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1、(10)授权公告号 CN 101632841 B (45)授权公告日 2012.10.03 CN 101632841 B *CN101632841B* (21)申请号 200910042066.6 (22)申请日 2009.08.21 A61L 27/26(2006.01) A61L 27/54(2006.01) A61L 27/56(2006.01) A61L 27/58(2006.01) A61L 27/24(2006.01) A61L 27/22(2006.01) A61L 27/20(2006.01) A61L 27/16(2006.01) (73)专利权人 暨南大学 地址 51063。
2、2 广东省广州市黄埔大道西 601 号 (72)发明人 李沁华 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 裘晖 陈燕娴 CN 101380486 A,2009.03.11, 权利要求 1-10、 实施例 1-6. CN 101507835 A,2009.08.19, 权利要求 4. CN 1732900 A,2006.02.15, 权利要求 9. WO 2008/067655 A1,2008.06.12, 说明书第 2 页第 26 行至第 3 页第 16 行 . 李沁华等 . 聚乙烯醇 - 透明质酸 - 胶原组 织工程支架研究 .暨南大学学报 （自然科学 版）。
3、 .2009, 第 30 卷 ( 第 3 期 ),319-324. 余啟聪等 . 聚乙烯醇 - 海藻酸钙 - 透明 质酸复合水凝胶材料的含水特性 .中国组织 工程研究与临床康复 .2008, 第 12 卷 ( 第 23 期 ),4445-4449. (54) 发明名称 含海藻酸盐、 糖胺聚糖和胶原的组织工程支 架及其制备方法 (57) 摘要 本发明属于组织工程支架的技术领域， 具体 提供了一种含海藻酸盐、 糖胺聚糖和胶原的组织 工程支架及其制备方法。本发明提供的组织工 程支架主要由以下质量配比的原料制成 ： 包括 5 30壳聚糖， 5 30胶原， 5 30海藻酸 盐， 0.1 3透明质酸， 0。
4、.01 0.05交联剂， 0.1 3硫酸软骨素， 5 20聚乙烯醇和三蒸 水。作为优选， 还包括适量细胞生长因子、 纤维连 接蛋白和层粘连蛋白。本发明的组织工程支架可 加工塑形， 制备不同形态和厚度的制品， 成型方法 易操作， 原材料易得不贵， 能进行规模产业化生 产。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 黄学光 权利要求书 2 页 说明书 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 10 页 1/2 页 2 1. 一种含海藻酸盐、 糖胺聚糖和胶原的组织工程支架， 其特征在于主要由以下重量配 比的原料组分的制成 ： 余量为三蒸水。。
5、 2. 根据权利要求 1 所述含海藻酸盐、 糖胺聚糖和胶原的组织工程支架， 其特征在于 ： 还 包括细胞生长因子、 纤维连接蛋白和层粘连蛋白， 它们在原料组份混合物中的质量浓度分 别为 ： 5ng/ml 130ng/ml、 1ng/ml 120ng/ml 和 1ng/ml 120ng/ml。 3. 根据权利要求 2 所述含海藻酸盐、 糖胺聚糖和胶原的组织工程支架， 其特征在于 ： 所 述细胞生长因子为成纤维细胞生长因子、 表皮生长因子、 骨形成蛋白、 血管内皮生长因子中 的任一种或是两种以上的混合物。 4. 根据权利要求 1 3 中任一项所述含海藻酸盐、 糖胺聚糖和胶原的组织工程支架， 其特征。
6、在于 ： 所述聚乙烯醇的分子量为10000100000 ； 所述壳聚糖的分子量为100000 1000000， 脱乙酰度 65% 100%。 5. 权利要求 1 所述含海藻酸盐、 糖胺聚糖和胶原的组织工程支架的制备方法， 其特征 在于包括以下具体步骤 ： （1） 将所述配比的壳聚糖和胶原分别溶于 4pH6 的盐酸溶液或醋酸溶液， 所述配比 的硫酸软骨素、 透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水 ； 所述配比的聚乙烯醇溶于 85 100三蒸水 ； （2） 将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入硫酸软骨素、 透明质酸、 聚乙烯 醇和海藻酸盐混合液中， 添加余量三蒸水， 在室温下搅拌 1 2。
