发明领域
本发明涉及意在用于插入到活体里的生物不可降解医疗装置，所述医 疗装置包括涂布有胶原VI的组织接触表面。本发明还涉及制造这种装置 的方法。
背景
可植入医疗装置可以用于患者身体内的许多疾病和病症的治疗、治愈 或医治。可植入医疗装置可以用于代替身体的一部分(例如牙科和整形外科 植入物、眼内透镜)，或可以用于矫正或恢复内部组织或器官的结构(例如 血管支架)。可植入医疗装置也可以用作药物递送载体。
例如，牙植入物系统被广泛用于替换受损或缺失的天然牙齿。在此种 植入物系统中，通常由钛或钛合金制成的牙固定件(螺钉)被固定在患者的 颚骨中以代替天然的牙根。然后将桥基结构连接至固定件以便为假牙的从 骨组织中突出、通过软的牙龈组织并进入患者口中的部分建立核。在所述 桥基上，可以最后安置假体或牙冠。
对于任何类型的意在用于与活组织接触的医疗装置，生物相容性是关 键问题。尤其必需解决和最小化异体反应、凝块形成和感染的风险以避免 局部的以及全身性的不良反应，否则所述不良反应可能损害患者的健康和 /或导致装置故障。对于永久性植入物尤其是这样。此外，植入物周围的组 织的愈合或再生通常是至关重要的以便保证植入物及其长期功能性。这对 于承载负荷的植入物如牙科或整形外科植入物尤其重要。
对于牙科固定件，骨组织和植入物之间的强连接是必需的。对于意在 用于与软组织接触的植入物，如要被部分地置于软的牙龈组织中的桥基， 与软组织的相容性对于总体植入物功能性也是至关重要的。通常，在植入 牙植入物系统后，桥基部分或完全被牙龈组织包围。出于医疗和美观原因 两者，理想的是，牙龈组织应当在植入物周围快速且稳固地愈合。口腔粘 膜和牙植入物之间的紧密的密封充当针对口腔微生物环境的屏障并且对 于植入成功是关键的。这对具有不良口腔卫生和/或不足的骨或粘膜质量的 患者尤其重要。软组织和植入物之间不良的愈合或不良的连接增加感染和 植入物周炎(peri-implantitis)的风险，感染和植入物周炎可能最终导致骨再 吸收和植入失败。
存在若干用于增加医疗装置成功植入的机会的策略，例如提高新组织 形成的速率和/或，在需要组织-植入物结合的情况中，提高组织连接到植 入物表面的速率，或通过降低感染的风险。增强新组织形成可以例如通过 多种表面改性和/或在表面上沉积生物活性剂实现。目前，与牙植入物有关 的感染的风险主要通过预防性措施如保持良好的口腔卫生来解决。一旦在 牙植入物的表面上形成生物膜后，难以通过施用抗菌剂将其移除。在牙植 入物周围的骨或软组织中的感染(植入物周炎)的情况中，机械清创是基本 要素，有时候结合抗生素、防腐剂和/或超声或激光治疗。
本领域存在对预防在植入医疗装置的部位的感染的更好方式的需求。
发明概述
本发明的一个目的是至少部分地克服该问题，并且提供一种医疗装 置，如植入物，其具有降低在医疗装置与活组织接触时感染的风险的表面。
根据本发明的第一方面，这种和其他目的通过意在用于插入到活体里 的医疗装置实现，所述医疗装置包括具有组织接触表面的生物不可降解基 板，其中所述组织接触表面部分涂布有胶原VI的微纤维。
胶原是形成许多组织和器官的细胞外基质的主要组分的蛋白质。在各 种组织中发现至少存在28种不同类型的胶原。胶原类型VI(还表示为“胶 原VI”、“胶原-VI”或“类型VI胶原”)是哺乳动物细胞外基质的普遍存在的 组分。如在本文中所使用的，“胶原VI微纤维”或“胶原VI的微纤维”是指 由末端到末端聚集的胶原VI分子四聚体形成的丝结构。这种微纤维可以 具有1至50nm，例如5至20nm范围内的宽度，和0.1至10μm，例如0.5 至5μm范围内的长度。
发明人已经发现涂布有胶原VI微纤维的生物材料提供了针对需氧和 厌氧人类病原的抗微生物性能。显著地，通过在表面上存在的胶原VI并 且可能不涉及胶原VI从表面的任何明显的释放，来发挥抗微生物效果。 因此，相比释放抗微生物物质的装置，抗微生物表面可以更好抵抗衰减。 实验结果表明表面可以在长时间内保持抗微生物效果。因此，根据本发明 的实施方案的医疗装置提供了在将植入物或医疗装置手术植入到患者之 后更好的感染预防。
此外，观察到胶原VI和先天免疫系统、尤其是嗜中性粒细胞的的抗 微生物性能之间的协同效应。这是令人惊讶的；最多已预期多形核嗜中性 粒细胞(PMN)的募集以移除已经死亡的细菌，因为PMN的主要生物功能 是吞噬(fagocyte)、破坏和丢弃细菌。代替地，意外地发现PMN受到刺激 产生嗜中性粒细胞胞外陷阱(NeutrophilExtracellularTrap,NET)以捕获表 面上的细菌，从而通过胶原VI防止细菌进一步扩散并且还被迅速杀伤。 此外，通过PMN和它们的释放的蛋白酶的存在意外地增强了借助胶原VI 的细菌杀伤。不希望被任何具体理论约束，据信，这种PMN刺激效果可 以至少部分归因于包含完整的N-和C-末端结构域的胶原VI的微原纤维结 构，被认为模仿伤口的天然生物环境，并且还可能受益于仍然未知的免疫 和发炎的过程。
因此，通过使用根据本发明的医疗装置，在其中嗜中性粒细胞将会与 涂布有胶原VI的医疗装置接触的情况下，如外科手术或在植入物或医疗 装置的位置处导致流血和/或炎症的任何操作期间，将会进一步提高抗菌效 果。
通常，胶原VI可以作为天然微纤维存在，具有保留的N-和C-末端球 状结构域。
