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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410634322.1 (22)申请日 2014.11.12 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104436284 A (43)申请公布日 2015.03.25 (73)专利权人 苏州大学 地址 215137 江苏省苏州市相城区济学路8 号 (72)发明人 李秀芳 李明忠 尤仁传 刘雨 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 陶海锋 (51)Int.Cl. A61L 15/32(2006.01) A61L 15/44(200。
2、6.01) A61L 15/42(2006.01) 审查员 杨静 (54)发明名称 一种装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料 及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种装载胰岛素/丝素微球的 丝素多孔材料及其制备方法， 属于生物医用材料 技术领域。 采用同轴高压静电技术和冷冻干燥法 制备出装载胰岛素的丝素微球， 采用层层组装和 冷冻干燥的方法制备载胰岛素/丝素微球的多孔 材料， 多孔材料的孔隙率为70%95%， 孔径为50 200m， 微球均匀地分布在多孔材料内部， 且 与材料结合牢固， 材料中装载的胰岛素能够持续 缓慢释放20天以上， 释放率达到94%以上。 采用本 方法制备的载胰岛素/丝素。
3、微球的丝素多孔材料 所释放出的胰岛素具有生物活性， 可刺激表皮细 胞和内皮细胞迁移， 以促进创面愈合速度， 改善 创面愈合质量。 本发明为创伤、 烧伤等皮肤缺损 和慢性皮肤溃疡的治疗提供了性能良好的创面 敷料。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 104436284 B 2017.09.22 CN 104436284 B 1.一种装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料的制备方法， 将蚕丝进行脱胶、 溶解、 透 析处理后得到再生丝素蛋白溶液， 其特征在于再进行如下步骤的加工： （1） 将甘油加入到浓度为15 wt%的丝素溶液中搅拌均匀， 甘油为丝素质量的350%， 得到外层溶液； 将胰岛素溶。
4、于0.01 M的HCl溶液中， 配置成浓度为120 mg/mL的溶液， 用 NaOH溶液调节pH值为6.57.2， 得到芯层溶液； （2） 采用同轴静电纺丝工艺在液氮浴中得到微球， 经冷冻干燥， 再在2025， 60% 65% RH的恒温恒湿条件下平衡处理， 得到不溶于水的载胰岛素的丝素微球； （3） 将浓度为110 wt%的丝素溶液置于冰浴中， 加入交联剂反应3060min， 得到丝素 蛋白激活液； （4） 将丝素蛋白激活液按6090 L/cm2铺于铝盘中， 在温度为-20-80的条件下 冷冻处理3050 min， 再在冷冻后的丝素激活液上均匀铺展0.55 mg/cm2载胰岛素的丝 素微球，。
5、 在温度为 -20-80的条件下冷冻处理1020 min； （5） 在步骤 （4） 得到的冷冻体上表面， 按4060 L/cm2铺展丝素蛋白激活液， 在温度为 -20-80的条件下冷冻处理3050 min后， 按0.55 mg/cm2均匀铺展载胰岛素的丝 素微球， 按6090 L/cm2铺展丝素蛋白激活液， 在温度为 -20-80的条件下冷冻处 理2448h， 再经冷冻干燥得到装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料。 2.根据权利要求1所述的一种装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料的制备方法， 其特 征在于： 所述的交联剂包括一水吗啉乙磺酸、 N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基。
