技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及一种陶瓷基牙科骨粉及其制备方法。
背景技术
在牙科手术中，有很多种情况会造成患者在手术后产生骨缺损或者骨量不足，如牙周囊肿摘除后产生的骨缺损，牙齿拔出后牙槽嵴萎缩造成的骨量不足的情况。这些情况往往限制了患者术后的骨愈合，以及后续牙齿种植的效果，因此需要进行骨种植。目前解决的黄金方法主要是采用自体骨进行移植，但由于其来源有限，且供体部位存在一定的术后并发症，其应用受到了限制。异体骨移植存在潜在抗原性以及传播疾病的风险，因此，人工骨修复材料因其来源充足，可标准化生产，并且避免了不必要的疾病传播等风险，成为了众多学者的研究方向，并在临床也得到了广泛的应用，获得良好的治疗效果。
但发明人发现，目前常用的骨粉的成分大多为无机矿物材料，目的是为了和天然骨的性能更加接近，但是也存在着生物相容性差、亲水性差，无法为细胞的生长与增殖提供良好的环境的问题。
目前市面上使用效果最佳的牙科骨粉材料Bio-Oss为国外产品，价格昂贵，增加了患者的医疗成本。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对现有牙科骨粉生物相容性差、亲水性差，不利于细胞在骨粉材料上的粘附和增殖的问题，本发明提供了一种兼具良好的生物相容性和优异的亲水效果的陶瓷基牙科骨粉，改善骨修复效果，同时还具有较低的生产成本，便于临床应用。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种陶瓷基牙科骨粉，所述牙科骨粉的制备组分包含：
多孔羟基磷灰石；
I型胶原，质量为所述多孔羟基磷灰石质量的1％～10％；
其中，所述多孔羟基磷灰石的制备组分包含羟基磷灰石、第一PMMA颗粒和第二PMMA颗粒，质量比为5：(2.5～3.5)：(1.5～2.5)，且第一PMMA颗粒的粒径为50～100μm，第二PMMA颗粒的粒径为500～1000μm；和
所述多孔羟基磷灰石通过烧结制备而成，所述烧结包括如下阶段：
第一阶段：升温速率为5～10℃/min，目标温度为500～600℃，恒温时间为20～30min；
第二阶段：升温速率为5～10℃/min，目标温度为1200～1500℃，恒温时间为200～300min；
第三阶段：停止加热，自然降温。
优选地，所述多孔羟基磷灰石具有连通的孔；和
所述多孔羟基磷灰石为：能过20目筛的颗粒，优选地，所述多孔羟基磷灰石为：能过20目筛，且被60目筛截留的颗粒。
优选地，所述多孔羟基磷灰石的制备方法包括：
(a)配制羟基磷灰石悬浊液；
(b)将第一PMMA颗粒和第二PMMA颗粒加至所述羟基磷灰石悬浊液中，制得烧结基液；
(c)将所述烧结基液置于烧结设备中进行烧结，制得烧结材料；
(d)将所述烧结材料进行粉碎和筛分，制得所述多孔羟基磷灰石。
优选地，所述步骤(a)按照如下方法进行：
将15～20g羟基磷灰石分批次和20～35mL PBS溶液混合，再加入1.5～2.5mL浓度为0.05～0.1g/mL的聚乙烯醇溶液，搅拌均匀，配制得到所述羟基磷灰石悬浊液。
优选地，所述聚乙烯醇溶液按照如下方法进行配制：
将聚乙烯醇和纯化水混合，然后将含有聚乙烯醇和纯化水的容器放到水浴装置中，边加热边搅拌，待容器中的溶液变得透明、无分层、无结块，即得到所述聚乙烯醇溶液。
更优选地，所述水浴的温度设置为80～95℃。
本发明还提供了一种上述牙科骨粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)共混：将所述多孔羟基磷灰石和所述I型胶原与PBS溶液混合并搅拌均匀，得到混合液；
(2)灌模：将所述混合液灌入模具中；
(3)冻干：将所述模具冻干；
(4)粉碎：将冻干后的材料粉碎；
(5)筛分：将经粉碎后得到的颗粒筛分，得到陶瓷基牙科骨粉。
优选地，步骤(3)中，所述冻干包括如下步骤：
将所述模具放入冻干机中，经预冻、第一升华、第二升华和降温四个阶段后，即完成所述冻干；其中，所述第一升华和所述第二升华阶段抽真空，真空度为低于-0.05MPa，掺气50～120Pa；和
所述预冻按照如下方式进行：降温速率为2.0～5.0℃/min，目标温度为-15～-30℃，恒温时间为200～350min；