在本发明的实施方案中，生物不可降解基板包含选自金属、陶瓷或塑 料材料的生物相容性材料。例如，生物不可降解基板包含选自由下列各项 组成的组的金属材料：钛、锆、铪、钒、铌、钽、钴和铱及其合金。在其 他实施方案中，基板可以包含陶瓷材料，例如氧化锆。
在本发明的实施方案中，医疗装置可以是意在用于植入到硬组织如骨 和/或柔软组织中的外科手术植入物。
在本发明的实施方案中，医疗装置可以是承载负荷的植入物。
例如，医疗装置可以是牙植入物或其的一部分，如牙固定件、牙桥基 或一体式牙植入物。在其他实例中，医疗装置可以是骨锚定听力装置。备 选地，医疗装置可以是整形外科植入物。
在本发明的实施方案中，医疗装置可以是支架或分流器。
在本发明的实施方案中，医疗装置的组织接触表面可以涂布有胶原 VI的层。任选地，胶原VI可以经由连接分子连接至表面。胶原VI的层 可以具有1nm至50nm，例如5nm至50nm范围内的层厚度。层可以是不 连续的，即不完全覆盖下层表面。
在另一个方面中，本发明提供一种涂布医疗装置的表面的方法，所述 方法包括：
(i)提供具有组织接触表面的生物不可降解基板；
(ii)任选地将连接分子连接至所述组织接触表面；
和
(iii)使所述组织接触表面的至少一部分与包含胶原VI的微纤维的溶液 接触，以将所述胶原VI的微纤维连接至所述表面和/或所述连接分子。
连接分子可以包括聚-L-赖氨酸(PLL)。
在本发明的实施方案中，步骤ii)可以通过以下方式进行：
(ii-a)将包含连接分子和溶剂的溶液施加至制品的表面，和
(ii-b)移除所述溶剂。
备选地或另外地，步骤iii)可以通过以下方式进行：
(iii-a)将包含胶原VI的微纤维和溶剂的溶液施加至所述表面；
(iii-b)温育具有施加至所述表面的所述溶液的基板；和
(iii-c)移除所述溶剂。
步骤iii-b)可以通过将制品在4至40℃范围内的温度下保持至少10分 钟来进行。
在本发明的实施方案中，包含胶原VI的微纤维的溶液可以具有以下 范围内的胶原原纤维的浓度：10nM(150ng/ml)至10μM(150μg/ml)，例如0.5 至5μM，如1至2μM。
同样，在形成本发明的第二方面的方法中，胶原VI可以优选作为天 然微纤维存在。
要指出的是，本发明涉及在权利要求中叙述的特征的全部可能的组 合。
附图简述
图1示出了分别用缓症链球菌(Streptococcusmitis)温育0小时(左栏)、 24小时(中间栏)和48小时(右栏)的不同表面的扫描电子显微照片。表面是 以下：钛表面(Ti；顶排)、涂布有胶原IV的Ti表面(Ti/cVI；从顶部起第 二排)、涂布有聚-L-赖氨酸PLL的Ti表面(Ti/PLL；从顶部起第三排)和涂 布有聚-L-赖氨酸和胶原VI的Ti表面(Ti/PLL/cVI；底排)。比例尺表示10μm (在全部图像中是相同的尺度)。
图2示出了分别用内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)温育0小时(左 栏)、24小时(中间栏)和48小时(右栏)的不同表面的扫描电子显微照片。 表面是以下：钛表面(Ti；顶排)、涂布有胶原IV的Ti表面(Ti/cVI；从顶 部起第二排)、涂布有聚-L-赖氨酸PLL的Ti表面(Ti/PLL；从顶部起第三 排)和涂布有聚-L-赖氨酸和胶原VI的Ti表面(Ti/PLL/cVI；底排)。比例尺 表示10μm(在全部图像中是相同的尺度)。
图3示出了分别用具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)温育0小时 (左栏)、24小时(中间栏)和48小时(右栏)的不同表面的扫描电子显微照片。 表面是以下：钛表面(Ti；顶排)、涂布有胶原IV的Ti表面(Ti/cVI；从顶 部起第二排)、涂布有聚-L-赖氨酸PLL的Ti表面(Ti/PLL；从顶部起第三 排)和涂布有聚-L-赖氨酸和胶原VI的Ti表面(Ti/PLL/cVI；底排)。比例尺 表示10μm(在全部图像中是相同的尺度)。
图4示出了分别用中间普雷沃氏菌(Prevotellaintermedia)温育0小时 (左侧柱)、24小时(中间柱)和48小时(右侧柱)的不同表面的扫描电子显微 照片。表面是以下：钛表面(Ti；顶排)、涂布有胶原IV的Ti表面(Ti/cVI； 从顶部起第二排)、涂布有聚-L-赖氨酸PLL的Ti表面(Ti/PLL；从顶部起 第三排)和涂布有聚-L-赖氨酸和胶原VI的Ti表面(Ti/PLL/cVI；底排)。比 例尺表示10μm(在全部图像中是相同的尺度)。
图5示出了分别用缓症链球菌(S.mitis)(左栏)、内氏放线菌(A. naeslundii)(从左栏起第二个)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)(从右 栏起第二个)和中间普雷沃氏菌(Prevotellaintermedia)(右栏)温育48小时之 后的表面Ti/PLL(顶排)和Ti/PLL/cVI(底排)的扫描电子显微照片。如可以 看出的，在胶原VI(Ti/PLL/cVI)的存在下，由白色箭头指出的，作为膜破 裂和细胞质渗出的细菌杀伤是可见的。比例尺表示2μm(在全部图像中是 相同的尺度)。
图6示出了分别在涂布有胶原VI的Ti表面(表示为“胶原VI”，顶排) 和Ti表面(“对照”，底排)上温育的缓症链球菌的扫描电子显微照片。每天 将新鲜的0.1％细菌溶液添加至表面。在胶原VI的存在下细菌的生长明显 被抑制。比例尺表示10μm。
