SARS冠状病毒全病毒疫苗 【技术领域】
本发明涉及分子流行病学领域，具体是针对严重急性呼吸综合征病毒的疫苗及其制备方法。
背景技术
2003年我国和世界上许多国家遭到了一次大规模的非典型肺炎(Atypicalpneumonias)的侵袭，由非典型肺炎引起的严重急性呼吸综合征(Severe AcuteRespiratory Sydrome，SARS)已经在22个国家和地区发生。世界卫生组织(WorldHealth Organization，WHO)在疫情发生后迅速建立起由全球10个国家的13个实验室组成的协作研究和监测网络。4月16日，WHO正式确认SARS的病原体是一种新型冠状病毒，这是一种单链RNA病毒。
全球已有8000多例非典型肺炎患者，在某些发病区其死亡率达到15％，给人民群众带来了极大的恐慌。医务工作者和生物学领域的研究人员及时开展SARS冠状病毒的病原学以及预防、诊断和治疗的研究，并且对于该病毒的变异过程和各阶段的毒性和传染力的特点都有了一定的了解。但是目前对于SARS病毒疫苗的工作仍然没有显著的进展。
目前报道的疫苗候选株，一般都是来自于SARS危重病人的毒株。由于SARS病毒的危险性强，实验条件要求高，以及在人身上实验的困难，SARS病毒的疫苗很难研究开发。
虽然还有人开发预防和治疗SARS的DNA疫苗和基因工程亚单位疫苗，但是历史经验表明，只要安全性得以保证，全病毒疫苗一直是一种非常有效的疫苗。因此开发全病毒疫苗一直是抗SARS疫苗的研究重点。
然而，人们在体外培养中发现，流行病中晚期地SARS病毒较容易在体外培养从而获得病毒颗粒，而来自于果子狸的SARS病毒颗粒较难在体外培养，因此在制备灭活疫苗和减毒疫苗时，大多采用中晚期的SARS病毒株。
目前已经尝试的用于制备疫苗的SARS病毒株包括BJ-01，02和03(GenBank登录号：AY278488、AY278487和AY278490)。国外可能正在尝试的是与TOR2(GenBank登录号：AY27419)同类的毒株。由于这些病毒都是中晚期的SARS病毒，毒性强，传染能力强，具有非常高的危险性。而且由于实验动物猴子本身对SARS病毒并不敏感，虽然疫苗在猴体内产生的反应很小，但不等于对中晚期SARS全病毒疫苗的安全性进行了有效的验证。
因此，本领域迫切需要开发能够既可有效产生抗SARS病毒免疫力，又具有安全性的疫苗，尤其是全病毒疫苗。
【发明内容】
本发明的目的就是提供一种既可有效产生抗SARS病毒免疫力，又具有安全性的SARS全病毒疫苗。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种疫苗组合物，其特征在于，该疫苗组合物含有早期SARS病毒的全病毒颗粒和生理学上可接受的载体。
在该方面的一个优选例中，该SARS病毒的核苷酸序列中具有至少一个选自下组的核苷酸减毒变异：SEQ ID NO：1中9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其组合。
在该方面的另一个优选例中，该SARS病毒的蛋白具有氨基酸突变，所述的氨基酸突变对应于的选自下组的核苷酸减毒变异：SEQ ID NO：1中9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其组合。
在该方面的另一个优选例中，该SARS病毒是GZ-02病毒株，具有GenBank登录号为AY390556的核苷酸序列。
在本发明的另一个优选例中，该SARS病毒是灭活的。
在本发明的还有一个优选例中，该疫苗组合物所含的生物学上可接受的载体是佐剂。
在本发明的另一个方面，提供了上述疫苗组合物用于制备抗SARS的抗体的用途。
在本发明的还有一个方面，提供了上述疫苗组合物用于制备预防SARS病毒感染的药物的用途
【附图说明】
图1描述了60种SARS冠状病毒基因组序列的邻近关系，显示了各病毒株的变异来源的树状图。从下至上为早期、中期、晚期的变异。
【具体实施方式】
本发明人经过深入研究发现，虽然中晚期的SARS易于培养从而便于获得大量病毒颗粒，但是其毒性太强，传染能力强，具有非常高的危险性，因此安全性难以得到保障。相反，果子狸SARS病毒虽然体外培养较为困难，但是由于毒性较低，传染能力较低，因此预期安全性好。人类早期SARS病毒，可以体外培养，但是，毒性和传染力较弱，因此，是疫苗的较好的候选毒株。此外，研究还证实了，早期SARS全病毒足以产生抗早、中、晚等各个时期的SARS的免疫力，因此用早期SARS病毒制得的全病毒疫苗具有非常好的安全性和保护性免疫力。
本发明中使用的具有减毒突变的SARS病毒(GZ02)序列(Genbank的登录号AY390556)是申请人从广州分离到的SARS病毒早期病毒株，其基因序列保藏在GenBank，具有登录号AY390556。与加拿大分离到的SARS病毒株TOR2的基因序列(Genbank的登录号AY274119)相比，具有一系列突变差异，可能与毒性或传染力相关，特别是选自9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其组合的减毒突变。
从流行病学分析可见，该突变属于SARS早期的突变，在原始的果子狸序列(SZ16，GenBank登录号AY304488)以及早期病人(GZ02，AY390556)分离到的病毒序列中都具有这些突变。根据临床观察，GZ02这种早期的SARS病毒在人体内毒性小，感染力弱。虽然该GZ02株分离得自一位老年患者的尸检材料，但是，其他早期病人均具有同类的突变，且病情较弱。这表明，用早期病毒进行免疫，会比现在使用的中晚期病毒具有更好的保护性免疫力和更低的毒性。