7、hr， 加入所述配比的生物蛋 白交联剂， 使各组份充分混合均匀 ； （3） 将混合液注入模具中， 35 45烘干或置于 -20 -100冷冻干燥机冻干 ； （4） 将干燥制品浸泡于 5 10% 氢氧化钠溶液中和酸性， 三蒸水浸泡清洗获得产品。 6.权利要求2或3所述含海藻酸盐、 糖胺聚糖和胶原的组织工程支架的制备方法， 其特 征在于 ： （1） 将所述配比的壳聚糖和胶原分别溶于 4pH6 的盐酸溶液或醋酸溶液， 所述配比 的硫酸软骨素、 透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水 ； 所述配比的聚乙烯醇溶于 85 100三蒸水 ； （2） 将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入硫酸软骨素、。
8、 透明质酸、 聚乙烯 醇和海藻酸盐混合液中， 添加余量三蒸水， 在室温下搅拌 1 2hr， 加入所述配比的生物蛋 白交联剂， 使各组份充分混合均匀 ； 在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子， 纤维连 权 利 要 求 书 CN 101632841 B 2 2/2 页 3 接蛋白、 层粘连蛋白， 搅拌 0.5 1hr ； （3） 将混合液注入模具中， 35 45烘干或置于 -20 -100冷冻干燥机冻干 ； （4） 将干燥制品浸泡于 5 10% 氢氧化钠溶液中和酸性， 三蒸水浸泡清洗获得产品。 7. 权利要求 4 所述含海藻酸盐、 糖胺聚糖和胶原的组织工程支架的制备方法， 其特征 在于 ： （。
9、1） 将所述配比的壳聚糖和胶原分别溶于 4pH6 的盐酸溶液或醋酸溶液， 所述配比 的硫酸软骨素、 透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水 ； 所述配比的聚乙烯醇溶于 85 100三蒸水 ； （2） 将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入硫酸软骨素、 透明质酸、 聚乙烯 醇和海藻酸盐混合液中， 添加余量三蒸水， 在室温下搅拌 1 2hr， 加入所述配比的生物蛋 白交联剂， 使各组份充分混合均匀 ； 在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子， 纤维连 接蛋白、 层粘连蛋白， 搅拌 0.5 1hr ； （3） 将混合液注入模具中， 35 45烘干或置于 -20 -100冷冻干燥机冻干 ； 。
10、（4） 将干燥制品浸泡于 5 10% 氢氧化钠溶液中和酸性， 三蒸水浸泡清洗获得产品。 权 利 要 求 书 CN 101632841 B 3 1/10 页 4 含海藻酸盐、 糖胺聚糖和胶原的组织工程支架及其制备方 法 技术领域 0001 本发明涉及组织工程支架材料， 具体涉及一种含海藻酸盐、 糖胺聚糖和胶原的组 织工程支架及其制备方法。 背景技术 0002 组织器官由于意外事故、 疾病、 遗传及衰老等导致的缺损或功能丧失， 是影响人类 寿命和生存质量的首要问题。当人体某一部位的组织器官受到创伤， 医学临床上可采用的 治疗方法是自体移植、 同种异体移植或异种移植。但是， 这些方法存在供体不足、 。
11、免疫排斥 反应、 手术费用高等缺点。 大量患者因缺乏合适的供体和有效的器官替代物， 得不到医治而 死亡。 因此， 如何实现受损组织器官的修复与再生， 如何实现其功能的恢复一直是临床医学 亟待解决的难题， 组织工程技术的兴起和发展为其开辟了新的治疗前景。 0003 组织工程的基本要素包括种子细胞、 支架材料以及细胞生长因子。 0004 组织工程支架是种子细胞粘附、 生长和迁移的载体， 不但起着决定新生组织或器 官形状大小的作用， 更重要的是为细胞增殖提供营养、 进行气体交换、 排除废物的场所。生 长因子对细胞增殖以及组织或器官的修复和再生都有重要的促进作用， 可以诱导和刺激细 胞增殖、 维持细胞。
12、存活等。在组织工程中， 多孔支架起到细胞外基质的作用， 是对细胞外基 质的结构和功能的仿生。 0005 理想的组织工程多孔支架必须满足以下要求 ： 0006 (1) 良好的生物相容性， 无明显的细胞毒性、 炎症反应和免疫排斥反应 ； 0007 (2) 可控的生物降解与吸收性， 降解与吸收速率应与细胞或组织生长速率相适 应 ； 0008 (3) 合适的孔尺寸、 高孔隙率 ( 90 ) 和相互贯通的孔形态， 以利于细胞的种 植、 粘附与迁移 ； 0009 (4) 可塑的三维外形， 以获得所需要的组织或器官形状 ； 0010 (5) 高的表面积和合适的表面理化性质， 有利于细胞粘附、 增殖和分化以及。