图7示出了分别在涂布有胶原VI的Ti表面(表示为“胶原VI”，顶排) 和Ti表面(“对照”，底排)上温育的内氏放线菌的扫描电子显微照片。每天 细菌的新鲜的0.1％溶液被添加至表面。在胶原VI的存在下细菌的生长明 显被抑制。比例尺表示10μm。
图8示出了在陶瓷牙桥基(顶排)和钛螺钉(底排)上由多形核嗜中性粒 细胞(PMN)产生的嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)中细菌(缓症链球菌)的捕 获的扫描电子显微照片。SEM图像以增加的放大倍数(比例尺表示1mm、 100μm、20μm和5μm)示出了如何将细菌捕获在由PMN排出的NET中。
图9给出了在涂布有胶原VI的Ti表面(Ti/PLL/cVI)上的借助PMN NET的捕获。PMN排出NET，细菌与其连接并且被其捕获(如由白色箭头 指出的)。比例尺表示5μm。
图10A和10B各自示出了，涂布有使用PLL作为连接剂的胶原VI (cVI；右栏))或没有涂层(对照；左栏))的、分别用缓症链球菌温育0分钟(顶 排)和120分钟(底排)的钛螺钉(图10A)或陶瓷桥基(图10B)的表面上，PMN NET中的细菌捕获和杀伤的描电子显微照片。在胶原VI的存在下，如由 膜起泡(blebbing)(由白色箭头指出的)证实的，细菌的结构完整性被迅速破 坏。在没有胶原VI涂层的情况下，细菌仍然被捕获在NET中而不被杀伤。 比例尺表示2μm。
图11示意性地描绘了包含多肽链、胶原VI单体和天然胶原VI微纤 维的胶原VI的各种结构。
详细描述
本发明的发明人已经发现，具有至少部分地涂布有胶原VI的微纤维、 尤其是天然微纤维的组织接触表面的医疗装置可以提供尤其是对于可植 入医疗装置来说非常合乎需要的显著抗菌效果。另外，发现胶原VI微纤 维涂布的表面展现出超出预期的免疫刺激效果。
如在本文中所使用的，“胶原VI微纤维”或者“胶原VI的微纤维”是指 由末端到末端聚集的胶原VI分子四聚体形成的丝结构。本发明优选地使 用天然微纤维，意味着所述微纤维结构对应于在活组织中发现的胶原VI 的天然形式。相比之下，非天然微纤维可以例如在N-和/或C-末端球状结 构域处部分地降解。可以使用如SpissingerT,EngelJ,MatrixBiol1995； 14:499-505中描述的利用牛角膜胶原酶的方法以从组织样品中分离天然微 纤维。有利的是，这种方法保留了球状结构域。相比之下，使用例如胃蛋 白酶的方法将微纤维在球状结构域处裂解，从而得到部分降解的非天然胶 原VI微纤维。
指令2007/47/ec将医疗装置定义为：“无论单独使用或组合使用均被 制造商预期用于人类的包括软件的任何仪器、装置、器具、软件、材料或 其他制品，所述软件被其制造商预期特定地用于诊断和/或治疗目的并且对 于医疗装置的适当应用是必要的”。在本发明的上下文中，仅考虑意在用 于与活组织接触的医疗装置，即，具有意在在身体、身体部分或器官上施 用、向其中插入、在其中植入或与其接触的物理特征的任何仪器、装置、 器具、材料或其他制品。此外，所述身体、身体部分或器官可以是人或动 物(通常是哺乳动物)受试者的。然而，优选地，所述医疗装置意在用于人 受试者。包含在以上定义中的医疗装置是例如植入物、导管、分流器、管、 支架、子宫内装置和假体。
尤其是，所述医疗装置可以是意在用于植入活组织中或插入受试者的 身体或身体部分中(包括插入体腔中)的医疗装置。
本发明的医疗装置可以意在用于与活组织短期、长时间或长期接触。 根据在用于医疗装置的生物评价的ISO10993-1中发现的定义，“短期”是 指小于24小时的持续时间。此外，根据相同的标准，“长时间”是指24小 时至30天的持续时间。因此，根据相同的标准，“长期”是指超过30天的 持续时间。因此，在一些实施方案中，本发明的医疗装置可以是永久性植 入物，其意在在受试者的身体中保留数月、数年或甚至终生。
当在本文中使用时，术语“植入物”在其范围内包括任何这样的装置， 所述装置的至少一部分意在植入到脊椎动物(尤其是哺乳动物，如人)的身 体中。植入物可以被用于代替解剖结构和/或恢复身体的任何功能。通常， 植入物由一个或若干个植入物部件组成。例如，牙植入物通常包括牙固定 件，所述牙固定件连接到二级植入物部件，如桥基和/或修复牙(restoration tooth)。然而，即使其他部件与其相连，意在用于植入的任何装置，如牙 固定件，也可以被单独称为植入物。
“生物相容”是指这样的材料，所述材料在与活组织接触时，不会因而 引发所述组织的不利生物反应(例如炎症或其他免疫学反应)。
“软组织”是指不是骨或软骨的任何组织类型，尤其是哺乳动物组织类 型。所述医疗装置适用的软组织的实例包括，但不限于，结缔组织，纤维 组织，上皮组织，血管组织，肌肉组织，粘膜，牙龈，和皮肤。
胶原是形成许多组织和器官的细胞外基质的主要组分的蛋白质。在各 种组织中发现至少28种不同类型的胶原；胶原类型I(胶原I)是骨骼和结 缔组织中最丰富的形式；胶原类型II是软骨中最主要的，胶原III是血管 壁的主要成分但也存在于软骨中，并且IV型胶原是基底膜的成分。单个 胶原分子由三种多肽链(也被称为原α-链)组成，每一个形成一个在一个三 螺旋构型中紧密交织的α-螺旋。不同类型的胶原的多肽链的氨基酸序列不 同，并且对于二级结构和/或三级结构也不同。
