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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510812829.6 (22)申请日 2015.11.20 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105396174 A (43)申请公布日 2016.03.16 (73)专利权人 广西中医药大学 地址 530213 广西壮族自治区南宁市青秀 区五合大道13号 (72)发明人 李培源 苏炜 霍丽妮 陈睿 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 靳浩 (51)Int.Cl. A61L 27/06(2006.01) A。
2、61L 27/20(2006.01) A61L 27/54(2006.01) (56)对比文件 CN 104826159 A,2015.08.12, CN 104402939 A,2015.03.11, 审查员 郭翔 (54)发明名称 一种制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳 米管的方法 (57)摘要 本发明公开了一种制备具有抗菌抗癌性能 的二氧化钛纳米管的方法。 该方法包括步骤如 下： 1)制备铱配合物； 2)将环糊精0.1-0.6重量份 溶于3.5-20重量份的水中， 搅拌均匀后， 加入二 氧化钛纳米管0.5-1.5重量份， 浸泡20-60min； 3) 加入铱配合物0.2-1.2重量份， 然。
3、后用15-30kHz 超声波30-60min； 4)取出二氧化钛纳米管， 干燥。 本方法通过环糊精与铱配合物对二氧化钛纳米 管的作用， 不但使得二氧化钛纳米管具有良好的 抗菌和抗癌性能， 而且使得二氧化钛纳米管的表 面利于骨细胞的生长， 减少二氧化钛纳米管在骨 整合手术中并发症的发病率， 给骨整合手术提供 更安全可靠的材料。 权利要求书2页 说明书9页 CN 105396174 B 2018.06.29 CN 105396174 B 1.一种制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳米管的方法， 其特征在于， 包括步骤如下： 1)将间羧基苯甲醛3-5重量份溶于甲苯8-15重量份中， 加入1-(9-蒽基)。
4、乙醇5-15重量 份， 然后加入浓度为98的硫酸0.5-1.5重量份， 加热到100-120搅拌回流1-3h， 将滤液旋 干， 然后加入乙酸乙酯5-10重量份萃取， 重复2-4次乙酸乙酯萃取过程， 然后合并乙酸乙酯 层溶液， 加入无水碳酸钾10-15重量份并旋干， 得到具有式(1)的化合物， 即间蒽氧酰基苯甲 醛； 2)将间蒽氧酰基苯甲醛4-10重量份溶于10-20重量份的无水乙醇中， 并加入硫代氨基 脲1-5份， 60-70回流搅拌5-8h得到微紫色溶液， 旋干后加入乙醇5-10重量份和正己烷5- 10重量份， 析出白色晶体为具有式(2)的化合物， 即间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲； 3)将间。
5、蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲0.01-0.05重量份和二氯(五甲基环戊二烯基)合 铱(III)二聚体0.01-0.06重量份加入CH2Cl2 5-8重量份， 常温搅拌8-12小时， 将溶液减压蒸 馏， 静置析出橙色固体， 得到具有式(3)的铱配合物， 即一氯一间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨 基脲一五甲基环戊二烯基合铱(III)； 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 105396174 B 2 4)将环糊精0.1-0.6重量份溶于3.5-20重量份的水中， 搅拌均匀， 然后加入二氧化钛纳 米管0.5-1.5重量份， 浸泡20-60min； 5)加入所述铱配合物0.2-1.2重量份， 然后用15-3。
6、0kHz超声波30-60min； 6)取出二氧化钛纳米管并将二氧化钛纳米管干燥。 2.根据权利要求1所述的制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳米管的方法， 其特征在 于， 在所述步骤5)中加入铱配合物后进行5000rpm离心5-10min， 再超声波处理。 3.根据权利要求1所述的制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳米管的方法， 其特征在 于， 步骤6)所述的干燥为红外线干燥。 4.根据权利要求1-3任一项所述的制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳米管的方法， 其特征在于， 步骤4)中， 所述环糊精为 -环糊精， 所述水的温度为50。 5.根据权利要求4所述的制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳米管的方法， 。