13、负载生 长因子等生物信号分子 ； 0011 (6) 一定的机械强度， 在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性， 并为植 入细胞提供合适的微应力环境。 0012 目前， 国内外研究制备的组织工程支架普遍存在组分配比单一， 应用范围小， 降解 和吸收速度的可控性差， 在支架中不能形成三维立体贯通多孔结构， 不能根据相应的细胞 类型调节孔的尺寸、 体积和密度， 不能全方位的满足组织工程支架综合性能的要求， 难以适 合多种组织器官细胞的生长繁殖， 不能加工塑形， 制备不同形态和厚度的制品。 发明内容 0013 针对现有技术的缺点与不足， 本发明的首要目的在于提供一种含海藻酸盐、 糖胺 说 明 书。
14、 CN 101632841 B 4 2/10 页 5 聚糖和胶原的组织工程支架。 0014 本发明的另一目的在于提供一种简单且易于工业化生产的上述组织工程支架的 制备方法。 0015 本发明的目的通过以下的技术方案实现 ： 一种组织工程支架， 主要由以下重量配 比的原料组分的制成 ： 0016 壳聚糖 5 30 0017 胶原 5 30 0018 海藻酸盐 5 30 0019 透明质酸 0.1 3 0020 生物蛋白交联剂 0.01 0.1 0021 硫酸软骨素 0.1 3 0022 聚乙烯醇 5 20 0023 余量为三蒸水。 0024 为使本发明具有更好的性能 ： 0025 组份中还包括细。
15、胞生长因子、 纤维连接蛋白和层粘连蛋白， 它们在原料混合物中 的最终质量浓度分别为 ： 5ng/ml 130ng/ml、 1ng/ml 120ng/ml 和 1ng/ml 120ng/ml ； 所述的质量浓度为细胞生长因子、 纤维连接蛋白和层粘连蛋白的质量与其余组分组成的反 应混合物的体积的比例。 0026 其中细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子 (bFGF)、 转化生长因子 (TGF-1)、 骨形成蛋白(BMPs)、 血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)或是它们当中两种或 两种以上的混合物。 0027 另外， 上述组分中 ： 聚乙烯醇的分子量优选10000100000 ； 壳。
16、聚糖的分子量优选 100000 1000000， 脱乙酰度 65 100。 0028 所述的海藻酸盐通常使用海藻酸钠 ； 生物蛋白交联剂可用本领域公知的具有胶原 交联作用的交联剂， 如炭二亚胺等。 0029 本发明还提供上述组织工程支架的制备方法 ： 具体包括以下步骤 ： 0030 (1) 将所述配比的壳聚糖和胶原分别溶于 4 pH 6 的盐酸溶液或醋酸溶液， 所 述配比的硫酸软骨素、 透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水 ； 所述配比的聚乙烯 醇溶于 85 100三蒸水 ； 0031 (2) 将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入硫酸软骨素、 透明质酸、 聚 乙烯醇和海藻酸盐混合液。
17、中， 添加余量三蒸水， 在室温下搅拌 1 2hr， 使各组份充分混合 均匀 ； 0032 (3) 将混合液注入模具中， 35 45烘干或置于 -20 -100冷冻干燥机冻干 ； 0033 (4) 将干燥制品浸泡于 1 10氯化钙溶液中， 使组分中的直链海藻酸钠转变为 网状交联的海藻酸钙， 然后用 5 10氢氧化钠溶液中和酸性， 三蒸水浸泡清洗获得产品。 0034 该方法中， 所述步骤 (2) 中还可加入细胞生长因子、 纤维连接蛋白和层粘连蛋白， 使它们在原料组份混合物中的质量浓度分别为 ： 5ng/ml 130ng/ml、 1ng/ml 120ng/ml 和1ng/ml120ng/ml ； 所。
18、述细胞生长因子优选为成纤维细胞生长因子bFGF、 表皮生长因子 TGF-1、 骨形成蛋白BMPs、 血管内皮生长因子VEGF和表皮生长因子EGF中的任一种或是两 说 明 书 CN 101632841 B 5 3/10 页 6 种以上的混合物 ； 聚乙烯醇的分子量优选10000100000 ； 壳聚糖的分子量优选100000 1000000， 脱乙酰度 65 100。 0035 细胞生长因子、 纤维连接蛋白和层粘连蛋白优选的加入方法是 ： 在原步骤 (2) 得 到的混合液中， 在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子， 纤维连接蛋白、 层粘连蛋 白， 搅拌 0.5 1hr。 0036 本发明的作。
