技术领域
本发明涉及生物医学材料，特别是仿生型复合三维多孔骨组织工程支架材料的 制备方法。
本发明还涉及所述方法制备的材料。
本发明还涉及所述材料的应用。
背景技术
组织工程为受损的骨组织修复提供了一种新兴途径，以羟基磷灰石 (hydroxyapatite，HA)为代表的钙磷酸盐陶瓷因与骨的无机相化学成分相近而被广 泛用于骨替代材料，不足之处在于由于其脆性和较低的抗弯曲强度而难以在承重部 位使用，煅烧后陶瓷结晶度较高很难为机体降解，产生的应力遮挡对骨愈合及塑形 很不利。因此，目前常用的以羟基磷灰石为代表的生物陶瓷只能简单模仿天然骨基 质的无机成分，极大的限制了它在临床的应用。
I型胶原是天然骨基质的主要有机成分，经过适当提取处理的胶原具有良好的 生物相容性和生物降解性，早在二十世纪50年代就开始使用，其后被广泛用作软组 织替代物和药物缓释系统。胶原作为骨移植替代物有着固有的缺陷：力学强度低，不 能较好满足骨修复材料需具备的强度要求，且临床可操作性较差。
近年来复合材料的研究得到重视，已有合成钙磷陶瓷/胶原复合体的研究报道。 目前大多数的磷酸钙/胶原复合物实际上是两者的机械混合物，通常是将烧结的HA 或其他陶瓷研磨后与胶原溶液混匀制成，其不足之处在于陶瓷和胶原基体之间无 法形成紧密的键合，陶瓷颗粒只能松散的分部于胶原框架内，并不能解决生物陶瓷 所存在的问题。另外，传统羟基磷灰石等钙磷陶瓷成形过程中通常需要经过高温和 高压的作用，压制、烧结成形进一步破坏了钙磷陶瓷的降解性能。复合材料中的胶 原在高温高压等剧烈的条件下也会失去其固有的生物学结构及功能。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供了一种仿生型复合三维多孔骨组织工程支 架材料，该材料用作骨替代材料，修复受损的骨组织。
本发明的目的还在于提供了上述仿生型复合三维多孔骨组织工程支架材料的 制备方法及其应用。
本发明的复合三维多孔骨组织工程支架材料的制备方法包括如下步骤：
(1)混合：将CaO-P2O5-SiO2系统生物活性玻璃纳米粉体、I型胶原蛋白、透 明质酸、磷脂酰丝氨酸混合，搅拌均匀，制得混合液；
(2)交联：在上述混合液中加入缓冲剂，调节pH值为5～6，再加入交联剂3～ 6mg/ml进行交联处理；
(3)将经步骤(2)交联处理后得到的混合液于-60～80℃下冷冻10～20小 时，用0.1mol/l的Na2HPO4溶液浸泡1～3小时，再用去离子水清洗30～50分钟， 清洗后经脱水，真空干燥；
上述各组分的重量份用量如下：
CaO-P2O5-SiO2系统生物活性玻璃纳米粉体 50～80
I型胶原蛋白 10～35
透明质酸 2～8
磷脂酰丝氨酸 2～8
所述CaO-P2O5-SiO2系统生物活性玻璃纳米粉体中CaO占36％～16％重量、P2O5占4％重量、SiO260％～80％重量。
优选方案如下：
步骤(2)中，缓冲剂是乙撑磺酸(MES)或者醋酸，交联剂为1-乙基-3-(3 -二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或戊二醛。
步骤(1)中，所述CaO-P2O5-SiO2系统生物活性玻璃纳米粉体可由下述步骤制 备得到：
(1)制备微乳液：在环己烷中加入辛烷基酚基聚氧乙烯醚(TritonX-100)、助 表面活性剂及浓度为12.5％重量的氢氧化铵水溶液或浓度为0.6M的硝酸钙水溶液， 配制氢氧化铵溶液的微乳液和硝酸钙溶液的微乳液；氢氧化铵溶液的微乳液中，各 组分摩尔比为环己烷∶TritonX-100∶助表面活性剂∶氢氧化铵水溶液＝30∶1∶5～10∶ 0.5～1.5；硝酸钙溶液的微乳液中，各组分摩尔比为环己烷∶TritonX-100∶助表面活 性剂∶硝酸钙水溶液＝30∶1∶5～10∶0.5～1.5，所述助表面活性剂为正丁醇、正戊 醇、正己醇、正辛醇中的一种或一种以上混合物；
(2)水解：步骤(1)得到的氢氧化铵溶液的微乳液中加入正硅酸乙脂(TEOS) 和磷酸三乙脂(TEP)发生水解反应，水解反应时间为30～60分钟，各组分重量比 为正硅酸乙脂(TEOS)∶磷酸三乙脂(TEP)∶氢氧化铵溶液的微乳液＝9～13∶1∶ 50～100；
(4)陈化：将上述混合液在室温下放置3-4天；
