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1、(10)授权公告号 CN 103316378 B (45)授权公告日 2014.07.16 CN 103316378 B (21)申请号 201310271920.2 (22)申请日 2013.06.27 A61L 27/22(2006.01) A61L 27/18(2006.01) (73)专利权人 重庆大学 地址 400044 重庆市沙坪坝区沙正街 174 号 (72)发明人 吕永钢 林崇文 邹杨 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 CN 102580160 A,2012.07.18, 说明书第 0008-0040 段 . CN 1671742。
2、 A,2005.09.21, 摘要、 说明书第 3 页倒数第 3 段至第 5 页第 1 段 . US 2009/0202500 A1,2009.08.13, 全文 . CN 101693024 A,2010.04.14, 全文 . CN 102172515 A,2011.09.07, 全文 . (54) 发明名称 一种 HMGB 1 修饰的骨组织工程支架材料及 其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种 HMGB 1 修饰的骨组织工 程支架材料及其制备方法。以通过静电纺丝技术 制作 PLLA 纳米纤维支架作为基质， 利用肝素 (2) 和交联分子 Di-NH2-PEG 将信号分子 HMGB1 。
3、交联到 PLLA 纳米纤维支架上， 得到 HMGB1 修饰的骨组织 工程支架材料。该发明利用一种信号分子实现促 细胞招募、 侵润和迁移多种功能， 具有良好的生物 相容性， 可复合干细胞也可直接应用于骨组织修 复， 而且工艺简单可行， 可重复性好。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 周丹 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103316378 B CN 103316378 B 1/1 页 2 1. 一种制备 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料的制。
4、备方法， 包括下述步骤 ： 1) 利用静电纺丝技术制备聚 L- 乳酸 (Poly L-lactic acid,PLLA) 纳米纤维支架 ； 2) 将步骤 1) 得到的 PLLA 纳米纤维支架浸泡在 70-75的乙醇溶液中杀菌， 然后使用 磷酸盐缓冲液 (Phosphate buffered saline,PBS) 冲洗 3 遍， 每遍 5min， 再浸泡于 0.01N NaOH 中 10min 以增加表面反应羧基基团 ； 3) 用 PBS 冲洗 PLLA 纳米纤维支架 3 遍， 每遍 5min， 再使用蒸馏水冲洗 PLLA 纳米纤维 支架 3 遍， 每遍 5min ； 4) 配制 20mg/m。
5、L1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐 (N-(3-Dimethylamino propyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride crystalline,EDC) 和 10mg/mL N- 羟基硫 代琥珀酰亚胺 (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt,sulfo-NHS) 的溶液备用 ； 5) 将 PLLA 纳米纤维支架浸泡于步骤 4) 得到的溶液中 30min， 再用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min ； 6)配制含20mg/mL EDC、 10mg/mL sulfo-NHS和20mg/mL聚乙二。
6、醇双胺(Poly(ethylene glycol)bis(amine),Di-NH2-PEG) 的溶液备用 ； 7) 将 PLLA 纳米纤维支架浸泡于步骤 6) 得到的溶液中 30min， 再用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min ； 8) 配制含 100mg/mL EDC 和 50mg/mL sulfo-NHS 的溶液备用 ； 9) 配制 25mg/mL 肝素 (2) 的溶液备用 ； 10) 将步骤 8) 和步骤 9) 得到的溶液按照 1:4 的比例混合， 充分混匀， 使用 1N NaOH 将 混合溶液的 PH 调整为 7 ； 11) 将 PLLA 纳米纤维支架浸泡于步骤 10) 得到的。
7、溶液中 3-4h， 用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min ； 12) 配制质量浓度为 1的甘氨酸溶液备用 ； 13) 将 PLLA 纳米纤维支架浸泡于步骤 12) 得到的溶液中 30min， 用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min ； 14)配制浓度为100-1000ng/mL高迁移率族蛋白1(High mobility group box1,HMGB1) 溶液备用 ； 15) 将 PLLA 纳米纤维支架浸泡于步骤 14) 得到的溶液中 12h， 用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min。 2.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于 ： 步骤15)所述的浸泡过程在4条件下 进行。。