胶原类型VI((还表示为“胶原VI”，“胶原-VI”或者“类型VI胶原”)是 哺乳动物细胞外基质的普遍存在的组分。其存在于通常与基底膜相关的结 缔组织中。如图11中所示，为了形成胶原VI单体10，α1、α2和α3，多 肽链以异源三聚体结构组装，其中在某些情况下额外的组织特异性链可以 代替α3链。四个单体通过横向结合排列为一个四聚体，并且多个四聚体 末端在末端上(end-on-end)聚集以形成具有薄的、珠状丝的形状的微纤维 20。这种微纤维，也被称为天然微纤维，通常具有在0.5至5μm范围内的 长度和在约10至15nm范围内的宽度。
有趣的是，在它们的生物环境中，天然胶原微纤维通常对酶降解不敏 感。这可能归因于作为生物力学组织稳定剂的胶原VI的生物学作用，对 于组织容量，血管化和免疫细胞浸润是重要的。
胶原VI的N-和C-末端球状结构域与血管性血友病因子(vonWillebrandfactor)类型A结构域共享同源性(SpecksU,MayerU,NischtR,SpissingerT,MannK,TimplR,EngelJ,ChuML,EMBOJ1992；11:4281-4290)，并且溶液中的胶原VI已经显示出具有对作为革兰氏阳性菌的A、C和G链球菌的抗菌活性(AbdillahiS.M.,BalvanovicS.,BaumgartenM,M.,JInnateImmun2012；4:371-3762)。本发明的发明人现在已经示出，胶原VI当涂布至装置表面时不仅对细菌有效，而且还具有先天免疫调节作用，这很可能对愈合和组织再生非常有益。在感染期间，细菌刺激PMN细胞分泌将细菌捕获并固定的嗜中性粒细胞细胞外陷阱(NET)。最近的结果显示，在涂布有胶原VI的表面上NET中的细菌杀伤是非常更加有效的(图9，10A-B)。此外，借助胶原VI的细菌杀伤因PMN和它们释放的蛋白酶的存在而令人意外地增强。总之，结果表明，通过使细菌定植的发生最小化，胶原VI在临床情况中对于伤口愈合可以是有益的。
鉴于这些见解和结果，本发明的发明人提出一种意在用于插入活体的 医疗装置，所述医疗装置包括具有组织接触表面的生物不可降解基板，其 中所述组织接触表面至少部分涂布有胶原VI。
根据本发明的实施方案的医疗装置可以由任何合适的生物相容性材 料制成，例如用于可植入装置的材料。通常，所述医疗装置包括具有组织 接触表面的基板。
“组织接触表面”是指意在用于与活组织接触(短期，长时间，或者长期) 的表面。
基板可以例如由包括选自由下列各项组成的组的一种或多种材料在 内的生物相容性金属或金属合金制成：钛、锆、铪、钒、铌、钽、钴和铱 及其合金。备选地，所述医疗装置的基板可以由生物相容性陶瓷，如氧化 锆、二氧化钛、形状记忆金属陶瓷及其组合制成。在医疗装置被用作牙桥 基或形成牙桥基的一部分的实施方案中，基板优选地由金属材料制成。
在与氧接触时，金属钛、锆、铪、钽、铌及其合金瞬时反应从而形成 惰性氧化物。因此，这些材料的制品的表面实际上总是覆盖有薄的氧化物 层。钛基板的天然氧化物层主要由二氧化钛(IV)(TiO2)组成，并具有少量 的Ti2O3、TiO和Ti3O4。
因此，在医疗装置包含钛、锆、铪、钽、铌或其中任一种的合金中的 一种或多种的实施方案中，医疗装置通常具有天然的金属氧化物表面层。 此种天然的金属氧化物层又可以被胶原VI微纤维的层至少部分覆盖。
在本发明的其他实施方案中，医疗装置，尤其是基板，可以由通常选 自由下列各项组成的组的生物相容性聚合物制成：聚醚醚酮(PEEK)，聚甲 基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚乳酸(PLLA)和聚乙醇酸(PGA)及其任何组合和 共聚物。
在本发明的实施方案中，医疗装置意在用于与活组织短期、长时间或 长期接触。例如，本发明的医疗装置可以是通常意在临时地或永久地代替 或恢复身体的功能或结构的植入物。
通常，所述医疗装置的表面的至少一部分意在与软组织接触，并且该 软组织接触表面的至少一部分具有胶原VI微纤维的涂层。例如，医疗装 置可以是意在用于主要或专门与软组织接触的植入物，例如牙桥基。备选 地，医疗装置可以是要部分在骨中并且部分在软组织中插入的植入物。此 种植入物的实例包括一体式牙植入物和骨锚定的听力装置(也被称为骨锚 定的助听器)。在仅植入物的一部分意在与软组织接触的情况下，优选的是， 在软组织接触表面的一部分上提供包含胶原-VI的涂层。
所述医疗装置也可以适合于与软骨接触。
在其他实施方案中，所述医疗装置可以用于与骨组织接触，例如哺乳 动物(尤其是人)的颚骨、股骨或头骨。此种医疗装置的实例包括牙固定件 和整形外科植入物。
在本发明的实施方案中，组织接触表面可以是粗糙的表面。基板表面 粗糙度，并且因而此外任选地，通过用胶原-VI涂布形成的医疗装置的表 面，可以具有至少0.05μm、通常至少0.1μm、例如至少0.2μm的平均表 面粗糙度Ra。因为据信具有至少0.2μm的平均表面粗糙度(Ra)的表面对生 物膜形成更敏感，如在本文中所描述的胶原VI的涂层可以尤其有利于具 有至少0.2μm的表面粗糙度的医疗装置，并且越来越可用于防止在具有甚 至更高的表面粗糙度的医疗装置上的生物膜的形成。例如，包括钛基板的 牙桥基可以具有约0.2-0.3μm的表面粗糙度。胶原VI微纤维的涂层可以 保持下表面粗糙度。
此外，在本发明的实施方案中，医疗装置的组织接触表面可以包含至 少一种另外的生物分子。
