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1、(10)申请公布号 CN 102631708 A (43)申请公布日 2012.08.15 CN 102631708 A *CN102631708A* (21)申请号 201210153430.8 (22)申请日 2012.05.17 A61L 27/36(2006.01) A61L 27/16(2006.01) (71)申请人 重庆市畜牧科学院 地址 400060 重庆市荣昌县昌元镇昌州中段 770 号 申请人 重庆市妇幼保健院 (72)发明人 葛良鹏 刘禄斌 张晓春 黄萍 (74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 赵荣之 (54) 发明名称 盆底补片复合生。
2、物材料的制备方法及其产品 (57) 摘要 本发明公开了盆底补片复合生物材料的制备 方法， 具体为， 将脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料在 压强至少为 100MPa 条件下处理至少 5 分钟 ； 其制 备方法简单， 使脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料结 合牢固， 交联过程中未使用化学交联剂， 无化学物 质残留 ； 还公开由该方法制得的盆底补片复合生 物材料及其应用， 经动物实验验证， 具有组织相容 性好， 无炎症反应的优点， 能够用于治疗盆腔脏器 脱垂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页。
3、 1/1 页 2 1. 盆底补片复合生物材料的制备方法， 其特征在于 ： 将脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料 在压强至少为 100MPa 条件下处理至少 5 分钟， 得盆底补片复合生物材料 ； 所述脱细胞基质凝胶是将脱细胞基质溶于醋酸溶液中， 经灭酶、 离心、 超滤、 透析所得。 2. 根据权利要求 1 所述盆底补片复合生物材料的制备方法， 其特征在于 ： 将脱细胞基 质凝胶与聚丙烯材料按重量比为 1-10:1 混合， 在压强为 100-200MPa 条件下处理 5-15 分 钟。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述盆底补片复合生物材料的制备方法， 其特征在于 ： 所述脱 细胞基质凝胶的制备方法，。
4、 具体为， 将脱细胞基质按 1g 脱细胞基质加 100mL 质量分数为 0.5% 醋酸溶液 ； 在温度为 4条件下将 pH 调至 7-7.4 灭活酶， 然后离心， 收集沉淀 ； 再将收 集的沉淀以 10 12 mg/ mL 溶解在质量分数为 0.5% 的醋酸中， 用孔径为 0 .45 m 的滤 膜过滤， 然后在 4条件下用浓度为 0 .001 mol/ L 醋酸溶液透析 2 次， 每次 24 小时， 得脱 细胞基质凝胶。 4. 根据权利要求 3 所述盆底补片复合生物材料的制备方法， 其特征在于 ： 所述脱细胞 基质的制备方法， 具体步骤如下 ： 取动物组织， 剪成块， 用水冲洗后进行消毒， 然。
5、后进行脱脂， 再浸入醋酸溶液中溶胀， 最 后进行匀浆， 得匀浆液 ； 将所得匀浆液用胃蛋白酶酶解 ； 然后用氯化钠盐析， 经离心后收集 沉淀， 得脱细胞基质。 5. 根据权利要求 4 所述盆底补片复合生物材料的制备方法， 其特征在于 ： 所述消毒是 用质量分数为 0.1% 的新洁尔灭， 消毒至少 15 分钟 ； 所述脱脂为将动物组织浸入脱脂液中， 在温度为 4， 搅拌至少 16 小时 ； 所述脱脂液是 乙醇 ： 异丙醇 ： 水体积比为 7 ： 4 ： 89 的混合物 ； 所述溶胀是加入相当于动物组织 1-10 倍重量的醋酸溶液， 在温度为 4条件下， 浸泡 24 小时 ； 所述酶解是加入相当于。