8、 3.一种根据权利要求1的方法制备的HMGB1修饰的骨组织工程支架材料， 由PLLA纳米 纤维支架和 HMGB1 构成， 其特征在于 ： 通过交联分子 Di-NH2-PEG 将肝素和 PLLA 纳米纤维连 接， 信号分子 HMGB1 交联在肝素上。 4. 如权利要求 3 所述的 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料， 其特征在于 ： 所述 PLLA 纳 米纤维支架中纳米纤维 (4) 为各向同性或平行， 或者内层纳米纤维平行排列而外层纳米纤 维各向同性。 权 利 要 求 书 CN 103316378 B 2 1/4 页 3 一种 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料及其制备方法 技术领域 000。
9、1 本发明涉及一种骨组织工程支架材料及其制备方法， 特别是一种 HMGB1 修饰的纳 米纤维骨修复支架及其制备方法。 背景技术 0002 组织工程学方法是目前修复骨缺损的常用方法， 构建理想的骨缺损组织工程支架 是其中的关键环节之一。理想的骨组织工程支架应该包含以下性质 ： 良好的生物相容性 ； 在新形成的组织能够保持功能前， 能提供一定的力学强度和整体性 ； 具有骨传导及骨诱导 能力 ； 具有相互连通的三维多孔微结构以及适当的孔径使细胞 / 干细胞能够在材料上黏 附、 增殖和分化 ； 在组织重塑过程中材料可吸收 ； 骨细胞外基质和血管可在材料上生长。通 过静电纺丝技术制备的纳米纤维基质因诸多。
10、优点得到了广泛应用， 可使用多种材料， 设备 简单， 成本低廉。所得纳米纤维结构与组织细胞外基质相似， 能够为骨相关细胞 ( 包括干细 胞 ) 的黏附和生长提供有利的微环境， 促进细胞成骨分化和矿化。Yoshimoto 和同事使用 静电纺丝技术制备了聚己内酯 (Poly(e-caprolactone),PCL) 纳米纤维骨组织支架， 并将 骨髓间充质干细胞种于材料上， 发现支架上有细胞侵润和丰富的细胞外基质。培养 4 周后， 可以观察到矿化作用和型胶原， 说明支架适合用于骨组织工程修复 (Yoshimoto H,Shin YM,Terai H,Vacanti JP.A biodegradabl。
11、e nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering.Biomaterials.2003;24(12):2077-82.)。 Fujihara 和同事们则使用静电纺丝技术制备了 PCL/CaCO3纳米纤维骨修复支架， 发现成骨 细胞在该支架上可以很好地粘附和增殖， 且该支架相比 PCL 支架能够促进成骨细胞的增殖 (Fujihara K,Kotaki M,Ramakrishna S.Guided bone regeneration membrane made of polyca。
12、prolactone/calcium carbonate composite nano-fibers.Biomaterials.2005;26( 19):4139-47.)。 然而， 理想骨组织工程支架的制备仍然存在很大困难。 例如， 静电纺丝技术 制备的纳米纤维支架在纤维直径到达一定程度后材料孔径不利于细胞向材料内部侵润和 迁移， 对修复过程调控的能力也非常有限。 能同时促进细胞招募、 侵润和迁移的骨组织工程 支架更是少见。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题是构建一种交联高迁移率族蛋白 1(High mobility group box1,HMGB1) 修饰的骨修复纳米纤维支架， 。
13、目的是在满足一般骨组织工程纳米纤维 支架要求基础上， 进一步促进细胞招募、 侵润和迁移。 0004 为解决上述技术问题， 本发明的 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料由聚 L- 乳酸 (Poly L-lactic acid,PLLA) 纳米纤维支架和 HMGB1 构成 ； 其特征在于， 利用静电纺丝技 术制备 PLLA 纳米纤维支架， 通过肝素和交联分子聚乙二醇双胺 (Poly(ethylene glycol) bis(amine),Di-NH2-PEG) 将信号分子 HMGB1 交联到纳米纤维支架上， 形成 HMGB1 修饰的骨 组织工程支架材料， 以促进细胞招募、 侵润和迁移。 说 明 。
14、书 CN 103316378 B 3 2/4 页 4 0005 本发明中， PLLA 纳米纤维支架可采用常规的静电纺丝的方法制备， 静电纺丝过程 中可根据需要调节滚筒转速、 电压强度和注射速度等参数， 获得各向同性或平行的纳米纤 维支架， 也可获得内层纳米纤维平行排列而外层纳米纤维各向同性的纳米纤维支架。PLLA 纳米纤维支架中纤维直径控制在 0.1-1m， 具有三维微孔结构和良好的联通性。 0006 本发明还提供所述的 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料的制备方法， 具体步骤如 下 ： 0007 1) 利用静电纺丝技术制备 PLLA 纳米纤维支架 ； 0008 2)将步骤1)得到的PLLA。