所述第一升华包括如下4个温度梯度：
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为-15～-10℃，恒温时间为200～300min；
升温速率为0.3～0.5℃/min，目标温度为-10～-5℃，恒温时间为200～300min；
升温速率为0.2～0.3℃/min，目标温度为-5～-2℃，恒温时间为100～200min；
升温速率为0.1～0.2℃/min，目标温度为-2～0℃，恒温时间为100～200min；
所述第二升华包括如下5个温度梯度：
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为10～20℃，恒温时间为60～150min；
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为20～30℃，恒温时间为60～150min；
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为30～40℃，恒温时间为60～150min；
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为40～50℃，恒温时间为60～150min；
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为50～60℃，每隔1h进行终点判断，直至合格；终点≤0.9Pa/10min；
所述降温按照如下方式进行：降温速率为2～5℃/min，直至前箱温度达到20～25℃。
优选地，步骤(5)中，所述筛分按照如下方法进行：
将经所述粉碎处理后得到的颗粒先过20目筛，筛过的颗粒再过60目筛，被60目筛截留的颗粒即为陶瓷基牙科骨粉；和
将被20目筛截留的颗粒送回所述粉碎步骤。
优选地，步骤(2)中，灌模的厚度不超过11mm，优选为5～10mm。
优选地，步骤(1)中，当所述I型胶原以g计，所述PBS溶液以mL计时，所述I型胶原和所述PBS溶液的用量比为1：(25～45)。
(三)有益效果
本发明的上述技术方案具有如下优点：
(1)选择了两种不同粒径的PMMA颗粒对羟基磷灰石进行烧结造孔，使得多孔羟基磷灰石具有较大的表面积和粗糙度，既有利于生物组织的附着并深入孔中，也提高了产品的吸水性能，有利于医生进行操作；保证了产品的支撑强度，同时模拟骨组织的三维支架结构，为骨细胞的长入提供充足的空间。添加了I型胶原作为有机相，提高生物活性，促进骨代谢与增殖。
(2)本发明提供的牙科骨粉生产成本低，制备方法简单，便于大规模生产。
附图说明
图1是陶瓷基牙科骨粉在某一方向上SEM图；
图2是陶瓷基牙科骨粉在另一方向上的SEM图；
图3是术中图片，其中A图、B图显示制备的骨缺损，C图填入的是陶瓷基牙科粉，D图填入的是Bio-Oss骨粉；
图4是术后12周CBCT图，其中A图代表A1组，B图代表B1组，C图代表B2组，D图代表A2组；
图5a和图5b是术后12周Goldner三色染色显微镜下图片(×10)，其中图5a为A1组，图5b为B1组；
图6术后12周Goldner三色染色显微镜下图片(×1.25)，其中A图至D图分别为A1组、B1组、B2组、A2组。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
第一，本发明提供了一种陶瓷基牙科骨粉，所述牙科骨粉的制备组分包含：
多孔羟基磷灰石；
I型胶原，质量为所述多孔羟基磷灰石质量的1％～10％，例如，可以具体为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％；
其中，所述多孔羟基磷灰石的制备组分包含羟基磷灰石、第一PMMA颗粒和第二PMMA颗粒，质量比为5：(2.5～3.5)：(1.5～2.5)，且第一PMMA颗粒的粒径为50～100μm，例如，可以为50μm，60μm，70μm，80μm，90μm，100μm，或者，为上述粒径的任意组合；
第二PMMA颗粒的粒径为500～1000μm，例如，可以为500μm，600μm，700μm，800μm，900μm，1000μm，或者，为上述粒径的任意组合；和