6、匀浆液体积10倍的醋酸溶液和相当于匀浆液重量1%的胃蛋白 酶， 在温度为 4条件下， 处理 48 小时 ； 所述盐析中氯化钠的终浓度为 2mol/L， 盐析时间为 2 小时。 6. 根据权利要求 5 所述盆底补片复合生物材料的制备方法， 其特征在于 ： 所述醋酸溶 液是质量分数为 0.5% 的醋酸溶液。 7. 根据权利要求 4-6 任一项所述盆底补片复合生物材料的制备方法， 其特征在于 ： 所 述动物组织为猪去粘膜层膀胱或猪去皮下组织皮肤。 8. 权利要求 1-7 任一项所述方法制备的盆底补片复合生物材料。 权 利 要 求 书 CN 102631708 A 2 1/6 页 3 盆底补片复合生物。
7、材料的制备方法及其产品 技术领域 0001 本发明涉及材料领域， 特别涉及盆底补片复合生物材料的制备方法， 还涉及由该 方法制得的产品。 背景技术 0002 女性盆腔脏器脱垂是一种常见病， 国内发病率约为 40并且逐年增加， 已成为严 重影响中老年妇女健康和生活质量的主要妇科问题。 临床目前广泛使用的聚丙烯合成材料 作为妇科盆底补片， 该补片虽然疗效确切， 但具有顺应性差、 组织侵蚀性强、 感染率高等缺 点， 并易导致性交痛等相关并发症。经研究表明猪脱细胞膀胱基质材料具有较好的生物相 容性和一定的抗菌性， 是一种理想的妇科盆底补片。但是猪脱细胞膀胱基质材料在体内降 解较快， 不能满足盆底补片的。
8、力学要求。利用夹心法制作的脱细胞膀胱基质 / 聚丙烯 / 脱 细胞膀胱基质复合生物材料， 将聚丙烯材料夹在两层脱细胞膀胱基质材料中间， 可以降低 由聚丙烯材料引起的炎症反应， 同时还可以增加脱细胞膀胱基质材料的力学特性。脱细胞 膀胱基质 / 聚丙烯 / 脱细胞膀胱基质复合生物材料与单纯聚丙烯材料相比， 炎症反应虽有 所降低， 但复合材料体积相对较大， 脱细胞膀胱基质与聚丙烯材料结合不紧密， 不利于操作 和临床使用。目前， 利用交联剂制备有机 / 无机复合生物材料虽在一定程度上能综合二者 之长， 但交联剂难以完全清除， 残余物在一定程度上会影响复合生物材料的生物学性能并 引起一系列的临床副作用。。
9、 因此， 急需一种盆底补片复合生物材料的制备方法， 该方法不使 用化学交联剂， 制得的复合生物材料具有聚丙烯材料相似的力学特性， 同时能降低聚丙烯 材料引起的炎症反应， 还具有体积小， 利于使用的优点。 发明内容 0003 有鉴于此， 本发明的目的之一在于提供盆底补片复合生物材料的制备方法， 其制 备方法简单， 不使用化学交联剂。 0004 为实现上述发明目的， 技术方案为 ： 盆底补片复合生物材料的制备方法， 将脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料在压强至少为 100MPa 条件下处理至少 5 分钟， 得盆底补片复合生物材料 ； 所述脱细胞基质凝胶是将脱细胞基质溶于醋酸溶液中， 经灭酶、 离心、 超滤。
10、、 透析所得。 0005 本发明中的脱细胞基质是指异体组织经细胞灭活处理后， 制备成无活体细胞存在的细 胞外基质成分和结构， 主要包括胶原、 弹性蛋白、 氨基葡糖糖、 结构蛋白等。因其无抗原性 , 以及良好的生物相容性， 成为组织工程支架材料的选择之一。本发明中使用的脱细胞基质 凝胶是将脱细胞基质溶于醋酸溶液中制得， 醋酸溶液可以为任意浓度， 为了便于下一步操 作， 最优为溶解在质量分数为 0.5% 的醋酸溶液中。 0006 本发明中脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料可以按任意比例混合， 以脱细胞基质凝胶 浸没聚丙烯材料为宜， 优选为将脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料按质量比为 1-10:1 混合， 在 说。