在本发明之前，有三个依据说明本领域技术人员使用的是中晚期病毒制备疫苗。首先，从流行病史和地域上可见，该地域在SARS传播的路线上已经属于中晚期，因此，这些地区的研究人员所能够获得的SARS病毒的来源是有限的，鉴于运输上的危险性，以及当时并未确定SARS病毒的临床基因变异，这些地域的研究人员只能用当地收集的病毒进行研究。图1是SARS病毒各病毒株变异的树状图，其中可见中晚期的病毒与早期病毒相比经过了多次变异。而且，其中的基因序列也有了很大的不同，下文的表1显示了几种有代表性的SARS病毒核苷酸序列上几个主要位点的变化。
表1 SARS病毒单核苷酸变异的重要位点位置 1206 9404 9479 17564 20840 21721 22222 23823 27827早期型 C C C G A A C G C中期型I T T T G G A C T C中期型II T C T G G A C T C晚期型 T T T T G G T T T
其次，如发明背景中所述，中期和晚期的病毒由于感染效力强，在Vero细胞内复制增殖的能力强，因此易于培养。虽然在研究中具有一定的危险性，这依然是最快获得大量病毒颗粒的有效途径。
第三，果子狸和早期的病毒由于感染能力弱，难于培养，因此收集困难。使得研究人员暂时不考虑用其制备疫苗。
本发明的发明人通过对中国SARS流行病学的研究，发现早期病人的SARS病毒分离株与果子狸的冠状病毒非常相似，而且通过培养收集了足以制备疫苗的病毒株，克服了原始的果子狸冠状病毒在目前尚不能培养的困难。将这些减毒的病毒(对于中晚期的SARS病毒来说，该病毒已经属于减毒形式)制备成疫苗，或优选使用其灭活形式制备疫苗，用于免疫动物，产生抗血清。这些抗血清能够和中晚期的SARS病毒结合产生中和反应，说明产生了保护性免疫力。
与感染人和动物宿主的中晚期病毒，例如TOR2和BJ01相比，本发明的早期GZ02减毒病毒表现出毒力显著减弱。减毒程度达到在大多数接受免疫的个体中仅出现轻微的感染症状，传染性非常小并能引发所需的免疫应答类型。
可用该SARS病毒来配制疫苗。为此，将减毒病毒调节到合适的浓度并用合适的疫苗佐剂、稀释剂或载体配制。可将生理学上可接受的介质用作载体。它们包括但不限于：合适的等渗液、磷酸盐缓冲液等等。
佐剂可用多种方法分类(Cox和Coulter，1997；Gupta和Siber，1995；Hughes和Babiuk，1994)。广义而言有两大类，颗粒状或非颗粒状佐剂。在颗粒状佐剂中有铝盐、钙盐、油包水乳液、水包油乳液、免疫刺激复合物(ISCOM)和ISCOM基质、脂质体、纳米和微米颗粒、蛋白质体、病毒颗粒、硬酯酰酪氨酸和-菊粉。非颗粒佐剂包括胞壁酰二肽(MDP)和衍生物(如苏氨酰MDP、胞壁肽等)、非离子嵌段共聚物、皂苷(如Quil A和QS21)、脂类A或其衍生物4′一磷酯酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖脂(TDM)、各种细胞因子(包括γ-干扰素和白细胞介素2或4)、糖类聚合物、衍生的多糖(如二乙基氨基乙基葡萄糖)等。现代佐剂制剂常常设计成各种成分的组合以产生最大的特异性免疫应答。
在本发明的一个实施方案中，使用减毒病毒或灭活疫苗制备疫苗组合物。减毒病毒可与冷冻防护添加剂或稳定剂混合，例如蛋白质(如白蛋白、明胶)、糖(如蔗糖、乳糖、山梨糖醇)、氨基酸(如谷氨酸钠)、盐水或其它保护剂。将这种混合物维持在液体状态，或然后干燥或冻干以便运输和保存，在使用前再临时与水混合。
包含本发明减毒病毒的制剂可以用来免疫人或动物，以诱导抵抗减毒病毒的相应野生型病毒感染的保护力。
为了激发免疫应答，必须给予个体以合适次数的足量疫苗。本领域熟练技术人员能容易地确定该用量和剂次。给药可以通过任一常规有效方式，例如皮下注射，鼻内、肠胃外、经口或局部施用于粘膜表面，例如通过气溶胶喷雾。较佳的给药方式是肠胃外给药。
在优选例中，可对早期SARS病毒进行进一步灭活后，制备灭活疫苗。目前对病毒灭活的方法有辐照、臭氧、甲醛灭活，高温灭活等。这些方法都是本领域技术人员熟知的。
此外，本发明还提供了用早期SARS全病毒制备抗SARS的抗体的方法。例如，可以用SARS全病毒免疫动物，然后获得抗血清。此外，还可将免疫动物的(如猴)的脾细胞与其它细胞融合，形成杂交瘤，从而制备SARS病毒的单克隆抗体。
为使更好地理解本发明，给出以下实施例。实施例只是为了描述本发明，不能将其理解成限制本发明的范围。
实施例
标准分子生物学技术按照Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryMannual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1989使用。
实施例1
用SARS早期病毒制备疫苗
本实施例使用的SARS早期病毒为GZ-02病毒株，其序列保藏在GenBank，登录号为AY39556。该病毒株购自中国疾病预防控制中心(CDC)。
该病毒株与TOR2相比，其核苷酸序列主要具有六个减毒突变：9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C。
在临床上，感染该病毒株的病人表现症状轻微。同时，传染力低。因此，该病毒具有作为减毒疫苗的良好特性。