可以通过将胶原VI微纤维直接或者经由连接分子涂布至表面来制备 本发明的医疗装置。在使用连接分子的实施方案中，首先将连接分子连接 到表面，并且随后将胶原微纤维连接到所述连接分子。然而在不使用连接 分子的实施方案中，例如为了清洗表面或赋予净电荷，可以任选地化学或 物理处理表面，以增强胶原VI微纤维的连接。例如，可以对表面进行增 加表面的亲水性的表面处理。
在连接胶原原纤维之后，在例如用作植入物或其一部分之前，可以任 选地对医疗装置进行温和灭菌处理。
根据本发明实施方案的胶原VI微纤维，当使用或不使用连接分子涂 布至表面时，可以呈现任何取向。
例如，可以通过将包含胶原微纤维的溶液施加至表面上来将胶原VI 微纤维施加至医疗装置表面。可以通过任何常规技术将溶液施加至表面， 所述技术留下至少一个覆盖要用胶原VI涂布的表面的溶液的薄膜。这样 的方法包括将溶液喷雾、倾倒和滴加至表面上，和将表面浸渍至溶液中。
溶液可以是浓度在10nM至10μM、例如0.5至5μM、如1至2μM的 范围内的胶原VI微纤维的水溶液。
在将胶原VI溶液的薄膜施加至表面之后，可以允许医疗装置温育至 少10分钟、通常至少30分钟、例如约45分钟、并且至多数小时、通常 至多1小时的时间段。温育可以在40℃以下、通常在4至40℃的范围内 的温度下，例如在室温下(15-25℃)进行。医疗装置可以在潮湿的腔室中温 育。在潮湿气氛下将装置温育是有利的，因为其确保溶剂不会过快从表面 蒸发。如在本发明的实施方案中使用的潮湿的腔室通常是指其中放置组分 并且其中还存在无菌水池或者用无菌水浸泡的组织的封闭腔室。在工业设 定中，潮湿的腔室可以是具有75-100％的湿度的受控的腔室。然而，应当 指出的是潮湿的腔室不是必需的，并且在环境湿度下也可以避免施加的溶 液的过快干燥。
在温育之后(溶剂的蒸发)，表面通常例如在无菌水或者合适的缓冲溶 液中洗涤，以移除残留的溶液，并且可以任选地进行合适的灭菌处理，例 如UV或者γ辐射或者用环氧乙烷气体化学灭菌。
在使用连接分子的本发明的实施方案中，通常在施用胶原VI微纤维 之前，将连接体连接到表面。连接体可以通过任何合适的方式连接到表面， 包括例如静电相互作用、疏水相互作用或者共价结合。尤其是，连接分子 可以通过静电相互作用连接到表面。例如，在具有负电荷的表面上，如钛 制品的氧化钛表面，可以连接带正电的连接分子如聚-L-赖氨酸。如果需要， 可以通过已知的方法对表面进行处理或者改性以获得电荷。
可以通过将连接分子溶液施加至表面而将连接分子连接至表面，优选 地，从而用所述溶液完全覆盖表面。通常，将表面预先例如用乙醇洗涤， 并且干燥。可以通过任何常规技术施加连接分子溶液，如将溶液喷雾、倾 倒或者滴加至表面上或者将表面浸渍至溶液中。
在聚-L-赖氨酸的情况下，施加至表面的溶液可以是具有可以在0.01 至1mg/ml的范围内、通常约0.2mg/ml的浓度的PLL溶液。
将连接体溶液施加至医疗装置表面之后，将溶剂移除，保留连接至表 面的连接分子。例如，通过在例如在40至60℃范围内、并且通常约60℃ 的高温下处理医疗装置，可以将溶剂蒸发。允许溶剂蒸发所需的时间可以 在10分钟至2小时的范围内，通常为30分钟至1小时。
任选地，在本发明的实施方案中，在将连接体溶液施加至制品的表面 之后，将医疗装置温育几分钟，例如1-10分钟，并且在使制品经历如上所 述的高温之前，随后通过用冲洗剂例如无菌水冲洗将除了已经结合到表面 的连接分子外的连接体溶液洗掉。在溶剂或冲洗剂蒸发之后，例如用无菌 水任选洗涤具有连接的连接分子的表面，并且干燥或者使其干燥。
通过将包含胶原纤维的溶液施加至涂布有根据以上描述的连接分子 的表面，可以将胶原微纤维连接至连接分子。可以通过任何常规技术将包 含胶原纤维的溶液施加至表面，所述技术留下至少一个覆盖要用胶原原纤 维涂布的表面的溶液的薄膜。这样的方法包括将溶液喷雾、倾倒和滴加至 表面上，和将表面浸渍至溶液中。包含胶原原纤维的溶液可以是浓度在 10nM至10μM、例如0.5至5μM、如1至2μM的范围内的胶原VI微纤维 的水溶液。
将胶原溶液的薄膜施加至表面之后，可以允许医疗装置温育至少10 分钟、通常至少30分钟、例如约45分钟、并且至多几个小时、通常至多 1小时的时间段。温育可以在40℃以下、通常在4至40℃的范围内的温度 下，例如在室温下(15-25℃)进行。医疗装置可以在潮湿的腔室中温育。在 潮湿气氛下将装置温育是有利的，因为其确保溶剂不会过快从表面蒸发。 如在本发明的实施方案中使用的潮湿的腔室通常是指其中放置组分并且 其中还存在无菌水池或者用无菌水浸泡的组织的封闭腔室。在工业设定 中，潮湿的腔室可以是具有75-100％的湿度的受控的腔室。然而，应当指 出的是潮湿的腔室不是必需的，并且在环境湿度下也可以避免施加的溶液 的过快干燥。
在温育之后(溶剂的蒸发)，表面通常例如在无菌水或者合适的缓冲溶 液中洗涤，以移除残留的溶液，并且可以可选地进行合适的灭菌处理，例 如UV或者γ辐射或者用环氧乙烷气体化学灭菌。
设想到的是，可以对通过根据本发明的方法获得的胶原原纤维涂层做 出进一步的改进。例如，如以上所描述的生物活性物质可以应用于胶原原 纤维涂层。另外地或备选地，例如为了降低医疗装置植入后体内的原纤维 降解速率，可以使胶原原纤维在连接至表面之后交联。
实验
A.材料和方法
1.细菌