11、 明 书 CN 102631708 A 3 2/6 页 4 压强至少为 100-200MPa 条件下处理 5-15 分钟。 0007 优选的， 所述脱细胞基质的制备方法具体为， 将脱细胞基质按 1g 脱细胞基质加 100mL 质量分数为 0.5% 醋酸溶液 ； 在温度为 4条件下用 NaOH 将 pH 调至 7-7.4 灭活酶， 然 后在温度为 4、 转速为 8000rpm 条件下， 离心 15 分钟， 收集沉淀 ； 再将收集的沉淀以 10 12 mg/ mL溶解在质量分数为0.5%的醋酸中， 用孔径为0 .45 m 的滤膜过滤， 然后在4 条件下用浓度为 0 .001 mol/ L 醋酸溶液。
12、透析 2 次， 每次 24 小时， 得脱细胞基质凝胶。 0008 本发明中脱细胞基质可以按照现有技术中公开的制备方法制备， 也可以按照本发 明公开的方法制备， 优选为， 所述脱细胞基质的制备方法， 具体步骤如下 ： 取动物组织， 清洗 干净 ； 剪成块， 用水冲洗后进行消毒， 然后进行脱脂， 再浸入醋酸溶液中溶胀， 最后进行匀 浆， 得匀浆液 ； 将所得匀浆液用胃蛋白酶酶解 ； 然后用氯化钠盐析， 经离心后收集沉淀， 得 脱细胞基质。 0009 更优选的， 所述消毒是用质量分数为 0.1% 的新洁尔灭， 消毒至少 15 分钟 ； 所述脱脂为将动物组织浸入脱脂液中， 在温度为 4， 搅拌至少 1。
13、6 小时 ； 所述脱脂液是 乙醇 ： 异丙醇 ： 水体积比为 7 ： 4 ： 89 的混合物 ； 所述溶胀是加入相当于动物组织 1-10 倍的醋酸溶液， 在温度为 4条件下， 浸泡 24 小 时 ； 所述酶解是加入相当于匀浆液体积10倍的醋酸溶液和相当于匀浆液重量1%的胃蛋白 酶， 在温度为 4条件下， 处理 48 小时 ； 所述盐析中氯化钠的终浓度为 2mol/L， 盐析时间为 2 小时。 0010 更优选的， 所述醋酸溶液是质量分数为 0.5% 的醋酸水溶液。 0011 优选的， 所述动物组织为猪去粘膜层膀胱或猪去皮下组织皮肤。 0012 本发明目的之二在于提供由上述制备方法制得的盆底补片。
14、复合生物材料， 其炎症 反应小， 组织相容性好。 0013 为实现上述技术目的， 技术方案为 ： 所述方法制备的盆底补片复合生物材料。 0014 本发明有益效果在于 ： 本发明公开了盆底补片复合生物材料的制备方法， 其制备 方法简单， 采用物理方法， 利用高压使脱细胞基质凝胶和聚丙烯材料牢固的交联在一起， 不 需要使用化学交联剂， 因此无化学试剂残留， 同时交联后能够结合脱细胞基质凝胶和聚丙 烯的性质， 使制得的盆底补片复合生物材即具有聚丙烯材料的力学性质， 又与组织的相容 性好， 使用后无炎症反应 ； 可以用于治疗盆腔脏器脱垂， 治疗效果好， 无副作用。 具体实施方式 0015 以下将结合实。
15、施例对本发明进行详细的描述。 优选实施例中未注明具体条件的实 验方法， 通常按照常规条件。 0016 实施例 1 盆底补片复合生物材料的制备方法， 具体包括以下步骤 ： A制备脱细胞基质凝胶 取猪的新鲜膀胱， 用自来水清洗干净， 然后去表面粘膜层， 得猪去粘膜层膀胱 ； 将所得猪去粘膜层膀胱用剪刀剪成小块， 用纯水冲洗 3 遍， 然后用消毒液浸泡 15 分钟 说 明 书 CN 102631708 A 4 3/6 页 5 进行消毒， 其中消毒液为质量分数为 0.1% 新洁尔灭 ； 将消毒的膀胱组织浸入脱脂液中， 置于温度为 4条件下， 磁力搅拌 16 小时进行脱脂， 得脱脂膀胱组织 ； 其中脱脂。