19、用原理为 ： 0037 糖胺聚糖 (GAG) 广泛存在于人和动物的软骨、 肌腱、 韧带、 角膜和血管壁等组织 中， 各类胶原纤维、 细胞膜、 胞外纤维、 和弹性蛋白纤维周围的无定形基质等都含有 GAG， 所 以 GAG 在体内具有广泛而重要的作用。由于 GAG 是多聚阴离子聚糖， 可以吸引阳离子和水 分子而形成凝胶， 赋予组织弹性和韧性， 对关节具有润滑作用。 0038 GAG 多为己糖醛酸和己糖胺交替出现的长链多聚物， 其重复单元结构如下 ： 0039 R、 R H 或 SO3H 0040 根据两主要组分的差异、 硫酸化的程度和位置不同分为透明质酸、 硫酸软骨素、 硫 酸角质素、 肝素、 甲。
20、壳素及其脱乙酰衍生物壳聚糖等。GAG 对软骨细胞、 成纤维细胞、 角膜内 皮细胞的粘附、 生长增殖均有优良的作用， 并且可以调节细胞粘附， 所以作为天然生物材料 的 GAG 具有良好的细胞亲和性。 0041 胶原是哺乳动物体内结缔组织的主要成分， 属于细胞外基质 (ECM) 的结构蛋白 质， 约占哺乳动物总蛋白的 1/3， 结缔组织的强度和韧性主要依靠它来维持， 它具有支撑器 官和保护肌体的功能， 也是组成细胞间质的最重要功能蛋白质。其中 I 型胶原占生物体总 胶原量的 90， 普遍分布于肌体的各部分， 主要为皮肤、 肌腱、 韧带、 软骨及骨等组织或器官 中， 具有很强的抗张能力， 胶原在组织。
21、工程中因具有好的生物相容性与生物降解性、 无抗原 性、 能促进细胞生长等优点， 被广泛用于生物可降解缝线、 人造皮肤、 伤口敷料、 人造腱及血 管等方面。 0042 但是， 由于胶原在体内降解速度快、 机械性能较差， 胶原干燥后质地脆， 难以成膜 等缺点， 使其作为细胞支架的功能受到限制。因此， 可以通过物理、 化学交联和复合其他材 料等方法来提高胶原的机械性能和改善其降解速度。物理交联不引入毒性物质， 但不能获 得均一、 理想的交联强度。 化学交联虽然可以得到均一、 理想的交联强度， 但常用甲醛、 戊二 醛等作为交联剂， 对组织细胞的培养易引起不良反应。 所以， 采用无毒医用生物交联剂和聚 。
22、乙烯醇补强剂， 可以改善胶原的机械强度和降解速度。 0043 海藻酸盐 (ALGNa) 是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种多糖碳水化合物， 是美国食品药品管理局 (FDA) 批准用于生物医学领域的天然生物材料之一。是由 1， 4- 聚 -D- 甘露糖醛酸和 a-L- 古罗糖醛酸组成的一种线型聚合物， 是海藻酸衍生物中的 一种， 其分子链上含有大量的羟基和羧基。海藻酸钠用二价 Ca 离子作为交联剂， 可形成交 联的海藻酸钙聚合物， 具有好的亲水性， 营养物质易于渗透扩散， 海藻酸钙为表面光滑柔韧 和顺应性较好的半透明状生物膜， 是一种理想的膜引导组织再生材料， 它具有可降解性且 膜降解时间与组。
23、织再生时间同步 ； 具有微孔结构或体液通透性， 生物相容性优良， 无毒性和 说 明 书 CN 101632841 B 6 4/10 页 7 过敏性反应 ； 海藻酸盐有着广泛的应用， 如人工软骨材料、 药物缓释系统、 人工细胞微囊化、 抗凝血型材料等方面。 0044 胶原在体内的降解产物是小分子的氨基酸和小链段的多肽， 糖胺聚糖的降解产物 是小分子的多糖链， 大量的临床应用和研究结果已证实， 这些降解产物对受体不会产生排 斥和其它不良反应， 它们可作为受体的营养成分被逐步吸收和代谢。 0045 生长因子对组织器官细胞的培养、 生长繁殖及与组织器官细胞外和细胞间基质的 结合有极大的影响， 不同组织。
24、器官细胞生长因子之间的协同效应和用量对组织器官细胞的 生长繁殖可进行调控， 其中成纤维细胞生长因子 (bFGF)、 转化生长因子 (TGF-1)， 和表皮 生长因子 (EGF) 对组织器官细胞的生长繁殖、 细胞间的正常融合及与基质的结合均有促进 作用。bFGF 可促进组织器官细胞增殖， TGF-1 可刺激组织器官细胞产生多型胶原， EGF 可 使细胞增殖和迁移， 促进蛋白合成。 生长因子的存在可加速细胞的生长繁殖， 对的组织器官 重建起着极为关键的作用。 0046 本发明利用天然生物大分子海藻酸盐 - 糖胺聚糖 - 胶原为组织工程支架主要成 分， 采用无毒医用生物交联剂和补强剂， 调控海藻酸盐。