6、碳二亚胺， 按与丝素的质量百分比分别为2025%、 1015%和2025%。 3.根据权利要求1所述的一种装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料的制备方法， 其特 征在于： 所述的交联剂为京尼平， 其与丝素的质量百分比为1015%。 4.根据权利要求1所述的一种装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料的制备方法， 其特 征在于： 同轴静电纺丝工艺条件为电源电压815 kV； 芯层胰岛素溶液的推注速度为0.1 1 mL/h， 外层丝素溶液的推注速度为0.13 mL/h； 外喷针的内径为12 mm， 内喷针的外径 为0.451.6 mm， 内喷针的内径为0.11.2 mm； 收集距离为815 cm。 5.按。
7、权利要求1制备方法得到的一种装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料， 其孔隙率 为70%95%， 孔径为50200 m。 6.根据权利要求5所述的一种装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料， 其特征在于： 按 质量计， 胰岛素为150%。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104436284 B 2 一种装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料及其制备方法， 该材料可 用于创伤、 烧伤等皮肤缺损和慢性皮肤溃疡的治疗， 属生物医用材料技术领域。 背景技术 0002 皮肤是人体的最大器官， 它既是机体的外部屏障又是机体与外。
8、界沟通的桥梁。 我 国每年有大量的皮肤缺损患者， 主要有创伤、 烧伤或因糖尿病等疾病引起的慢性皮肤溃疡。 近年来， 随着糖尿病患者数量的迅速增长， 糖尿病性并发难愈创面问题成为亟待解决的临 床问题。 因此， 开发针对难愈创面的生物敷料是临床中的迫切需求。 胰岛素作为一种 “生长 因子样” 激素， 能够显著加速创面愈合， 改善创面愈合质量， 给难愈创面提供了有效的促愈 手段。 但胰岛素在血液中易被蛋白酶水解或失活， 并且过高浓度的胰岛素会对人体健康产 生威胁。 因此， 建立合适的胰岛素控释系统， 对慢性难愈创面的临床治疗至关重要。 0003 丝素蛋白是由绢丝腺内壁上的内皮细胞合成、 分泌并储存于。
9、绢丝腺内的天然高纯 度蛋白质， 不含细胞器等生物杂质。 再生丝素蛋白因具有优良的生物相容性、 可生物降解性 等而被广泛研究用作药物释放材料、 抗凝血材料、 功能性细胞培养基质、 生物传感器、 人工 韧带、 人工肌腱、 隐形眼镜、 人工角膜、 人工骨及人工皮肤等。 丝素蛋白内的RGD、 VITTDSDGNE、 NIDNFDED等生物活性序列能促进细胞对其特异性识别和粘附， 有利于作为药 物载体时达到药物向特定细胞靶向传输的目的， 并且丝素蛋白易加工成多种形态的载体材 料， 有利于保持蛋白质及多肽等敏感性药物的活性。 0004 本发明之前， 公开号为CN 101972481 A的中国发明专利 “一。
10、种丝素蛋白微载体及 其制备方法” 中， 通过同轴高压静电技术和冷冻干燥法制备芯壳结构的微载体， 可用于细胞 培养和药物缓释领域。 该方法工艺过程简单， 以水为溶剂， 不会引起丝素蛋白生物相容性的 降低。 公开号为CN 103083723 A的中国发明专利 “胶原/纳米纤维素皮肤再生材料及其制备 方法与应用” 中， 采用乳化法制备明胶微球微球， 然后将微球浸泡在生长因子溶液中得到负 载生长因子的明胶微球溶液， 通过冷冻干燥的方法制备胶原/纳米纤维素多孔支架， 再采用 戊二醛交联的方法将微球与支架复合以促进创面血管化。 该方法制备的微球具有良好的缓 释效果， 但在制备的过程中引入有机溶剂， 存在潜。