(5)脱膜：在上述混合液中加入浓度为70％-80％重量的丙酮溶液，发生絮凝， 分离出絮凝胶体，用浓度为70％-80％重量的丙酮溶液或无水乙醇清洗3-4次；
(6)干燥：将上述絮凝胶体真空干燥后，在600℃-700℃温度下热处理2-3 小时。
本发明制备的复合三维多孔骨组织工程支架材料孔径为200μm～500μm，孔隙 率为80％～90％。
本发明制备的复合三维多孔骨组织工程支架材料可应用与制备用于修复受损 的骨组织的骨替代材料。
本发明的仿生型复合三维多孔骨组织工程支架材料使用的胶原蛋白、透明质酸 是天然骨组织的主要有机成分，磷脂酰丝氨酸是细胞膜的一种组分，具有调制矿化 的作用，生物玻璃是高活性的纳米粉体，因此本发明的材料具有良好的骨结合力和 细胞亲和性，可促使植入体在短期内与骨组织形成牢固的生物结合，能够用在医疗 领域中作为骨替代材料修复受损的骨组织，具有很高的生物活性和生物相容性。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明的材料成分与结构更接近于天然骨组织，具有更高的生物活性和 生物相容性。
(2)本发明使用的胶原蛋白、透明质酸是天然骨组织的主要有机成分，磷脂 酰丝氨酸是细胞膜的一种组分，具有调制矿化的作用，生物玻璃是高活性的纳米粉 体，因此本发明的材料具有良好的骨结合力和细胞亲和性，可促使植入体在短期内 与骨组织形成牢固的生物结合。
(3)本发明采用仿生方法，利用冷冻干燥技术，避免了高温高压对材料性能 的破坏，并节约了成本。
(4)本发明可以通过调节支架材料各成分的含量及工艺参数，改变支架材料 的结构及力学强度。
附图说明
图1是实施例1制备的复合三维多孔骨组织工程支架材料的扫描电镜图；
图2是实施实例2制备的复合三维多孔骨组织工程支架材料的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，本发明并不限于此。
实施例1
(一)制备CaO-P2O5-SiO2系统生物活性玻璃纳米粉体
(1)制备微乳液有机模板：在环己烷中加入辛烷基酚基聚氧乙烯醚 (TritonX-100)、助表面活性剂及氢氧化铵水溶液(浓度12.5％)或硝酸钙水溶液 (浓度0.6M)，配制氢氧化铵溶液的微乳液和硝酸钙溶液的微乳液；
(2)水解：加入正硅酸乙脂(TEOS)和磷酸三乙脂(TEP)到氢氧化铵溶液 的微乳液中，发生水解反应，水解反应时间为30～60分钟，正硅酸乙脂(TEOS)∶ 磷酸三乙脂(TEP)∶氢氧化铵水溶液的重量比为9∶1∶50；
(3)混合：将步骤(1)配置的硝酸钙溶液的微乳液按体积比1∶1加入到步 骤(2)得到的微乳液中，搅拌60分钟，得到混合液；
(4)陈化：将上述混合液在室温下放置3天；
(5)脱膜：在上述混合液中加入80％(浓度)的丙酮溶液，发生絮凝，分离 出絮凝胶体，用80％(浓度)的丙酮溶液或无水乙醇清洗3次；
(6)干燥：将上述絮凝胶体真空干燥后，在600℃温度下热处理3小时。
步骤(1)中，所述硝酸钙溶液的微乳液中各组分摩尔比范围为环己烷∶ TritonX-100∶助表面活性剂∶硝酸钙水溶液(mol比)＝30∶1∶6∶0.75，所述氢 氧化铵溶液的微乳液中各组分摩尔比范围为环己烷∶TritonX-100∶助表面活性剂∶ 氢氧化铵水溶液(mol比)＝30∶1∶6∶0.75。所述助表面活性剂正己醇。
(二)制备仿生型复合三维多孔骨组织工程支架材料
将CaO-P2O5-SiO2系统生物活性玻璃纳米粉体45～55g，I型胶原蛋白35～40g， 透明质酸4～6g，磷脂酰丝氨酸4～6g混合，搅拌均匀后加入缓冲剂乙撑磺酸(MES)， 调节pH值为5～6，以3～6mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺 (EDC)为交联剂进行交联处理，交联处理后于-60℃冷冻机中冷冻20h，然后冷冻 干燥至完全脱水。用0.1mol/l的Na2HPO4浸泡1h，再用去离子水反复冲洗30min。 清洗后用酒精反复脱水，再在真空状态下干燥，获得直径为6mm，长15mm的圆柱状 块体。孔径范围为185～235μm，孔隙率范围为86～89％，其形态如图1所示。
实施例2
(一)制备CaO-P2O5-SiO2系统生物活性玻璃纳米粉体