25、、 糖胺聚糖和胶原的用量配比整合不 同类型和用量的细胞生长因子， 通过致孔剂浸出法、 气体发泡法、 冷冻干燥法和冷激光技术 致孔法， 构建适于多种组织器官细胞生长的组织工程支架。 0047 本发明与现有技术相比具有如下的有益效果 ： 0048 (1) 本发明根据仿生原理研制组织工程支架， 其组份配比采用天然基质胶原、 糖胺 聚糖与海藻酸盐整合细胞生长因子与生物活性大分子， 促进组织器官细胞间的正常融合及 与组织工程支架的结合。 0049 (2) 根据不同种类的组织器官细胞， 选择不同的细胞生长因子 ( 成纤维细胞生长 因子(bFGF)、 表皮生长因子(EGF)、 转化生长因子(TGF-1)、 。
26、骨形成蛋白(BMPs)、 血管内皮 生长因子 (VEGF) 和生物活性大分子 ( 纤维粘连蛋白 (FN) 和层粘蛋白 (LM) 生长因子的 存在可加速细胞的生长繁殖。 0050 (3) 本发明获得的组织工程支架， 采用无毒医用生物交联剂和补强剂， 使体内外降 解吸收的速率与组织器官细胞生长速率相匹配 ； 可在引导人体组织器官细胞沿材料的支架 生长繁殖， 为人体组织器官的修复构建提供模板。 支架可自行降解和被自体吸收， 与新生组 织相融合或成为人体组织器官的组成部分。 0051 (4) 本发明采用气体发泡法、 冷冻干燥法和冷激光技术致孔法， 构建三维多孔组织 工程支架。可调节孔的尺寸、 体积和密。
27、度， 在支架中形成贯通多孔结构， 适于组织器官细胞 在体内外生长， 可引导细胞在其三维立体多孔结构中粘附生长。 0052 (5) 本发明获得的组织工程支架物理性能与人体组织器官相仿， 含水率 60 95， 膨胀率100500， 抗张强度(湿态)315Mpa， 扯断伸长率300500， 孔径 5 300m。 0053 (6) 本发明的组织工程支架可加工塑形， 制备不同形态和厚度的制品， 成型方法易 操作， 原材料易得不贵， 能进行规模产业化生产。 具体实施方式 ： 0054 下面结合具体的实施方式进一步说明本发明， 但本发明的实施方式不限于此。 说 明 书 CN 101632841 B 7 5/。
28、10 页 8 0055 壳聚糖、 海藻酸钠、 透明质酸、 硫酸软骨素、 聚乙烯醇来源于英国 BS Chemical Technology、 德国 ACROS ORGANICS 和美国 Sigma 生化试剂公司， 成纤维细胞生长因子 (bFGF)、 表皮生长因子 (EGF)、 转化生长因子 (TGF-1)、 骨形成蛋白 (BMPs)、 血管内皮生长 因子 (VEGF) 和生物活性大分子 ( 纤维粘连蛋白 (FN) 和层粘蛋白 (LM) 来源于美国 Sigma 生化试剂公司 0056 实施例 1 0057 组织工程支架由以下原料组份制成， 涉及的百分数为重量百分数 ： 0058 壳聚糖 ： 5 0。
29、059 胶原 ： 30 0060 海藻酸钠 ： 5 0061 透明质酸 ： 0.1 0062 碳二亚胺 ： 0.01 0063 硫酸软骨素 ： 0.1 0064 聚乙烯醇 ： 20 0065 余量三蒸水 ； 0066 并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质 ： ( 质量浓度为下述物质的质量与 上述原料混合物体积的比例， 下同 ) 0067 细胞生长因子 ： 65ng/ml 0068 纤维连接蛋白 ： 70ng/ml 0069 层粘连蛋白 ： 25ng/ml 0070 其中细胞生长因子的组成为 ： 成纤维细胞生长因子 (bFGF)15ng/ml、 表皮生长因 子 (EGF)25ng/ml、 转。
30、化生长因子 (TGF-1)30ng/ml ； 0071 上述组织工程支架由以下步骤制备 ： 0072 (1) 称取所述配比的壳聚糖、 胶原分别溶于 4 pH 6 的盐酸溶液 ； 硫酸软骨素、 透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水 ； 聚乙烯醇溶于 85 100三蒸水 ； 0073 (2) 将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入所述配比的硫酸软骨素、 透明质酸、 聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中， 添加余量三蒸水， 在室温下搅拌 1 2hr， 加入交 联剂， 使各组份充分混合均匀 ； 在室温下用移液管缓慢滴加细胞生长因子， 纤维连接蛋白、 层粘连蛋白， 搅拌 0.5 1hr。 0074 (3。