11、在的毒副作用。 公开号为CN 103100109 A 的中国发明专利 “负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架及其制备方法” 中， 用万古 霉素浸泡明胶微球， 通过冷冻干燥法使其吸附在微球内， 然后采用共混的方法将微球装载 到丝素支架内。 该方法制备的载药微球突释现象明显， 且微球分布在支架的底部， 部分微球 会因结合不牢靠而脱落。“Alginate-PEG Sponge Architecture and Role in the Design of Insulin Release Dressings” Biomacromolecules, 2012, 13(5): 1478-1485 一文 。
12、中， 采用乳化法制备装载胰岛素的PLGA微球， 然后通过共混法和冷冻干燥法制备载微球的 藻朊酸盐-PEG多孔材料用于创面敷料。 结果表明， 该材料可有效地持续释放胰岛素21天， 且 释放出的胰岛素能够促进角质细胞的迁移， 但在微球的制备过程中引入了有机溶剂， 存在 潜在的细胞毒副作用。 说 明 书 1/5 页 3 CN 104436284 B 3 发明内容 0005 本发明的目的是针对现有技术制备载药微球引入有机溶剂所存在的不足， 提供一 种能释放生物活性、 采用层层组装得到的装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料及其制备 方法。 0006 为实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案是： 一种装载。
13、胰岛素/丝素微球的丝 素多孔材料的制备方法， 将蚕丝进行脱胶、 溶解、 透析处理后得到再生丝素蛋白溶液， 再进 行如下步骤的加工： 0007 1、 将甘油加入到浓度为15 wt%的丝素溶液中搅拌均匀， 甘油为丝素质量的3 50%， 得到外层溶液； 将胰岛素溶于0.01 M的HCl溶液中， 配置成浓度为120 mg/mL的溶液， 用NaOH溶液调节pH值为6.57.2， 得到芯层溶液； 0008 2、 采用同轴静电纺丝工艺在液氮浴中得到微球， 经冷冻干燥， 再在2025， 60% 65% RH的恒温恒湿条件下平衡处理， 得到不溶于水的载胰岛素的丝素微球； 0009 3、 将浓度为110 wt%的。
14、丝素溶液置于冰浴中， 加入交联剂反应3060min， 得到 丝素蛋白激活液； 0010 4、 将丝素蛋白激活液按6090 L/cm2铺于铝盘中， 在温度为-20-80的条 件下冷冻处理3050 min， 再在冷冻后的丝素激活液上均匀铺展0.55 mg/cm2载胰岛素 的丝素微球， 在温度为 -20-80的条件下冷冻处理1020 min； 0011 5、 在步骤4得到的冷冻体上表面， 按4060 L/cm2铺展丝素蛋白激活液， 在温度 为 -20-80的条件下冷冻处理3050 min后， 按0.55 mg/cm2均匀铺展载胰岛素的 丝素微球， 按6090 L/cm2铺展丝素蛋白激活液， 在温度为。
15、 -20-80的条件下冷冻 处理2448h， 再经冷冻干燥得到装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料。 0012 本发明技术方案中， 所述的交联剂包括一水吗啉乙磺酸、 N-羟基琥珀酰亚胺和1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺， 按与丝素的质量百分比分别为2025%、 1015%和20 25%。 所述的交联剂为京尼平， 其与丝素的质量百分比为1015%。 0013 本发明提供的制备方法中的一个优选方案是同轴静电纺丝工艺条件为电源电压8 15 kV； 芯层胰岛素溶液的推注速度为0.11 mL/h， 壳层丝素溶液的推注速度为0.13 mL/h； 外喷针的内径为12 mm， 内喷针的外径为0.45。
16、1.6 mm， 内喷针的内径为0.11.2 mm； 收集距离为815 cm。 0014 本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的一种装载胰岛素/丝素微球的丝素 多孔材料， 其孔隙率为70%95%， 孔径为50200 m。 。 一个优选的方案是： 按质量计， 丝素 多孔材料中胰岛素的含量为150%。 0015 本发明具有以下明显优点： 0016 1、 丝素蛋白内的RGD、 VITTDSDGNE、 NIDNFDED等生物活性序列能促进细胞对其特异 性识别和粘附， 有利于达到药物向特定细胞靶向传输的目的， 并且丝素蛋白易加工成多种 形态的载体材料， 有利于保持蛋白质及多肽等敏感性药物的活性。 001。