所述多孔羟基磷灰石通过烧结制备而成，所述烧结包括如下阶段：
第一阶段：升温速率为5～10℃/min，目标温度为500～600℃，恒温时间为20～30min；
第二阶段：升温速率为5～10℃/min，目标温度为1200～1500℃，例如，可以为1200℃，1300℃，1400℃，1500℃，恒温时间为200～300min；
第三阶段：停止加热，自然降温。
第一PMMA颗粒的粒径较小，可以提供支架微孔，增加孔隙率。而第二PMMA颗粒的粒径较大，可以提供支架孔道结构。PMMA颗粒用量过多，则会造成烧结后的羟基磷灰石结构不连续，易出现掉粉，不成型的现象，不具有所需的力学结构和力学强度。用量过少，则无法提供有效的支架和孔隙结构。
I型胶原用量也对材料的性能有影响。用量过多会将羟基磷灰石完全包裹住，形成絮状产物，不易粉碎加工，且羟基磷灰石无法发生作用。用量过少则产品吸水性差，遇水分散，非常不利于临床使用。
在一些实施例中，所述多孔羟基磷灰石具有连通的孔；和
所述多孔羟基磷灰石为：能过20目筛的颗粒，优选地，所述多孔羟基磷灰石为：能过20目筛，且被60目筛截留的颗粒。
在一些实施例中，所述多孔羟基磷灰石的制备方法包括：
(a)配制羟基磷灰石悬浊液；
(b)将第一PMMA颗粒和第二PMMA颗粒加至所述羟基磷灰石悬浊液中，制得烧结基液；
(c)将所述烧结基液置于烧结设备中进行烧结，制得烧结材料；
(d)将所述烧结材料进行粉碎和筛分，制得所述多孔羟基磷灰石。
优选地，所述步骤(a)按照如下方法进行：
将15～20g羟基磷灰石分批次(例如，可以将羟基磷灰石均分为3～10份，从而将羟基磷灰石分3～10次进行加料)和20～35mL PBS溶液混合，再加入1.5～2.5mL浓度为0.05～0.1g/mL的聚乙烯醇溶液，搅拌均匀，配制得到所述羟基磷灰石悬浊液。此处的PBS溶液为常用的磷酸盐缓冲溶液，pH为7.0～7.4，浓度为10M。
优选地，所述聚乙烯醇溶液按照如下方法进行配制：
将聚乙烯醇和纯化水混合，然后将含有聚乙烯醇和纯化水的容器放到水浴装置中，边加热边搅拌，待容器中的溶液变得透明、无分层、无结块，即得到所述聚乙烯醇溶液。更优选地，所述水浴的温度设置为80～95℃。
本发明还提供了一种上述牙科骨粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)共混：将所述多孔羟基磷灰石和所述I型胶原与PBS溶液混合并搅拌均匀，得到混合液；
(2)灌模：将所述混合液灌入模具中；
(3)冻干：将所述模具冻干；
(4)粉碎：将冻干后的材料粉碎；和
(5)筛分：将经粉碎后得到的颗粒筛分，得到陶瓷基牙科骨粉。
在一些实施例中，步骤(3)中，所述冻干包括如下步骤：
将所述模具放入冻干机中，经预冻、第一升华、第二升华和降温四个阶段后，即完成所述冻干；其中，所述第一升华和所述第二升华阶段抽真空，真空度低于-0.05MPa，掺气50～120Pa；和
所述预冻按照如下方式进行：降温速率为2.0～5.0℃/min，目标温度为-15～-30℃，恒温时间为200～350min；
所述第一升华包括如下4个温度梯度：
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为-15～-10℃，恒温时间为200～300min；
升温速率为0.3～0.5℃/min，目标温度为-10～-5℃，恒温时间为200～300min；
升温速率为0.2～0.3℃/min，目标温度为-5～-2℃，恒温时间为100～200min；
升温速率为0.1～0.2℃/min，目标温度为-2～0℃，恒温时间为100～200min；
所述第二升华包括如下5个温度梯度：
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为10～20℃，恒温时间为60～150min；
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为20～30℃，恒温时间为60～150min；
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为30～40℃，恒温时间为60～150min；