将该病毒株在Vero中培养，取上清液，通过免疫亲和层析技术获得纯化的病毒。将其与常规的佐剂配制成疫苗。
实施例2
用SARS早期病毒疫苗免疫动物的评价
按照常规免疫方法用实施例1制备的疫苗免疫了恒河猴。
实验所采用的动物是恒河猴，恒河猴实验在哈尔滨畜牧兽医研究所进行。
将实施例1配制的疫苗静脉注射到恒河猴体内，注射次数和剂量由本领域技术人员按照常规而定。免疫过程中，恒河猴没有明显的病毒攻击症状，如发热、肺部感染、咳嗽等症状。免疫结束后，对每只恒河猴取血，血清分析抗体应答。用中晚期的病毒颗粒，例如TOR2和BJ-01病毒(购自中国疾病预防控制中心)作为包被抗原，以间接ELISA试验检测了能与它们结合的抗体。用蚀斑减少中和试验(PRNT)测试了中和抗体，测定与对照相比，导致蚀斑数量至少减少80％时的最高血清稀释度。
ELISA实验的结果表明，用GZ-02全病毒产生的抗血清能够和中晚期的TOR2和BJ-01病毒的S蛋白产生特异性结合。
蚀斑减少中和试验表明，大量的SARS中晚期病毒被中和。抗血清中抗SARS病毒抗体的滴度非常高。
用TOR2和BJ-01病毒攻击经免疫后的恒河猴，均无SARS感染症状。X光片检测未检测出肺部感染，基本上无发热、咳嗽症状。
从上述试验可见，用早期SARS病毒免疫恒河猴具有良好的免疫原性和安全性，能够产生高保护性免疫应答。
还用试验用果子狸进行了相同的实验，实验用果子狸也来自哈尔滨畜牧兽医研究所。获得了相同的实验结果。
因此，我们认为，用早期SARS病毒能够产生良好的免疫原性和安全性，以及高保护性免疫应答，有良好的应用前景。
序列表
<110>国家人类基因组南方研究中心
广东省疾病预防控制中心
<120>SARS冠状病毒全病毒疫苗
<130>040486
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>29751
<212>DNA
<213>SARS病毒(SARS virus)
<400>1
atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt 60
ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac 120
gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct 180
tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc 240
gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca 300
cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg 360
gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt 420
ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa 480
cgttctgatg ccttaagcac caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg 540
gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc 600
gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggt 660
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cccattgaag attatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc actccgtgaa 780
ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc 840
ccagatgggt accctcttga ttgcatcaaa gattttctcg cacgcgcggg caagtcaatg 900
tgcactcttt ccgaacaact tgattacatc gagtcgaaga gaggtgtcta ctgctgccgt 960
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tttgtgtttc ctcttaactc aaaagtcaaa gtcattcaac cacgtgttga aaagaaaaag 1140
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aacaatatgc acttgtctac cttgatgaaa tgtaatcatt gcgatgaagt ttcatggcag 1260
acgtgcgact ttctgaaagc cacttgtgaa cattgtggca ctgaaaattt agttattgaa 1320
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tcaggccata ctggcattac tggtgacaat gtggagacct tgaatgagga tctccttgag 1620
atactgagtc gtgaacgtgt taacattaac attgttggcg attttcattt gaatgaagag 1680