17、7 2、 胰岛素不仅能够治疗糖尿病， 而且能够显著加速创面愈合速度， 改善创面愈合 质量， 将胰岛素应用于创面修复是一种有效的促愈手段。 0018 3、 利用同轴高压静电技术和冷冻干燥法， 可以得到粒径分布均匀并且尺寸可控 说 明 书 2/5 页 4 CN 104436284 B 4 的装载胰岛素的丝素微球。 该法工艺过程简单、 设备简易、 微球产量较高、 不引进有机溶剂 避免毒副作用。 0019 4、 采用层层组装和冷冻干燥法， 可制备装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料， 该 多孔材料内微球分布均匀， 且与材料结合牢固， 该材料能够持续释放胰岛素， 且释放出的胰 岛素具有生物活性， 可刺激表。
18、皮细胞和内皮细胞迁移， 以促进创面愈合速度， 改善创面愈合 质量， 为创伤、 烧伤等皮肤缺损和慢性皮肤溃疡的治疗提供了性能良好的创面敷料。 附图说明 0020 图1是本发明实施例提供的载胰岛素的丝素微球的电子显微镜照片； 0021 图2是本发明实施例提供的释放胰岛素溶液的圆二色光谱图； 0022 图3是本发明实施例提供的载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料的纵截面电子显 微镜照片图； 0023 图4是本发明实施例提供的装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料中胰岛素的释 放曲线图。 具体实施方式 0024 下面结合实施例和附图对本发明技术方案作进一步描述。 0025 实施例一： 0026 （1） 将15。
19、0 g家蚕生丝放入6 L质量浓度为0.05%的Na2CO3水溶液中， 于98100oC处 理30 min， 重复3次， 使蚕丝脱胶， 充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维。 将纯丝素纤维加入三元 溶液 （氯化钙： 水： 乙醇的摩尔比为1:8:2） 中， 在72oC搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。 将所得 到的丝素混合溶液装入透析袋中， 用去离子水透析4天， 得到纯化的丝素蛋白溶液。 0027 （2） 将丝素溶液的浓度调至1 wt.%， 加入占丝素质量30%的甘油， 搅拌均匀作为外 层溶液； 将胰岛素溶于0.01 M的HCl溶液中配置成浓度为1 mg/mL的溶液， 用0.1 M的NaOH溶 液调节其pH值至。
20、6.5作为芯层溶液。 采用同轴静电纺丝技术制备微球， 电源电压为8 kV， 芯 层胰岛素溶液的推注速度为0.1 mL/h， 壳层丝素溶液的推注速度为0.3 mL/h， 收集距离为8 cm， 纺制的微球由于电场力作用落入液氮浴中， 经冷冻干燥机干燥48 h， 然后在恒温恒湿 （25， 60%RH） 条件下平衡24 h， 得到不溶于水的载胰岛素的丝素微球。 0028 （3） 将丝素溶液的浓度调至2 wt.%， 置于冰浴中， 依次加入占丝素质量20%的一水 吗啉乙磺酸 （MES） 、 10%的N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS） 和20%的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亚胺 (EDC)组成的交联。
21、剂， 交联反应30 min,得到丝素蛋白激活液。 在铝盒中加入60 L/ cm2的丝素蛋白激活液， 放入-20的冰箱30 min， 在冷冻的丝素溶液上铺展0.5 mg/cm2的 （2） 中所述的微球， 放入-20冰箱10 min， 加入60 L/cm2的丝素蛋白激活液， 再放入-20 冰箱30 min， 再铺0.5 mg/cm2的微球， 最后加入90 L/cm2的丝素蛋白激活液， 冷冻干燥得到 装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料。 经检测， 丝素多孔材料的孔隙率为70%95%， 孔径 为50200 m， 载胰岛素的微球均匀牢固地分布在多孔材料内部， 材料中装载的微球能够 持续缓慢释放胰岛素20。