15、纳米纤维支架浸泡在70-75%的乙醇溶液中杀菌， 然后使 用磷酸盐缓冲液 (Phosphate buffered saline,PBS) 冲洗 3 遍， 每遍 5min， 再浸泡在 0.01N NaOH 中 10min 以增加表面反应羧基基团 ； 0009 3) 先用 PBS 冲洗 PLLA 纳米纤维支架 3 遍， 每遍 5min， 再使用蒸馏水冲洗 PLLA 纳 米纤维支架 3 遍， 每遍 5min ； 0010 4) 配制 20mg/mL1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐 (N-(3-Dimethyla minopropyl)-N-ethylcarbodiimide h。
16、ydrochloride crystalline,EDC) 和 10mg/mL N- 羟 基硫代琥珀酰亚胺 (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt,sulfo-NHS) 的溶液备用 ； 0011 5) 将 PLLA 纳米纤维支架浸泡于步骤 4) 得到的溶液中 30min， 再用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min ； 0012 6)配制含20mg/mL EDC、 10mg/mL sulfo-NHS和20mg/mL聚乙二醇双胺Di-NH2-PEG 的溶液备用 ； 0013 7) 将 PLLA 纳米纤维支架浸泡于步骤 6) 得到的溶液中 30min， 再用。
17、 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min ； 0014 8) 配制含 100mg/mL EDC 和 50mg/mL sulfo-NHS 的溶液备用 ； 0015 9) 配制 25mg/mL 肝素的溶液备用 ； 0016 10)将步骤8)和步骤9)得到的溶液按照1:4的比例混合， 充分混匀， 使用1N NaOH 将混合溶液的 PH 调整为 7 ； 0017 11) 将 PLLA 纳米纤维支架浸泡于步骤 10) 得到的溶液中 3-4h， 用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min ； 0018 12) 配制质量浓度为 1% 的甘氨酸溶液备用 ； 0019 13) 将 PLLA 纳米纤维支架浸泡于步。
18、骤 12) 得到的溶液中 30min， 用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min ； 0020 14) 配制浓度为 100-1000ng/mL HMGB1 溶液备用 ； 0021 15) 将 PLLA 纳米纤维支架浸泡于步骤 14) 得到的溶液中 12h， 用 PBS 冲洗 3 遍， 每 遍 5min。 0022 优选地， 步骤1)所述的PLLA纳米纤维支架制备方法， 是以六氟异丙醇为溶剂配制 质量浓度为 8-20% 的 PLLA 溶液， 以磁力搅拌器充分搅拌后备用。吸 3-4mL 上述溶液于医 用注射器中， 静电纺丝滚筒接收器上包裹一层锡纸， 调节滚筒转速为 20-800r/min、 电压。
19、强 度为 14-15kV， 以 0.9-1.5mL/h 的注射速度将 PLLA 溶液电纺到滚筒接收器的锡纸上， 获得 PLLA 纳米纤维薄膜， 将薄膜从锡纸上取下静置 24h 得到 PLLA 纳米纤维支架备用。 0023 优选地， 步骤1)所述的PLLA纳米纤维支架制备成纤维直径为0.3-0.5m， 孔隙率 说 明 书 CN 103316378 B 4 3/4 页 5 为 80%-95%。 0024 优选地， 步骤4)、 6)、 8)和9)所述的溶液以PH为5.5、 浓度为0.5mol/L的2-(N-吗 啉代 ) 乙磺酸溶液作为溶剂。 0025 优选地， 步骤 12) 所述的甘氨酸溶液以 PB。
20、S 作为溶剂。 0026 优选地， 步骤 14) 所述的 HMGB1 溶液以 PBS 作为溶剂。 0027 优选地， 步骤 15) 所述的浸泡过程在 4条件下进行。 0028 综上所述， 本发明的 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料是在静电纺丝技术制备 PLLA 纳米纤维支架上利用肝素和 Di-NH2-PEG 交联 HMGB1 获得的。与现有的骨组织工程支 架材料相比， 交联了HMGB1的PLLA纳米纤维支架可促进细胞招募、 侵润和迁移， 克服了大多 数骨组织工程支架材料在骨诱导功能上的缺陷， 这也是本发明提出的关键。本发明提供的 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料具有良好的生物相容性， 。
21、以 HMGB1 作为信号分子， 充分利 用它在细胞招募、 侵润和迁移上的促进作用， 加速骨组织修复速度和质量。同时， 将 HMGB1 蛋白固定于材料表面， 有利于保持蛋白的结构和功能性。本发明提供的 HMGB1 修饰的骨组 织工程支架材料可不预种种子细胞， 直接用于骨缺损部位 ； 也可以先复合骨髓间充质干细 胞等种子细胞， 再植入骨缺损部位。用于制备 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料的纳米纤 维支架可选择不同材料， 只要满足所要修复骨的要求即可。 为简洁起见， 本发明主要以PLLA 纳米纤维支架为例加以阐述， 其他材料也可以采用相同的原理。 附图说明 0029 图 1 是本发明提供的 HM。