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agtcttgatt acaagtcttt caaaaccatt gttgagtcct gcggtaacta taaagttacc 1800
aagggaaagc ccgtaaaagg tgcttggaac attggacaac agagatcagt tttaacacca 1860
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gatgcagcaa accactcaat tcctgatttg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt 1980
atttctgaac agtcattacg tcttgtcgac gccatggttt atacttcaga cctgctcacc 2040
aacagtgtca ttattatggc atatgtaact ggtggtcttg tacaacagac ttctcagtgg 2100
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attgcagtca atgacaaagc tctttatgag caggttgtca tggattatct tgataacctg 3780
aagcctagag tggaagcacc taaacaagag gagccaccaa acacagaaga ttccaaaact 3840
gaggagaaat ctgtcgtaca gaagcctgtc gatgtgaagc caaaaattaa ggcctgcatt 3900
gatgaggtta ccacaacact ggaagaaact aagtttctta ccaataagtt actcttgttt 3960
gctgatatca atggtaagct ttaccatgat tctcagaaca tgcttagagg tgaagatatg 4020
tctttccttg agaaggatgc accttacatg gtaggtgatg ttatcactag tggtgatatc 4080
acttgtgttg taataccctc caaaaaggct ggtggcacta ctgagatgct ctcaagagct 4140
ttgaagaaag tgccagttga tgagtatata accacgtacc ctggacaagg atgtgctggt 4200
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gaaatgcttg ctcatgctga agagacaaga aaattaatgc ctatatgcat ggatgttaga 4380
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gactatggtg tccgattctt cttttatact agtaaagagc ctgtagcttc tattattacg 4500
aagctgaact ctctaaatga gccgcttgtc acaatgccaa ttggttatgt gacacatggt 4560
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tcaggacagc gtacagagtt aggtgttgaa tttcttaagc gtggtgacaa aattgtgtac 4800
cacactctgg agagccccgt cgagtttcat cttgacggtg aggttctttc acttgacaaa 4860
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ccaacatact tggatggtgc tgatgttaca aaaattaaac ctcatgtaaa tcatgagggt 5040
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cagtttaaaa gaccaatcaa ccctactgac cagtcatcgt atattgttga tagtgttgct 7680
gtgaaaaatg gcgcgcttca cctctacttt gacaaggctg gtcaaaagac ctatgagaga 7740
catccgctct cccattttgt caatttagac aatttgagag ctaacaacac taaaggttca 7800
ctgcctatta atgtcatagt ttttgatggc aagtccaaat gcgacgagtc tgcttctaag 7860
tctgcttctg tgtactacag tcagctgatg tgccaaccta ttctgttgct tgaccaagct 7920
cttgtatcag acgttggaga tagtactgaa gtttccgtta agatgtttga tgcttatgtc 7980
gacacctttt cagcaacttt tagtgttcct atggaaaaac ttaaggcact tgttgctaca 8040
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