22、天以上， 释放率达到94%以上， 并且释放出的胰岛素具有生物活性。 0029 参见附图1， 它是本实施例提供的载胰岛素的丝素微球的电子显微镜照片； 从图中 可以看出， 微球大小较为均匀， 形态良好， 说明在电场作用下， 液滴分化均匀， 成球稳定性 说 明 书 3/5 页 5 CN 104436284 B 5 好。 0030 参见附图2， 它是本实施例提供的释放胰岛素溶液的圆二色光谱图， 其中， 曲线A为 微球释放出的胰岛素的圆二色光谱， 曲线B为活性胰岛素溶液的圆二色光谱。 从图中可以看 出， 相比于活性胰岛素溶液， 微球中释放出的胰岛素的特征峰没有发生偏移， 说明释放的胰 岛素的二级结构没有。
23、发生明显的变化， 进一步表明微球的制备过程不影响胰岛素的空间构 象。 0031 参见附图3， 它是本实施例提供的载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料的纵截面电 子显微镜照片图。 从图中可以看出， 两层微球较为均匀地分散在支架内部， 支架没有明显的 分层现象， 且微球和支架结合较为牢固， 不易脱落。 0032 参见附图4， 它是本实施例提供的装载胰岛素/丝素微球的丝素多孔材料中胰岛素 的释放曲线图； 从图中可以看出， 装载的胰岛素能够持续缓慢释放20天以上， 释放率达到 94%以上。 0033 实施例二： 0034 （1） 将脱胶后的家蚕丝素纤维加入9.3 M的LiBr溶液中， 在60oC搅拌溶解成。
24、丝素蛋 白混合溶液。 将所得到的丝素混合溶液装入透析袋中， 用去离子水透析4天， 得到纯化的丝 素蛋白溶液。 0035 （2） 将丝素溶液的浓度调至5 wt.%， 然后加入占丝素质量50%的甘油， 搅拌均匀作 为外层溶液； 将胰岛素溶于0.01 M的HCl溶液中配置成浓度为20 mg/mL的溶液， 然后用0.1 M的NaOH溶液调节其pH值至6.57.2作为芯层溶液。 采用同轴静电纺丝技术制备微球， 电源 电压为15 kV， 芯层胰岛素溶液的推注速度为1 mL/h， 壳层丝素溶液的推注速度为1 mL/h， 收集距离为15 cm， 纺制的微球由于电场力作用落入液氮浴中， 经冷冻干燥机干燥48 h。
25、， 然 后在恒温恒湿 （25， 60%RH） 条件下平衡24 h， 得到不溶于水的载胰岛素微球。 0036 （3） 将丝素溶液的浓度调至10 wt.%， 置于冰浴中， 加入占丝素质量10%的京尼平， 交联反应30 min,得到丝素蛋白激活液。 在圆形铝盒中加入90 L/cm2的丝素蛋白激活液， 放入-80的冰箱30 min， 在冷冻的丝素溶液上铺展1 mg/cm2的 （2） 中所述的微球， 放入-80 冰箱10 min， 加入60 L/cm2的丝素蛋白激活液， 再放入-80冰箱30 min， 再铺1 mg/cm2 的微球， 最后加入90 L/cm2的丝素蛋白激活液， 冷冻干燥得到装载胰岛素/丝。
26、素微球的丝 素多孔材料。 0037 实施例三： 0038 （1） 将100 g柞蚕生丝放入5 L质量浓度为0.25%的Na2CO3水溶液中， 于98100oC处 理45 min， 重复3次， 使蚕丝脱胶， 充分洗涤干燥后得到柞蚕丝素纤维。 将柞蚕丝素纤维加入 熔融的四水合硝酸钙中， 在105oC搅拌溶解成柞蚕丝素蛋白混合溶液。 将所得到的混合溶液 装入透析袋中， 用去离子水透析4天， 去除杂质得到纯化的柞蚕丝素蛋白溶液。 0039 （2） 将丝素溶液的浓度调至2 wt.%， 加入占丝素质量30%的甘油， 搅拌均匀作为外 层溶液； 将胰岛素溶于0.01 M的HCl溶液中配置成浓度为10 mg/m。
27、L的溶液， 用0.1 M的NaOH 溶液调节其pH值至6.57.2作为芯层溶液。 采用同轴静电纺丝技术制备微球， 电源电压为12 kV， 芯层胰岛素溶液的推注速度为0.2 mL/h， 壳层丝素溶液的推注速度为0.6 mL/h， 收集距 离为12 cm， 纺制的微球由于电场力作用落入液氮浴中， 经冷冻干燥机干燥48 h， 然后在恒 温恒湿 （25， 60%RH） 条件下平衡24 h， 得到不溶于水的载胰岛素微球。 说 明 书 4/5 页 6 CN 104436284 B 6 0040 （3） 将丝素溶液的浓度调至2 wt.%， 置于冰浴中， 依次加入占丝素质量20%的MES、 10%NHS和20。