(1)制备微乳液有机模板：在环己烷中加入辛烷基酚基聚氧乙烯醚 (TritonX-100)、助表面活性剂及氢氧化铵水溶液(浓度12.5％)或硝酸钙水溶液 (浓度0.6M)，配制氢氧化铵溶液的微乳液和硝酸钙溶液的微乳液；
(2)水解：加入正硅酸乙脂(TEOS)和磷酸三乙脂(TEP)到氢氧化铵溶液 的微乳液中，发生水解反应，水解反应时间为30分钟，正硅酸乙脂(TEOS)∶磷酸 三乙脂(TEP)∶氢氧化铵水溶液的重量比为13∶1∶100；
(3)混合：将步骤(1)配置的硝酸钙溶液的微乳液按体积比1∶1加入到步 骤(2)得到的微乳液中，搅拌80分钟，得到混合液；
(4)陈化：将上述混合液在室温下放置4天；
(5)脱膜：在上述混合液中加入75％(浓度)的丙酮溶液，发生絮凝，分离 出絮凝胶体，用75％(浓度)的丙酮溶液或无水乙醇清洗4次；
(6)干燥：将上述絮凝胶体真空干燥后，在700℃温度下热处理2小时。
步骤(1)中，所述硝酸钙溶液的微乳液中各组分摩尔比范围为环己烷∶ TritonX-100∶助表面活性剂∶硝酸钙水溶液(mol比)＝30∶1∶9∶1.25，所述氢 氧化铵溶液的微乳液中各组分摩尔比范围为环己烷∶TritonX-100∶助表面活性剂∶ 氢氧化铵水溶液(mol比)＝30∶1∶9∶1.25。所述助表面活性剂为正己醇、正辛 醇的混合物(摩尔比1∶1)，其形态如图2所示。
(二)制备仿生型复合三维多孔骨组织工程支架材料
将CaO-P2O5-SiO2系统生物活性玻璃纳米粉体55～65g，I型胶原蛋白25～30g， 透明质酸2～4g，磷脂酰丝氨酸2～4g混合，搅拌均匀后加入缓冲剂醋酸，调节pH 值为5～6，以3～6mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为交联剂进行交联处理， 交联处理后于-80℃冷冻机中冷冻10h，然后冷冻干燥至完全脱水。用0.1mol/l 的Na2HPO4浸泡1h，再用去离子水反复冲洗30min。清洗后用酒精反复脱水，再在 真空状态下干燥，获得直径为5mm，长20mm的圆柱状块体。孔径范围为165～205μm， 孔隙率范围为84～87％。
实施例3
(一)制备CaO-P2O5-SiO2系统生物活性玻璃纳米粉体
(1)制备微乳液有机模板：在环己烷中加入辛烷基酚基聚氧乙烯醚 (TritonX-100)、助表面活性剂及氢氧化铵水溶液(浓度12.5％)或硝酸钙水溶液 (浓度0.6M)，配制氢氧化铵溶液的微乳液和硝酸钙溶液的微乳液；
(2)水解：加入正硅酸乙脂(TEOS)和磷酸三乙脂(TEP)到氢氧化铵溶液 的微乳液中，发生水解反应，水解反应时间为30～60分钟，正硅酸乙脂(TEOS)∶ 磷酸三乙脂(TEP)∶氢氧化铵水溶液的重量比为9∶1∶50；
(3)混合：将步骤(1)配置的硝酸钙溶液的微乳液按体积比1∶1加入到步 骤(2)得到的微乳液中，搅拌60分钟，得到混合液；
(4)陈化：将上述混合液在室温下放置3天；
(5)脱膜：在上述混合液中加入70％(浓度)的丙酮溶液，发生絮凝，分离 出絮凝胶体，用70％(浓度)的丙酮溶液或无水乙醇清洗4次；
(6)干燥：将上述絮凝胶体真空干燥后，在600℃温度下热处理3小时。
步骤(1)中，所述硝酸钙溶液的微乳液中各组分摩尔比范围为环己烷∶ TritonX-100∶助表面活性剂∶硝酸钙水溶液(mol比)＝30∶1∶6∶1.5，所述氢 氧化铵溶液的微乳液中各组分摩尔比范围为环己烷∶TritonX-100∶助表面活性剂∶ 氢氧化铵水溶液(mol比)＝30∶1∶6∶1.5。所述助表面活性剂为正戊醇。
(二)制备仿生型复合三维多孔骨组织工程支架材料
将CaO-P2O5-SiO2系统生物活性玻璃纳米粉体55～65g，I型胶原蛋白25～30g， 透明质酸2～4g，磷脂酰丝氨酸2～4g混合，搅拌均匀后加入缓冲剂醋酸，调节pH 值为5～6，以3～6mg/ml的戊二醛为交联剂进行交联处理，交联处理后于-80℃冷 冻机中冷冻10h，然后冷冻干燥至完全脱水。用0.1mol/l的Na2HPO4浸泡1h，再 用去离子水反复冲洗30min。清洗后用酒精反复脱水，再在真空状态下干燥，获得 直径为5mm，长20mm的圆柱状块体。孔径范围为165～205μm，孔隙率范围为84～ 87％。