31、) 将混合液注入模具中， 35烘干或置于 -20 -100冷冻干燥机冻干。 0075 本发明获得的组织工程支架具有如下性质 ： 含水率 80， 膨胀率 100， 透光率 80， 抗张强度 ( 湿态 )3Mpa， 扯断伸长率 300， 35烘干获得孔径 5 100m 的组织工 程支架。 0076 将上述制得的组织工程支架进行动物体内埋植实验分别于2个月、 4个月、 5个月、 6 个月、 11 个月后取出染色后作病理切片光镜下观察， 无炎症细胞， 。植入材料能与组织器 官细胞相容， 降解产物在受体中与细胞相互融合成为一体， 没有排斥反应， 胶原纤维定向排 列整齐透明， 在材料植入部位产生细胞， 形。
32、成密集的细胞生长区域， 可见有新生未分化成熟 的纤维母细胞样细胞， 6 个月可见材料降解产物已完全被吸收代谢。 0077 将传代培养好的细胞用10FBS+DMEM培养液调整细胞浓度至5.0104/ml左右 ； 说 明 书 CN 101632841 B 8 6/10 页 9 将约 1ml/ 孔的细胞悬液接种在 24 孔板中的组织工程支架上， 置 37、 5 CO2及饱和湿度 环境下培养， 成纤维细胞和表皮细胞 3 7 天后可在组织工程支架上正常生长。 0078 实施例 2 0079 壳聚糖 ： 15 0080 胶原 ： 5 0081 海藻酸钠 ： 10 0082 透明质酸 ： 0.1 0083 。
33、碳二亚胺 ： 0.01 0084 硫酸软骨素 ： 0.1 0085 聚乙烯醇 ： 20 0086 余量三蒸水 ； 0087 实施例 3 0088 组织工程支架由以下原料组份制成， 涉及的百分数为重量百分数 ： 0089 壳聚糖 ： 30 0090 胶原 ： 5 0091 海藻酸钠 ： 25 0092 透明质酸 ： 3 0093 碳二亚胺 ： 0.1 0094 硫酸软骨素 ： 0.5 0095 聚乙烯醇 ： 5 0096 细胞生长因子 ： 130ng/ml 0097 纤维连接蛋白 ： 60ng/ml 0098 层粘连蛋白 ： 25ng/ml 0099 余量三蒸水。 0100 上述组织工程支架由以。
34、下步骤制备 ： 0101 (1) 按上述配比称取壳聚糖、 胶原分别溶于 4 pH 6 的醋酸溶液， 硫酸软骨素、 透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水 ； 聚乙烯醇溶于 85 100三蒸水。 0102 (2) 将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入所述配比的硫酸软骨素、 透明质酸、 聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中， 添加余量三蒸水， 在室温下搅拌 1 2hr， 加入交 联剂， 使各组份充分混合均匀 ； 0103 (3) 将混合液注入模具中， 置于 -20 -100冷冻干燥机冻干 ； 0104 获得的组织工程支架具有如下性质 ： 。 0105 实施例 4 0106 组织工程支架由以下原料组。
35、份制成， 涉及的百分数为重量百分数 ： 0107 壳聚糖 ： 30 0108 胶原 ： 5 0109 海藻酸钠 ： 25 0110 透明质酸 ： 3 0111 碳二亚胺 ： 0.1 说 明 书 CN 101632841 B 9 7/10 页 10 0112 硫酸软骨素 ： 0.5 0113 聚乙烯醇 ： 5 0114 细胞生长因子 ： 130ng/ml 0115 纤维连接蛋白 ： 60ng/ml 0116 层粘连蛋白 ： 25ng/ml 0117 余量三蒸水。 0118 并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质 ： 0119 细胞生长因子 ： 130ng/ml 0120 纤维连接蛋白 ： 60。
36、ng/ml 0121 层粘连蛋白 ： 25ng/ml 0122 其中细胞生长因子的组成为 ： 成纤维细胞生长因子 (bFGF)55ng/ml、 转化生长因 子 (TGF-1)20ng/ml、 血管内皮生长因子 (VEGF)55ng/ml 0123 上述组织工程支架由以下步骤制备 ： 0124 (1) 按上述配比称取壳聚糖、 胶原分别溶于 4 pH 6 的醋酸溶液， 硫酸软骨素、 透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水 ； 聚乙烯醇溶于 85 100三蒸水。 0125 (2) 将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入所述配比的硫酸软骨素、 透明质酸、 聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中， 添加余量。