28、%EDC， 交联反应30min,得到丝素蛋白激活液。 在铝盒中加入70 L/cm2的丝素蛋 白激活液， 放入-40的冰箱30 min， 在冷冻的丝素溶液上铺展5 mg/cm2的 （2） 中所述的微 球， 放入-40冰箱10 min， 加入50 L/cm2的丝素蛋白激活液， 再放入-40冰箱30 min， 再 铺5 mg/cm2的微球， 最后加入70 L/cm2的丝素蛋白激活液， 冷冻干燥得到装载胰岛素/丝素 微球的丝素多孔材料。 0041 实施例四： 0042 （1） 将脱胶后的柞蚕丝素纤维加入饱和的硫氰酸锂溶液中， 55下加热溶解得到 柞蚕丝素蛋白混合溶液。 将所得的柞蚕丝素蛋白混合溶液用去。
29、离子水透析3天， 得到纯化的 柞蚕丝素蛋白溶液。 0043 （2） 将丝素溶液的浓度调至2 wt.%， 加入占丝素质量30%的甘油， 搅拌均匀作为外 层溶液； 将胰岛素溶于0.01 M的HCl溶液中配置成浓度为15 mg/mL的溶液， 然后用0.1 M的 NaOH溶液调节其pH值至6.57.2作为芯层溶液。 采用同轴静电纺丝技术制备微球， 电源电压 为13 kV， 芯层胰岛素溶液的推注速度为0.1 mL/h， 壳层丝素溶液的推注速度为0.3 mL/h， 收集距离为12 cm， 纺制的微球由于电场力作用落入液氮浴中， 经冷冻干燥机干燥48 h， 然 后在恒温恒湿 （25， 60%RH） 条件下平。
30、衡24 h， 得到不溶于水的载胰岛素微球。 0044 （3） 将丝素溶液的浓度调至3 wt.%， 置于冰浴中， 依次加入占丝素质量20%的MES、 10%NHS和10%EDC， 交联反应30 min,得到丝素蛋白激活液。 在铝盒中加入70 L/cm2的丝素 蛋白激活液， 放入-60的冰箱30 min， 在冷冻的丝素溶液上铺展2 mg/cm2的 （2） 中所述的 微球， 放入-60冰箱10 min， 加入50 L/cm2的丝素蛋白激活液， 再放入-60冰箱30 min， 再铺2 mg/cm2的微球， 最后加入70 L/cm2的丝素蛋白激活液， 冷冻干燥得到装载胰岛素/丝 素微球的丝素多孔材料。 。
31、0045 实施例五： 0046 （1） 用煮沸的浓度为3.5的Na2CO3溶液处理天蚕茧共三次， 每次30 min， 使蚕丝脱 胶， 充分洗涤干燥后得到天蚕丝素纤维。 将天蚕丝素纤维加入熔融的四水合硝酸钙中， 在 90oC搅拌溶解成天蚕丝素蛋白混合溶液。 将所得到的混合溶液装入透析袋中， 用去离子水 透析4天， 去除杂质得到纯化的天蚕丝素蛋白溶液。 0047 （2） 将丝素溶液的浓度调至2 wt.%， 加入占丝素质量30%的甘油， 搅拌均匀作为外 层溶液； 将胰岛素溶于0.01 M的HCl溶液中配置成浓度为10 mg/mL的溶液， 用0.1 M的NaOH 溶液调节其pH值至6.57.2作为芯层。
32、溶液。 采用同轴静电纺丝技术制备微球， 电源电压为10 kV， 芯层胰岛素溶液的推注速度为0.3 mL/h， 壳层丝素溶液的推注速度为0.5 mL/h， 收集距 离为12 cm， 纺制的微球由于电场力作用落入液氮浴中， 经冷冻干燥机干燥48 h， 然后在恒 温恒湿 （25， 60%RH） 条件下平衡24 h， 得到不溶于水的载胰岛素微球。 0048 （3） 将丝素溶液的浓度调至2 wt.%， 置于冰浴中， 依次加入占丝素质量20%的MES、 10%NHS和20%EDC， 交联反应30 min,得到丝素蛋白激活液。 在铝盒中加入70 L/cm2的丝素 蛋白激活液， 放入-40的冰箱30 min，。
33、 在冷冻的丝素溶液上铺展2 mg/cm2的 （2） 中所述的 微球， 放入-40冰箱10 min， 加入50 L/cm2的丝素蛋白激活液， 再放入-40冰箱30 min， 再铺2 mg/cm2的微球， 最后加入70 L/cm2的丝素蛋白激活液， 冷冻干燥得到装载胰岛素/丝 素微球的丝素多孔材料。 说 明 书 5/5 页 7 CN 104436284 B 7 图1 说 明 书 附 图 1/4 页 8 CN 104436284 B 8 图2 说 明 书 附 图 2/4 页 9 CN 104436284 B 9 图3 说 明 书 附 图 3/4 页 10 CN 104436284 B 10 图4 说 明 书 附 图 4/4 页 11 CN 104436284 B 11 。