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为40～50℃，恒温时间为60～150min；
升温速率为0.5～1℃/min，目标温度为50～60℃，每隔1h进行终点判断，直至合格；终点≤0.9Pa/10min；
所述降温按照如下方式进行：降温速率为2～5℃/min，直至前箱温度达到20～25℃。
在一些实施例中，步骤(5)中，所述筛分按照如下方法进行：
将经所述粉碎处理后得到的颗粒先过20目筛，筛过的颗粒再过60目筛，被60目筛截留的颗粒即为陶瓷基牙科骨粉；和
将被20目筛截留的颗粒送回所述粉碎步骤。
优选地，步骤(2)中，灌模的厚度不超过11mm，优选为5～10mm。
优选地，步骤(1)中，当所述I型胶原以g计，所述PBS溶液以mL计时，所述I型胶原和所述PBS溶液的用量比为1：(25～45)。
以下是本发明列举的几个实施例。
实施例1
一种陶瓷基牙科骨粉，其制备组分包含：
多孔羟基磷灰石；
I型胶原，质量为多孔羟基磷灰石质量的1％；
其中，多孔羟基磷灰石的制备组分包含羟基磷灰石、第一PMMA颗粒和第二PMMA颗粒，质量比为5：2.5：1.5，且第一PMMA颗粒的粒径为50μm，第二PMMA颗粒的粒径为500μm；和
多孔羟基磷灰石通过烧结制备而成，烧结过程如表1所示
表1
实施例2
一种陶瓷基牙科骨粉，其制备组分包含：
多孔羟基磷灰石；
I型胶原，质量为多孔羟基磷灰石质量的10％；
其中，多孔羟基磷灰石的制备组分包含羟基磷灰石、第一PMMA颗粒和第二PMMA颗粒，质量比为5：3.5：2.5，且第一PMMA颗粒的粒径为100μm，第二PMMA颗粒的粒径为1000μm；和
多孔羟基磷灰石通过烧结制备而成，烧结过程如表2所示：
表2
实施例3
一种陶瓷基牙科骨粉，其制备组分包含：
多孔羟基磷灰石；
I型胶原，质量为多孔羟基磷灰石质量的5％；
其中，多孔羟基磷灰石的制备组分包含羟基磷灰石、第一PMMA颗粒和第二PMMA颗粒，质量比为5：3：2，且第一PMMA颗粒的粒径为70μm，第二PMMA颗粒的粒径为600μm；和
多孔羟基磷灰石通过烧结制备而成，具体制备方法包括如下步骤：
(a)配制羟基磷灰石悬浊液：
称量1g聚乙烯醇，放入锥形瓶中，再加入10mL纯化水，将锥形瓶放入水浴锅中加热溶解，水浴温度设置为80℃，并同时进行搅拌，待锥形瓶中的溶液变得均匀透明、无结块、无分层，即得到聚乙烯醇溶液。
在烧杯中加入20mL pH7.0的PBS溶液，将15g羟基磷灰石分批次加入烧杯中，再加入1.5mL聚乙烯醇溶液，并同时开启磁力搅拌，搅拌均匀即得粘度适中的羟基磷灰石悬浊液。随着羟基磷灰石的不断加入，体系的粘度变得越来越大，因此，为了能够搅拌均匀，可以不断改变磁子在烧杯中的位置。
在该步骤中，羟基磷灰石和溶剂PBS溶液的用量比影响羟基磷灰石悬浊液的粘度。适宜的粘度能够确保后续添加的PMMA微粒能均匀分布在悬浊液中，不会沉底。基于上述考虑，羟基磷灰石的适宜用量为15～20g，且PBS溶液的适宜用量为20～35mL。本实施例中，羟基磷灰石的用量为15g，PBS溶液的用量为20mL。
(b)将第一PMMA颗粒和第二PMMA颗粒加至羟基磷灰石悬浊液中，搅拌均匀，制得烧结基液；
(c)将所述烧结基液转移至坩埚中，置于烧结炉中进行烧结，得到烧结材料。其中，烧结过程如表3所示：
表3
当烧结炉的温度降至室温时，打开炉门，将得到的烧结材料转移到洁净间，转移过程中不应打开坩埚盖。
(d)将所述烧结材料放入小型粉碎机粉碎，将粉碎颗粒用振动筛或不锈钢筛进行筛分，上层筛的目数为20目，下层筛的目数为60目；收集被60目筛子截留的颗粒，即为多孔羟基磷灰石。
被20目截留的颗粒再次粉碎。
由上述方法制得的多孔羟基磷灰石具有连通的孔，且为：能过20目筛，且被60目筛截留的颗粒。
实施例4
将实施例3所提供的制备组分制备成陶瓷基牙科骨粉，制备方法包括如下步骤：
(1)共混：将50g多孔羟基磷灰石和5g I型胶原与45mL pH7.0的PBS溶液混合并搅拌均匀，得到混合液。
(2)灌模：将所述混合液灌入模具中，灌模过程中无需用水循环泵抽真空排出气泡，选择玻璃/不锈钢/PTFE模具灌模，根据模具大小进行刮平，灌模厚度为10mm。
(3)冻干：