37、三蒸水， 在室温下搅拌 1 2hr， 加入交 联剂， 使各组份充分混合均匀 ； 在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子， 纤维连接蛋 白、 层粘连蛋白， 搅拌 0.5 1hr。 0126 (3) 将混合液注入模具中， 置于 -20 -100冷冻干燥机冻干 ； 0127 获得的组织工程支架具有如下性质 ： 含水率 70， 膨胀率 200， 抗张强度 ( 湿 态 )3Mpa， 扯断伸长率 300， 冷冻干燥获得孔径 50 300m 的组织工程支架。 0128 实施例 5 0129 组织工程支架由以下原料组份制成， 涉及的百分数为重量百分数 ： 0130 壳聚糖 ： 10 0131 胶原 ： 15。
38、 0132 海藻酸钠 ： 30 0133 透明质酸 ： 0.5 0134 碳二亚胺 ： 0.03 0135 硫酸软骨素 ： 1 0136 聚乙烯醇 ： 7 0137 余量三蒸水。 0138 并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质 ： 0139 细胞生长因子 ： 80ng/ml 0140 纤维连接蛋白 ： 1ng/ml 0141 层粘连蛋白 ： 1ng/ml 0142 其中细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子 (bFGF)35ng/ml、 转化生长因子 (TGF-1)20ng/ml 和骨形成蛋白 (BMPs)25ng/ml。 0143 上述组织工程支架由以下步骤制备 ： 说 明 书 CN 1。
39、01632841 B 10 8/10 页 11 0144 (1) 按上述配比称取壳聚糖、 胶原分别溶于 4 pH 6 的醋酸溶液 ； 硫酸软骨素、 透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水 ； 聚乙烯醇溶于 85 100三蒸水 ； 0145 (2) 将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入上述配比的硫酸软骨素、 透明质酸、 聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中， 添加余量三蒸水， 在室温下搅拌 1 2hr， 加入交 联剂， 使各组份充分混合均匀 ； 在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子， 纤维连接蛋 白、 层粘连蛋白， 搅拌 0.5 1hr。 0146 (3) 将混合液注入模具中， 置于 -20。
40、 -100冷冻干燥机冻干。 0147 获得的组织工程支架具有如下性质 ： 含水率 70， 膨胀率 200， ， 抗张强度 ( 湿 态 )3Mpa， 扯断伸长率 300， 冷冻干燥获得孔径 50-300m 的组织工程支架。 0148 实施例 6 0149 组织工程支架由以下原料组份制成， 涉及的百分数为重量百分数 ： 0150 壳聚糖 ： 15 0151 胶原 ： 20 0152 海藻酸钠 ： 20 0153 透明质酸 ： 1 0154 碳二亚胺 ： 0.05 0155 硫酸软骨素 ： 1.5 0156 聚乙烯醇 ： 9 0157 余量三蒸水。 0158 并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质。
41、 ： 0159 细胞生长因子 ： 75ng/ml 0160 纤维连接蛋白 ： 40ng/ml 0161 层粘连蛋白 ： 55ng/ml 0162 其中细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子 (bFGF)35ng/ml、 转化生长因子 (TGF-1)40ng/ml。 0163 上述组织工程支架由以下步骤制备 ： 0164 (1) 按上述配比称取壳聚糖、 胶原分别溶于 4 pH 6 的盐酸溶液 ； 硫酸软骨素、 透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水 ； 聚乙烯醇溶于 85 100三蒸水 ； 0165 (2) 将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入所述配比的硫酸软骨素、 透明质酸、 聚乙烯。