16、液为乙醇 ： 异丙醇 ： 水按 7 ： 4 ： 89 混合 （体积比） ； 将所得脱脂膀胱组织用超纯水反复清洗 5 次， 用相当于猪去粘膜层膀胱重量 1 倍的质 量分数为0.5%醋酸溶液溶胀脱脂膀胱组织， 在温度为4条件下， 浸泡24小时， 得溶胀膀胱 组织 ； 将所得溶胀膀胱组织用匀浆机匀浆， 得匀浆液 ； 将所得匀浆液加入相当于猪去粘膜层膀胱重量10倍的质量分数为0.5%的醋酸溶液和 相当于猪去粘膜层膀胱重量 1% 的胃蛋白酶， 在温度为 4条件下， 酶解 48 小时， 得酶解液 ； 将所得酶解液过滤， 收集滤液， 向滤液中加入氯化钠至氯化钠终浓度为 2mol/L， 盐析 2 小时 ； 将。
17、盐析液， 在温度为 4、 转速为 8000rpm 条件下， 离心 15 分钟， 收集沉淀， 得脱细胞 基质 ； 最后将所得脱细胞基质按 1g 脱细胞基质加 100mL 质量分数为 0.5% 醋酸溶液 ； 在温度 为 4条件下用 NaOH 将 pH 调至 7.4 灭活酶， 然后在温度为 4、 转速为 8000rpm 条件下， 离 心 15 分钟， 收集沉淀 ； 再将收集的沉淀以 10 mg/ mL 再溶解在 0.5% 的醋酸中， 用孔径为 0 .45 m 的滤膜过滤， 然后在4条件下用浓度为0 .001 mol/ L 醋酸溶液透析2次， 每次 24 小时， 最后得脱细胞基质凝胶。 0017 B.。
18、 制备复合生物材料 取聚丙烯材料和步骤 A 所得脱细胞基质凝胶按重量比为 1:1 加入铝箔袋内， 排除空气 进行密封 ； 在压强为 100 MPa 条件下处理 15 分钟 ； 处理的铝膜袋在超净台内， 用无菌生理 盐水洗脱 3 次， 去除未交联的材料， 干燥， 得盆底补片复合生物材料 ； 其中 100 MPa 压强由 HPP.L3-600/0.6 超高压设备提供 （天津市华泰森淼生物工程技术有限公司） 。 0018 盆底补片复合生物材料体内植入评价 选取雌性大鼠 20 只， 平均分成两组， 分别将聚丙烯材料和制得的盆底补片复合生物材 料分别植入大鼠阴道粘膜下层。植入后 1、 2、 3、 4 周。
19、， 观察小鼠阴道局部反应， 并分别取材料 和周围组织进行免疫组化染色， 染色指标分别为， 染色指标分别为免疫因子 CD4、 免疫因子 CD8、 趋化因子受体 CCR4 和 CXC 趋化因子受体 3CXCR3， 结果如表 1 所示。 0019 表 1. 免疫组化染色结果 说 明 书 CN 102631708 A 5 4/6 页 6 结果表明， 植入 2 周后， 聚丙烯材料组未与植入周围组织融合， 界限分明， 有轻微炎症 反应 ； 植入 4 周后， 聚丙烯材料组表现为局部有结痂出现 ； 而盆底补片复合生物材料在植入 4周后， 表现为表面轻微淡黄， 组织相容性好， 与周围组织镶嵌长在一起。 并且能够。
20、有效降低 CD4， CD8 等阳性率， 并抑制 Th1 细胞的分化， 从而降低 CXCR3 的阳性率 ； 同时诱导 Th2 细胞 分化， 增加 CCR4 受体数量， 促进植入后的复合材料走向移植接受或适应。 0020 实施例 2 盆底补片复合生物材料的制备方法， 具体包括以下步骤 ： A. 制备脱细胞基质凝胶 取猪的新鲜皮肤， 用自来水清洗干净， 然后用剖层机去除皮下组织， 得猪去皮下组织皮 肤 ； 将所得猪去皮下组织皮肤用剪刀剪成小块， 用纯水冲洗 5 遍， 然后用消毒液浸泡 20 分 钟进行消毒， 其中消毒液为质量分数为 0.1% 新洁尔灭 ； 将所得消毒的猪皮肤组织浸入脱脂液中， 置于温。