缓症链球菌、内氏放线菌、具核梭杆菌和中间普雷沃氏菌由JuliaDavies和Gunnel(DepartmentofOralBiology,FacultyofOdontology,University,Sweden)友情提供。使缓症链球菌和内氏放线菌在37℃，在含有5％CO2的潮湿气氛中，在Todd-Hewitt肉汤培养基(THB)中生长过夜。使具核梭杆菌和中间普雷沃氏菌在37℃，在潮湿气氛中，在厌氧条件下，在蛋白胨酵母葡萄糖(PYG)培养基中生长。
2.胶原VI
根据由Abdillahi等人(2012)所描述的，通过胶原酶消化从牛角膜中分 离胶原VI。小牛眼睛从当地屠宰场得到。将角膜切成块并且用胶原酶提取， 随后用琼脂糖(Sepharose)CL-2B凝胶过滤。
3.涂层钛
由箔冲压出直径5毫米的钛圈。圈首先用氯仿洗涤，接着用蒸馏水洗 涤。风干之后，将50μL聚-L-赖氨酸(0.2mg/mL)施加至所需的钛块上。然 后需要将块在60℃下温育两个小时。之后钛再次在蒸馏水中洗涤并风干。 与此同时，将1mL胶原VI溶液施加至12孔板的孔中。最后将所需的钛 圈投入到胶原VI溶液中并且在4℃过夜温育。第二天早上，将钛风干并进 行测定。
4.细菌的粘附
为了粘附性测定，使缓症链球菌和内氏放线菌在10mLTHB中生长过 夜，使具核梭杆菌和中间普雷沃氏菌在厌氧条件下在PYG培养基中生长， 并且第二天在4℃以3500rpm的转速沉淀10分钟。对于厌氧物种具核梭 杆菌和中间普雷沃氏菌来说，所述步骤在厌氧箱内进行。然后10mLPBST 中稀释沉淀物并且测量OD600。需要将OD600调节为1并且在PBST中 稀释为1:2。将500μL细菌溶液施加至每个内部具有钛圈的孔中并且在 37℃和5％CO2下温育0、30和240分钟。
样品用500μLPBS洗涤三次。将PBS移除并用500μL由在0.15M二 甲胂酸钠中的2.5％戊二醛组成的EM-fix代替。样品在EM-fix中温育过夜。 以下步骤由有经验的技术员进行。进行使用二甲胂酸盐缓冲液的洗涤步 骤，接着连续脱水。因此将样品用50％、70％和95％乙醇温育五分钟两 次并且用无水乙醇温育30分钟和一小时。为了干燥样品，通过使用液态 CO2将乙醇带到临界点转变为气体。该步骤在十分钟内进行三次。之后样 品被固定并用金/钯20nm琼脂涂布。在扫描电子显微镜XL30FEG下研究 样品并且通过AnalySISITEM软件处理图像。
5.细菌杀伤测定
5.1FACS的BacLight
流式细胞仪分析能够确定单个细胞的性质。在本研究中使用BacLight 染色将细菌细胞染色。这样的话，可以在一个种群中区分活细菌和死亡细 菌的数量。
使细菌在THB中标准条件下生长过夜。第二天将1mL过夜培养物转 移到9mL新鲜的THB。将细菌在标准条件下温育，直到OD600达到0.4 为止。使细菌以3500rpm在4℃下沉淀10分钟。丢弃上清液并在10mL 冷TG缓冲液中稀释沉淀物。测量OD并再次沉淀细菌溶液。丢弃上清液 后，用冷TG缓冲液将细菌数量调节为1％。在TG中将溶液稀释为1:10 并将20μL溶液转移至1.5mL反应管。将80、160、200或者500μL胶原 VI施加至1.5mL反应管。为了阴性对照，加入80μLTG缓冲液。为了阳 性对照，加入300μLLL-37。将样品温育0、2、24和48小时，并用5μL 的稀释为1:100的PI和STYO9染色。样品使用BDAccuriC6流式细胞仪 测量。
5.2扫描电子显微镜(SEM)
用SEM可以研究细菌与涂布的钛表面的粘附性。
对于SEM，使细菌生长过夜至OD600为1。使具核梭杆菌和中间普 雷沃氏菌在厌氧条件下在PYG培养基中生长，而使缓症链球菌和内氏放 线菌在THB中生长。在厌氧箱内处理厌氧物种。使培养物沉淀并在10mL PBST中稀释。在将OD600调节为1后，用PBST将细菌悬浮液稀释为1:2。 将500μL的该悬浮液施加至内部具有涂布钛圈的24孔板中的每一个孔 上。将细菌在37℃温育两个小时以允许粘附在钛表面上。在这一时间后， 样品用PBS洗涤三次并加入500μLTHB使得细菌能够生长。将细菌在 37℃温育0分钟、4、24和48小时。在温育之后，用500μLPBS将孔洗 涤三次并且用由在0.15M二甲胂酸钠中的2.5％戊二醛组成的EM-fix将细 菌固定。样品用EM-fix温育过夜。以下步骤由有经验的技术员进行。进 行使用二甲胂酸盐缓冲液的洗涤步骤，接着连续脱水。因此将样品用50％、 70％和95％乙醇温育五分钟两次并且用无水乙醇温育30分钟和一小时。 为了干燥样品，通过使用液态CO2将乙醇带到临界点转变为气体。该步骤 在十分钟内进行三次。随后样品被固定并用金/钯20nm琼脂涂布。在扫描 电子显微镜XL30FEG下研究样品并且通过AnalySISITEM软件处理图 像。
6.胶原VI的长期活性
为了查明胶原VI在钛表面的活性有多长，每天将新的细菌施加到实 验设定中。
对于实验来说，照常涂布钛。使细菌在标准条件下在THB中生长过 夜。第二天早上将1mL过夜培养物转移至9mL新鲜THB并且进行温育 直到细菌溶液的OD600达到0.4为止。使细菌以3500rpm在4℃沉淀10 分钟。在10mL冷TG缓冲液中重悬沉淀物并测量OD。使细菌再次沉淀 并将细菌数量调整为1％。然后将该溶液稀释为1:10(0.1％溶液)。向每个 内部具有钛切片的孔施加500μL细菌溶液，并温育0分钟、4h、24h、 48h、72h和96h。然后将样品用EM-fix固定并且准备用于电子显微镜。 每天将细菌溶液用新鲜的0.1％溶液替换。