42、醇和海藻酸盐混合液中， 添加余量三蒸水， 在室温下搅拌 1 2hr， 加入交 联剂， 使各组份充分混合均匀 ； 在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子， 纤维连接蛋 白、 层粘连蛋白， 搅拌 0.5 1hr。 0166 (3) 将混合液注入模具中， 置于 35 45烘干， 激光制孔获得孔径 200m。 0167 获得的组织工程支架具有如下性质 ： 含水率 95， 膨胀率 300， 抗张强度 ( 湿 态 )13Mpa， 扯断伸长率 300， 激光制孔获得孔径 250m 的组织工程支架。 0168 实施例 7 0169 组织工程支架由以下原料组份制成， 涉及的百分数为重量百分数 ： 0170 壳。
43、聚糖 ： 20 0171 胶原 ： 25 说 明 书 CN 101632841 B 11 9/10 页 12 0172 海藻酸钠 ： 10 0173 透明质酸 ： 1.5 0174 碳二亚胺 ： 0.07 0175 硫酸软骨素 ： 2 0176 聚乙烯醇 ： 10 0177 余量三蒸水。 0178 并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质 ： 0179 细胞生长因子 ： 120ng/ml 0180 纤维连接蛋白 ： 100ng/ml 0181 层粘连蛋白 ： 120ng/ml 0182 其中细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子 (bFGF)30ng/ml、 转化生长因子 (TGF-1)25n。
44、g/ml、 骨形成蛋白 (BMPs)35ng/ml、 血管内皮生长因子 (VEGF)30ng/ml 0183 上述组织工程支架由以下步骤制备 ： 0184 (1) 按所述配比称取壳聚糖、 胶原分别溶于 4 pH 6 的醋酸溶液 ； 2硫酸软 骨素、 1.5透明质酸和 10海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水 ； 10聚乙烯醇溶于 85 100三蒸水 ； 0185 (2) 将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入硫酸软骨素、 透明质酸、 聚 乙烯醇和海藻酸盐混合液中， 添加余量三蒸水， 在室温下搅拌 1 2hr， 加入交联剂， 使各组 份充分混合均匀 ； 在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子，。
45、 纤维连接蛋白、 层粘连蛋 白， 搅拌 0.5 1hr。 0186 (3) 将混合液注入模具中， 置于 35 45烘干激光制孔。 0187 获得的组织工程支架具有如下性质 ： 含水率 95， 膨胀率 300， ， 抗张强度 ( 湿 态 )13Mpa， 扯断伸长率 300， 激光制孔获得孔径 150m 的组织工程支架。 0188 实施例 8 0189 组织工程支架由以下原料组份制成， 涉及的百分数为重量百分数 ： 0190 壳聚糖 ： 25 0191 胶原 ： 10 0192 海藻酸钠 ： 15 0193 透明质酸 ： 2 0194 碳二亚胺 ： 0.09 0195 硫酸软骨素 ： 3 0196。
46、 聚乙烯醇 ： 15 0197 细胞生长因子 ： 90ng/ml 0198 纤维连接蛋白 ： 50ng/ml 0199 层粘连蛋白 ： 35ng/ml 0200 余量三蒸水。 0201 并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质 ： 0202 细胞生长因子 ： 90ng/ml 0203 纤维连接蛋白 ： 50ng/ml 说 明 书 CN 101632841 B 12 10/10 页 13 0204 层粘连蛋白 ： 35ng/ml 0205 其中细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子 (bFGF)20ng/ml、 转化生长因子 (TGF-1)25ng/ml、 骨形成蛋白 (BMPs)35ng/ml、 血管内皮生长因子 (VEGF)10ng/ml 0206 上述组织工程支架由以下步骤制备 ： 0207 (1)配制25壳聚糖、 10胶原分别溶于4pH6的盐酸溶液，。