞内粗多糖；
②胞外粗多糖的获取：将收集到的离心后的发酵液减压浓缩为原体积的五分之一后，用3倍体积的95％乙醇醇提12-16h，然后用5000-6000rpm离心20-30min，收集沉淀，将沉淀用少量蒸馏水复溶后冷冻干燥，即得松茸胞外粗多糖；
③产品的获得：将提取得到的松茸胞内粗多糖和松茸胞内粗多糖二者合并，即得产品松茸粗多糖。
5)检验：检验标准如下：
①多糖含量≥20％
②蛋白质含量≥4％
③水分≤8％
④菌落总数≤1000cfu/g，大肠杆菌≤40npn/100g，酵母≤25cfu/g，霉菌≤25cfu/g，致病菌不得检出，LD50为阴性。
⑤铅≤1.5mg/kg，砷≤1.0mg/kg。
本发明的有益效果：本发明采用先进的生物技术，利用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液深层发酵培养松茸菌丝体，使松茸菌充分利用高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠中的营养元素，从而快速大量生长出松茸菌丝体，大大缩短了生产周期，本发明的生产周期为5-7天(传统的固体培养子实体的周期一般在30-50天左右)。本发明全部采用粮食原料，污染小，技术含量高，松茸多糖得率高，产品附加值高。
四、具体实施方式
1.高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液制备：取一定量高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠，60目过筛，按1∶15的料液比加水混合均匀，于40℃水浴保温3h，利用米糠自身的酶类水解淀粉和蛋白质等，后纱布过滤得红米糠自发酵液。
2.种子液的制备：将保存的松茸菌种斜面接种到新鲜的空白斜面上，在24℃下培养7-10天后将斜面上的菌体刮入事先灭好菌的装有适量无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡10分钟，制成菌悬液。吸4ml该菌悬液于事先灭好菌的2只500mL三角瓶中(按上述一级摇瓶配方配制的培养基，装液量为200mL)，在24℃，转速120rpm下培养7天得一级摇瓶种子；无菌条件下，将培养好的一级摇瓶种子一瓶倒入事先灭好菌的用上述二级摇瓶种子配方配制的5000mL(装液量为2000mL)三角瓶中，在24℃，转速120rpm下培养5天，长好后将两瓶种子液合并即成摇瓶种子液。
3.一级种子罐培养：按上述一级种子罐培养基配方，在0.1Mpa下灭菌30分钟冷却后接入摇瓶种子。按上述一级种子罐培养参数培养。采用50L全自动发酵罐，装液量为25-30L。
4.二级种子罐培养：按上述二级种子罐培养基配方，在0.1Mpa下灭菌30分钟冷却后接入一级种子。按上述二级种子罐培养参数培养。采用500L全自动发酵罐，装液量为250-300L。
5.深层液体发酵培养：采用3000L发酵罐，装液量为1800L。按上述发酵培养基配方，相同条件灭菌后接入二级液体种子。按上述发酵罐的培养参数培养。
6.胞内粗多糖的获取：将培养好的发酵液用上述胞内粗多糖的提取方法，收集菌丝体，得到25kg干菌丝体，提取多糖后得到2.2kg胞内粗多糖。
7.胞外粗多糖的获取：按上述胞外粗多糖的提取方法，得到260L浓缩液，提取多糖后得到5kg胞外粗多糖。
8.将二者合并得到松茸粗多糖7.2kg。