7.γ辐射对胶原VI的影响
牙植入物在工业上用γ辐射灭菌。为了明白辐射是否对胶原VI具有 影响，进行了长期研究。将钛照常涂布并用γ辐射处理。
8.借助口腔细菌的嗜中性粒细胞细胞外陷阱(NET)活化
为了研究先天免疫系统如何对生长在牙植入物上的口腔细菌反应，将 钛螺钉和桥基用PLL或PLL/CVI涂布，并用缓症链球菌和内氏放线菌温 育。
8.1牙植入物的涂布
将螺钉和桥基首先用氯仿洗涤，然后用去离子水洗涤，并且施加至24 孔板。加入500μL聚-L-赖氨酸直到植入物被覆盖。在60℃温育植入物直 到pLL干燥。然后用去离子水洗涤植入物以移除未结合的pLL。将涂布有 胶原VI的螺钉和桥基施加至1.5mL反应管中。加入胶原VI直到植入物 被完全覆盖，然后在4℃温育过夜。第二天，移除胶原VI并将植入物风干。
8.2细菌的制备
使细菌在THB中在标准条件下生长过夜。第二天，将1mL细菌溶液 加入至9mL新鲜THB中。使细菌生长直到OD600达到0.4为止。然后使 它们在3500rpm和4℃的下沉淀10分钟。丢弃上清液并将沉淀物在10mL 冷TG缓冲液中稀释。测量OD并再次沉淀细菌溶液。丢弃上清液后，用 冷TG缓冲液将细菌数量调节为1％。将细菌在冰上储存直到嗜中性粒细 胞被分离。
8.3嗜中性粒细胞分离
为了分离嗜中性粒细胞，将20mL的polymorph-prepTM移液到一个 50mL的Falcon管中。将来自健康供体的血液收集在肝素6mL管中并在 室温下温育30分钟。用20mL血液将polymorph-prep过度分层而不使组 分混合。为了分离不同的血液内含物，将falcon管在500xg和20℃下离 心60分钟。离心之后，可见不同的层。将嗜中性粒细胞层移除并转移到 一个新的falcon管中。然后将嗜中性粒细胞用双倍体积的1xPBS洗涤并 在500xg和20℃下离心10分钟。然后用2.7mL无菌Millipore水裂解污 染红细胞10秒钟。用300μL10xPBS停止反应。将体积调节为15mL并 将样品在250xg和20℃下离心5分钟。重复该步骤直到所有红细胞被裂 解。用500mL钠-培养基(含有5.6mM葡萄糖、127mMNaCl、10.8mMKCl、 2.4mMKH2PO4、1.6mMMgSO4、10mMHepes和1.8mMCaCl2；用NaOH 将pH调节为7.3)稀释沉淀物，并用LunaTM自动细胞计数器对细胞进行 计数。计算每个样品的细胞数量并且将相应体积的嗜中性粒细胞悬浮液加 入至每个含有螺钉、桥基和细菌溶液的1.5mL反应管中。将样品温育0、 30、60和120分钟，并转移到1mLEM-fix(在0.15M二甲胂酸钠中的2.5％ 戊二醛)中。用于SEM的制备由有经验的技术员进行。
9.统计学分析
用Excel和GraphPadPrism6.0分析数据。实验至少独立进行两次。 使用结晶紫的细菌杀伤测定进行一组三次，而对于荧光显微镜的BacLight 活力计数(viabilitycount)进行一组两次。对于使用结晶紫的细菌杀伤测定 和荧光显微镜的BacLight数据，使用方差的单向分析(ANOVA)。将从在 未涂布的孔中温育的细菌得到的数据指定为阳性对照。将显著性 (significance)表示为****P<0.0001。
B.结果
1.细菌粘附性
为了测试粘附的水平，将细菌在涂布的钛表面上温育并通过扫描电子 显微镜分析。在4小时的温育之后可检测到的缓症链球菌和内氏放线菌的 细菌数量有些许增加。不同的涂层之间不存在可见细菌粘附性的差异。厌 氧细菌物种具核梭杆菌和中间普雷沃氏菌在表面上显示出相似的粘附程 度。基于这些结果，将细菌温育两个小时用于细菌杀伤测定，以允许适当 的粘附水平。
2.细菌杀伤试验
2.1FACS的BacLight
将使用FACS的活力分析用于确定活细菌的数量。使用碘化丙啶(PI) 将死亡细菌染色。对于用胶原VI处理的缓症链球菌，检测到低的STYO9 信号。仅0分钟的温育之后，用160μL胶原处理过的细菌大约15％是活 的。对于用胶原VI处理过的细菌的PI信号，用160，200和500μL处理 过的细菌中随时间增加到大约80％的最大值。
对于内氏放线菌，在温育48小时的时候，能够观察到STYO9染色的 细菌的轻微增加。对于PI，所有表面处理的信号均较高。在用160μL的 cVI处理过的细菌温育2小时之后，检测到用胶原VI处理的内氏放线菌的 最高信号。之后信号再次减小。因此，由FACS坚定地证明了由胶原VI 引起的细菌杀伤。缓症链球菌中将死亡细菌PI染色的信号如预期增加。 两个小时内胶原VI杀伤的病原体剂量是独立的。当用不同量的胶原VI温 育内氏放线菌时观察到相同的效果。2小时的温育之后检测到最高的细菌 杀伤。之后少数存活的细菌开始再次生长并且PI的信号降低，而STYO9 的信号增加。这些结果与借助SEM的活力结果一致。
2.2扫描电子显微镜
在48小时内，通过扫描电子显微镜分析具有不同涂层的钛表面上的 细菌杀伤。不同细菌物种的代表性图像在图1至图4中示出。
在SEM图像中看到，在48小时的温育期间，对于在Ti和Ti/pLL上 温育的缓症链球菌(图1)和内氏放线菌(图2)，细菌数量增加。与缓症链球 菌的图像相比，内氏放线菌表现出更强的生长。在24小时的温育之后出 现多层，并且一直增加直到48小时。相比之下，当在ti/cVI和pLL/cVI 上温育这些细菌时，发现细菌数量减小，并且死亡或至少起泡的细菌数量 增加(图1、图2)。从温育的24到48小时，细菌数量增加很少。在此期间， 通过细菌沉降在一层死亡细菌上形成了一些菌落。