将所述模具放入冻干机中，经预冻、第一升华、第二升华和降温四个阶段后，即完成所述冻干；其中，所述第一升华和所述第二升华阶段抽真空，真空度低于-0.05MPa，掺气50～120Pa。
其中，四个阶段的参数设置如表4所示。
表4
(4)粉碎：将冻干后的材料放入小型粉碎机中粉碎；和
(5)筛分：将经粉碎后得到的颗粒用振动筛或者不锈钢筛筛分，先用20目筛进行筛分，再用60目筛进行截留，收集被60目筛截留的颗粒，即为陶瓷基牙科骨粉。
被20目截留的颗粒返回至粉碎步骤。
实施例5
将实施例3所提供的制备组分制备成陶瓷基牙科骨粉，制备方法同实施例4基本上相同，不同之处在于：
在步骤(3)中，四个阶段的参数设置如表5所示。
表5
(一)陶瓷基牙科骨粉形貌检测
从图1和图2中可以看出，陶瓷基牙科骨粉具有较大的表面积和粗糙度，从而有利于生物组织的附着和深入，也可以提高骨粉的吸水性能。
(二)应用效果检测
试验方案：
动物模型：2只13个月小型猪，拔出四个象限内的第二磨牙修整骨缺损，使近远中骨形态尽量一致；
试验材料：陶瓷基牙科骨粉、Bio-Oss骨粉、Bio-gide膜。
试验分组：陶瓷基牙科骨粉+Bio-gide膜为A组，Bio-Oss骨粉+Bio-gide膜为B组，A组包括上颌A1组(n＝2，A11、A12)和下颌A2组(n＝3，A21、A22、A23)，B组包括上颌B1组(n＝1)和下颌B2组(n＝1)。空白组(n＝1)为上颌骨缺损不做任何处理。
手术过程：(1)术前12h禁食、水，耳后肌肉注射氯胺酮0.2ml/kg，和速眠0.10ml/kg；(2)左侧卧位，口周及口内消毒、铺巾，置开口器；(3)在第一前磨牙的远中及第三前磨牙的近中切开牙龈，翻开梯形瓣，分龈、铤松牙齿，完整拔出4个象限内的第二前磨牙；(4)在拔牙区颊侧用电机磨出10mm×10mm×5mm大小的骨缺损，按照分组分别填入Bio-Oss骨粉或陶瓷基牙科骨粉，再覆盖Bio-Gide胶原膜，分层严密缝合黏膜，如图3所示；(5)术后注射青霉素钠3d，每天1次，每次40万U。
试验结果：
(1)大体观察结果：所有缺损区均为黏膜组织所覆盖，各组骨缺损区创口愈合良好，无感染。
(2)影像学观察结果：术后12周用16层螺旋CT(德国Siemens，型号Somatom 16)扫描动物术区，A1组，缺损区牙槽嵴顶端欠连续，有部分材料自缺损区脱落，单缺损区基本被新生骨填满；B1组缺损区基本被新生骨填满，新生骨与周围骨质可见界限；A2和B2组缺损区均被新生骨填满，新生骨与自体骨基本完成了连接，密度无显著差异。各组骨缺损区可见新生骨，牙槽嵴高度恢复，牙槽嵴可见连续皮质骨(如图4所示)。通过医用图像分析软件Image-pro Plus 6.0计算骨缺损区新生骨累计光密度值(IOD),反应不同组缺损区新生骨密度变化，结果为A1：21.73±2.23；A2:20.28±1.31；B1:22.02±0.51，B2:20.56±1.08；空白为16.66±1.04。统计学分析显示，陶瓷基牙科骨粉与Bio-Oss骨粉修复上颌骨和下颌骨缺损，在形成新骨密度上午明显差异，各组与空白对照对比，均有显著差异。
(3)组织学观察结果：进行标本取材，包埋、切片，进行Goldner三色染色和亚甲基蓝染色，光学显微镜下观察新骨生成情况。多功能显微镜下观察Goldner三色法染色的薄切片，类骨质、新矿化骨和成熟骨分界明显，新矿化骨和类骨质内哈弗系统不明显，骨缺损区中的空腔为未吸收的骨材料。A、B组新生骨量无明显差异。从上颌骨(图5a和图5b)和下颌骨(图6)看出，下颌骨成骨效果较上颌骨好。
(4)统计学分析：应用医用图像分析软件Imagepro P1us6.0对各组骨缺损区的新生骨区面积与未成骨区面积对比，对各组成骨量进行大体对比，如表6所示。添加骨粉组均较空白组成骨量多，下颌骨的成骨面积比上颌骨明显，B组较A组骨缺损区成骨面积大，但不明显。
表6各组骨缺损区新生骨区面积与未成骨区面积对比
根据应用效果监测的试验结果可以看出，本发明提供的陶瓷基牙科骨粉在修复拔牙区骨缺损的效果与目前市面上效果最好的骨粉材料Bio-oss无明显差别。但是，本发明提供的骨粉材料的成本却远远低于Bio-oss，制备方法也简单。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。