22、GB1 修饰的骨组织工程支架材料的 HMGB1 交联示意图 ； 0030 图 2 是本发明提供的 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料的扫描电子显微镜图 ； 0031 图 3 是本发明提供的 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料的 HMGB1 免疫荧光图。 0032 其中 ： 1、 HMGB1 ； 2、 肝素 ； 3、 Di-NH2-PEG ； 4、 纳米纤维。 具体实施方式 0033 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0034 图 1 为本发明提供的 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料的 HMGB1 交联示意图。采 用常规的静电纺丝的方法制备 PLLA 纳米纤维支架，。
23、 通过肝素 2 和交联分子 Di-NH2-PEG 将 信号分子 HMGB1 交联到 PLLA 纳米纤维支架中的纳米纤维 4 上。 0035 以六氟异丙醇为溶剂配制质量分数为8-20%的PLLA溶液， 置于磁力搅拌器中搅拌 均匀。使用 10mL 规格医用注射器吸取 3-4mL PLLA 溶液， 然后将该注射器安装于注射泵中。 根据滚筒接收器的大小裁减一块矩形锡纸， 固定于滚筒收集器表面， 开启滚筒使其转动， 设 置转速为 20-800r/min。开启高压电源， 调节电压强度为 14-15kV。设置 PLLA 溶液的注射 速度为 0.9-1.5mL/h， 使得溶液在静电场中喷出细丝， 沉积在滚动的。
24、滚筒收集器上， 轻轻地 将沉积在锡纸上的纳米纤维薄膜取下， 静置24h， 得到PLLA纳米纤维支架。 图2为本发明提 供的 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料的扫描电子显微镜图。静电纺丝过程中可根据需要 调节滚筒转速、 电压强度和注射速度等参数， 使纳米纤维支架中纳米纤维 4 为各向同性或 平行， 或者内层纳米纤维 4 平行排列而外层纳米纤维 4 各向同性。 0036 将 PLLA 纳米纤维支架裁减为 0.5-5cm0.5-5cm 矩形薄膜， 先浸泡在 70-75% 的乙 说 明 书 CN 103316378 B 5 4/4 页 6 醇溶液中以杀灭细菌， 再使用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍。
25、 5min， 然后将上述支架浸泡在 0.01N NaOH 中 10min 以增加表面反应羧基基团。使用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min， 随后使用蒸馏水冲洗 3 遍， 每遍 5min。以 PH 为 5.5、 浓度为 0.5mol/L 的 2-(N- 吗啉代 ) 乙磺酸溶液作为溶剂配 制 20mg/mL EDC 和 10mg/mL sulfo-NHS 的溶液， 将上述 PLLA 纳米纤维支架浸泡于此溶液中 30min， 再使用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min。以 PH 为 5.5、 浓度为 0.5mol/L 的 2-(N- 吗啉代 ) 乙磺酸溶液作为溶剂配制 20mg/mL ED。
26、C、 10mg/mL sulfo-NHS 和 20mg/mL Di-NH2-PEG 的溶 液， 将纳米纤维浸泡于上述溶液中 30min， 使用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min。以 PH 为 5.5、 浓度 为 0.5mol/L 的 2-(N- 吗啉代 ) 乙磺酸溶液作为溶剂分别配制含 100mg/mL EDC 和 50mg/mL sulfo-NHS 的溶液以及含 25mg/mL 肝素 2 的溶液。将上述两种溶液按照 1:4 的比例混合， 于摇床上摇晃 30min 充分混匀， 用 1N NaOH 将上述混合溶液的 PH 调整为 7。将 PLLA 纳米 纤维支架浸泡于上述混合溶液中 3-4。
27、h， 使用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min。配制质量浓度为 1% 的甘氨酸溶液， 将 PLLA 纳米纤维浸泡于上述溶液中 30min， 使用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min。 配制浓度为 500ng/mL HMGB1 溶液， 将 PLLA 纳米纤维浸泡于此溶液中 12h， 使用 PBS 冲洗 3 遍， 每遍 5min， 得到 HMGB1 修饰的 PLLA 纳米纤维支架。图 3 是本发明提供的 HMGB1 修饰的 骨组织工程支架材料的 HMGB1 免疫荧光图， 其中发出亮光的部分表示共价结合于纳米纤维 上的 HMGB1 蛋白。 0037 本发明提供的 HMGB1 修饰的骨组织工程支架材料是利用肝素和 Di-NH2-PEG 将 HMGB1 交联到静电纺丝技术制备的 PLLA 纳米纤维支架上获得的。利用 HMGB1 对细胞招募、 侵润和迁移的多种促进功能， 加速骨组织修复速度和质量。 制备方法简单且成本低， 相比以 往的三维骨组织工程支架材料有明显的优势。 说 明 书 CN 103316378 B 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103316378 B 7 。