在钛或者涂布有pLL的钛上温育四小时之后，观察到健康的细菌。在 这些条件下，内氏放线菌已经开始构建多层菌落。当用胶原VI处理该物 种时，细菌数量在四个小时的温育之后下降。观察到囊泡膜化合物 (vesicularmembranecompound)的起泡以及细菌内部内容物的排出。
具核梭杆菌和中间普雷沃氏菌的细菌杀伤分别在图3和图4中示出。 对于没有用胶原VI处理的样品，在48小时的温育期间，观察到两种细菌 的细菌数量增加。24小时之后，两个物种开始构建与对内氏放线菌看到的 那些相似的大块生物膜。相比较而言，在经过四个小时温育之后，用胶原 VI的处理导致细菌数量急剧下降。在表面上只能检测到很少的细菌。存活 的少数细菌开始再次分裂，这随着细菌数量在48小时的温育期间增加而 看被到。与不用胶原VI处理的细菌相比，细菌的生长下降。
该实验显示，与不用胶原VI处理的缓症链球菌相比，当用胶原VI处 理缓症链球菌时，在4小时的温育后表面看起来是空的。在更高的放大倍 数下，可以看到所有被测试的细菌物种的细菌杀伤效果(图5，左栏)。细 菌膜形成囊泡并且相比于未处理的细菌，单个细胞似乎是溶胀的。最后， 细菌将包含它们的DNA的它们的内部内容物排出。当没有用胶原VI处理 内氏放线菌时，它在24小时的温育后形成大块生物膜。然而，当用胶原 VI温育该物种时，在利用与细菌杀伤相关的胶原VI温育4小时之后，表 面几乎是空的。24小时之后，可以检测到很少的菌落，其生长直到48小 时的温育。与未处理的内氏放线菌相比，可以清楚地观察到胶原VI对该 病原的效果。在更高的放大倍数下，与未处理的细菌相比，明显的是用胶 原VI的处理使内氏放线菌利破裂(图5，从左栏起第二个)。没有发生如缓 症链球菌那样相同程度的膜破裂，但是仍然观察到细菌内部内容物的排 出。
在厌氧病原中，在24小时的温育之后，涂布有胶原VI的表面似乎几 乎没有细菌(图3，图4)。
综上所述，图1至4显示，在48小时的温育期间，在所有Ti和Ti/PLL 表面上的情况下，观察到生长细菌的增加的数量。48小时之后，所有细菌 已经生长到它们使整个表面被一个厚的生物膜层覆盖的程度。相比之下， 在涂布有cVI或者pLL/cVI的钛上仅四小时的温育之后，检测到大量的死 亡细菌以及膜囊泡的起泡和渗出(bleeding)的细菌，24小时之后其效果甚 至是更加明显可见的。细菌开始将它们的内部内容物排出。相比之下，没 有用胶原VI温育的细菌看起来健康并且已经开始形成介壳虫(coccids)。
在使用缓症链球菌和内氏放线菌的长期研究期间，得到类似的观察结 果。在5天期间内，每天将新的细菌施加至涂布的钛表面上。对于缓症链 球菌(图6)以及内氏放线菌(图7)，当将病原施加至用胶原VI处理的钛表 面上时，细菌生长受到抑制。未处理的细菌可以比在涂布有胶原VI的表 面上生长的细菌生长的快得多。总之，这些实验证明胶原VI的抗微生物 效果至少在5天内是稳定的。对于牙植入物，这将意谓着用胶原VI涂布 植入物可以防止术后第一波口腔病原期间的感染。
3.胶原VI涂层的长期活性和γ辐射
在五天期间内，在还用γ辐射处理的测试表面上，观察胶原VI的长 期活性。每天，施加新鲜的0.1％细菌溶液。在96小时的温育期间，在没 有用胶原VI处理的情况下，缓症链球菌和内氏放线菌二者的细菌数量显 著增加。与之相比，胶原VI的存在导致仅仅温育两小时后的细菌杀伤。 之后一些存活的细菌开始分裂，但是与用胶原VI处理的细菌的方式不同。 如果在用γ辐射工业上灭菌的涂布的钛上进行同样的实验，与正常涂布的 钛相比没有观察到差异。在含有胶原VI的设定中，两小时之后观察到细 菌杀伤。
4.借助口腔细菌的嗜中性粒细胞细胞外陷阱(NET)活化
在嗜中性粒细胞存在下，在独立的实验中，分别在钛螺钉(图8，底排) 和桥基(图8，顶排)上温育缓症链球菌和内氏放线菌。在图9和10A-B中 能够详细观察到嗜中性粒细胞对口腔病原的效果。图10A(螺钉)和图10B (桥基)显示出缓症链球菌杀伤和NET-形成(在图中NET由箭头表示)。在胶 原VI存在下，染色细菌立即(0分钟的温育)可见。通过大范围的膜起泡和 细胞质渗出可见，在120分钟温育期间效果增强。当没有用胶原VI处理 病原时，在120分钟之后，可以观察到相当轻微的程度的通过NETosis的 杀伤(图10)。对于内氏放线菌，能够观察到胶原VI涂层的相似效果。没 有观察到螺钉表面和桥基表面之间的区别。
先天免疫系统似乎支持并且增强胶原VI的作用，反之亦然。在施加 牙植入物期间，先天免疫系统通过出血与植入物和口腔病原接触。对于牙 科这意味着用涂布有胶原VI的植入物治疗的患者可以得到非常好的保护， 以防止细菌感染。
参考文献
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2.SpecksU,MayerU,NischtR,SpissingerT,MannK,TimplR,EngelJ, ChuML,EMBOJ1992；11:4281-4290
3.AbdillahiS.M.,BalvanovicS.,BaumgartenM,M.,JInnateImmun2012；4:371-376