21、度为 4条件下， 磁力搅拌 18 小时进 行脱脂， 得脱脂猪皮肤组织 ； 其中脱脂液为乙醇 ： 异丙醇 ： 水按为 7 ： 4 ： 89（体积比） 混合 ； 将所得脱脂猪皮肤组织用超纯水反复清洗3次， 用相当于猪去皮下组织重量10倍的质 量分数为0.5%醋酸溶液浸没脱脂猪皮肤组织， 在温度为4条件下， 浸泡30小时进行溶胀， 得溶胀猪皮肤组织 ； 将所得溶胀猪皮肤组织用匀浆机匀浆， 得匀浆液 ； 将所得匀浆液加入相当于猪去皮下组织皮肤重量10倍的质量分数为0.5%的醋酸溶液 和相当于猪去皮下组织皮肤重量1%的胃蛋白酶， 在温度为4条件下， 酶解48小时， 得酶解 液 ； 将所得酶解液过滤， 收。
22、集滤液， 向滤液中加入氯化钠至氯化钠终浓度为 2mol/L， 盐析 2 小时 ； 然后在温度为 4、 转速为 8000rpm 条件下， 离心 15 分钟， 收集沉淀， 得脱细胞基质 ； 说 明 书 CN 102631708 A 6 5/6 页 7 最后将所得脱细胞基质按 1g 脱细胞基质加 100mL 质量分数为 0.5% 醋酸溶液 ； 在 4 条件下用 NaOH 将 pH 调至 7， 然后在温度为 4、 转速为 8000rpm 条件下， 离心 15 分钟， 收集 沉淀 ； 再将收集的沉淀以12 mg/ mL 再溶解在0.5%的醋酸中， 用孔径为0 .45 m 的滤膜 过滤， 然后在 4条件下。
23、用 0 .001 mol/ L 醋酸溶液透析 2 次， 每次 24 小时， 最后得脱细胞 基质凝胶。 0021 B. 制备复合生物材料 取聚丙烯材料和步骤A所得脱细胞基质凝胶按重量比为1:10加入铝箔袋内， 排除空气 进行密封 ； 在压强为 200 MPa 条件下处理 5 分钟 ； 将处理后的铝膜袋在超净台内， 用无菌生 理盐水洗脱 3 次， 去除未交联的材料， 干燥， 得盆底补片复合生物材料 ； 其中 200 MPa 压强 由 HPP.L3-600/0.6 超高压设备提供 （天津市华泰森淼生物工程技术有限公司） 。 0022 盆底补片复合生物材料体内植入评价 选取雌性大鼠 20 只， 平均分。
24、成两组， 分别将聚丙烯材料和制得的盆底补片复合生物材 料分别植入大鼠阴道粘膜下层。植入后 1、 2、 3、 4 周， 观察小鼠阴道局部反应， 并分别取材料 和周围组织进行免疫组化染色， 染色指标分别为免疫因子 CD4、 免疫因子 CD8、 趋化因子受 体 4 CCR4 和 CXC 趋化因子受体 3 CXCR3， 结果如表 2 所示。 0023 表 2. 免疫组化染色结果 结果表明， 植入 2 周后， 使用聚丙烯材料的大鼠聚丙烯材料未与植入周围组织融合， 植入 4 周后， 使用聚丙烯材料的大鼠局部有结痂出现 ； 而植入盆底补片复合生物材料在植 入 4 周后， 表面呈轻微淡黄， 组织相容性好， 与。
25、周围组织镶嵌长在一起。免疫染色结果表明， 猪皮胶原与聚丙烯复合材料可有效降低CD4和CD8的阳性率， 并抑制Th1细胞 （CXCR3阳性） 的分化， 同时诱导 Th2 细胞 （CCR4） 分化， 促进植入后的复合材料走向移植接受或适应。 0024 本发明中除了可以用猪膀胱和猪的新鲜皮肤制备细胞外基质溶液， 还可以用心包 说 明 书 CN 102631708 A 7 6/6 页 8 膜、 小肠粘膜、 胆囊等组织按照同样的方法制备。 0025 最后说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述， 但本领域的普通技术人员应当理解， 可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。 说 明 书 CN 102631708 A 8 。