7、其特征在 于， 所述步骤6)中干燥温度为100-120， 干燥22-24h。 6.根据权利要求5所述的制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳米管的方法， 其特征在 于， 所述二氧化钛纳米管的管径为5-10nm， 管长为50-80nm。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 105396174 B 3 一种制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳米管的方法 技术领域 0001 本发明涉及骨整合手术用材的技术领域， 更具体地是一种制备具有抗菌抗癌性能 的二氧化钛纳米管的方法。 背景技术 0002 -环糊精是一类由6个D-吡喃葡萄糖单元通过 -1， 4糖苷键首尾相连形成的大环 化合物。 其分子内部为一个呈 “。
8、V” 字型的疏水性空穴， 表现出独特的分子识别能力。 二氧化 钛纳米管具有可促进成骨细胞生成的作用， 在作为植入体应用方面展现了巨大的潜力和优 势。 但是， 面临的一个严重问题是相关的细菌感染问题， 导致了大量移植手术的失败。 如何 得到性能更为优良的二氧化钛纳米管材料成为一个具有很大科学意义和应用意义的研究 方向。 我们在研究中发现， 一些铱配合物具有很好的抗菌能力， 如果能将具有特殊生理性能 的铱配合物用于修饰二氧化钛纳米管， 有望得到性能更为优良的二氧化钛纳米管材料。 但 是部分铱配合物的水溶性较差， 如果将其直接引入二氧化钛纳米管表面， 需要使用较多的 有机溶剂， 对环境产生污染， 而。
9、且可能有溶剂残留在二氧化钛纳米管上， 对病人产生危险。 环糊精具有外亲水、 内疏水的特点， 将水溶性差的铱配合物和环糊精结合， 提高其水溶性， 可以解决该污染问题。 发明内容 0003 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷， 并提供至少后面将说明的优 点。 0004 本发明还有一个目的就是提供一种利用 -环糊精将水溶性差的铱配合物引入二 氧化钛纳米管表面提高二氧化钛纳米管抗菌作用的方法， 使得二氧化钛纳米管不但具有良 好的抗菌和抗癌性能， 而且使得二氧化钛纳米管的表面利于骨细胞的生长， 减少二氧化钛 纳米管在骨整合手术中并发症的发病率， 给骨整合手术提供更安全可靠的材料。 0005 为。
10、了实现根据本发明的这些目的和其他优点， 提供了一种制备具有抗菌抗癌性能 的二氧化钛纳米管的方法， 包括以下步骤： 0006 1)将间羧基苯甲醛3-5重量份溶于甲苯8-15重量份中， 加入1-(9-蒽基)乙醇5-15 重量份， 然后加入浓度为98的硫酸0.5-1.5重量份， 加热到100-120搅拌回流1-3h， 将滤 液旋干， 然后加入乙酸乙酯5-10重量份萃取， 重复2-4次乙酸乙酯萃取过程， 然后合并乙酸 乙酯层溶液， 加入无水碳酸钾10-15重量份并旋干， 得到具有式(1)的化合物， 即间蒽氧酰基 苯甲醛； 说 明 书 1/9 页 4 CN 105396174 B 4 0007 0008。
11、 2)将间蒽氧酰基苯甲醛4-10重量份溶于10-20重量份的无水乙醇中， 并加入硫代 氨基脲1-5份， 60-70回流搅拌5-8h得到微紫色溶液， 旋干后加入乙醇5-10重量份和正己 烷5-10重量份， 析出白色晶体为具有式(2)的化合物， 即间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲； 0009 0010 3)将间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲0.01-0.05重量份和二氯(五甲基环戊二烯 基)合铱(III)二聚体0.01-0.06重量份加入CH2Cl2 5-8重量份， 常温搅拌8-12小时， 将溶液 减压蒸馏， 静置析出橙色固体， 得到具有式(3)的铱配合物， 即一氯一间蒽氧酰基苯甲醛缩 硫代氨基脲一五甲基。
12、环戊二烯基合铱(III)； 0011 0012 4)将环糊精0.1-0.6重量份溶于3.5-20重量份的水中， 搅拌均匀， 然后加入二氧化 钛纳米管0.5-1.5重量份， 浸泡20-60min； 0013 5)加入所述铱配合物0.2-1.2重量份， 然后用15-30kHz超声波30-60min； 0014 6)取出二氧化钛纳米管并将二氧化钛纳米管干燥。 说 明 书 2/9 页 5 CN 105396174 B 5 0015 优选的是， 在所述步骤5)中加入铱配合物后进行5000rpm离心5-10min， 再超声波 处理。 0016 优选的是， 步骤6)所述的干燥为红外线干燥。 0017 优选的。
13、是， 步骤4)中， 所述环糊精为 -环糊精， 所述水的温度为50。 0018 优选的是， 所述步骤6)中干燥温度为100-120， 干燥22-24h。 0019 优选的是， 所述二氧化钛纳米管的管径为5-10nm， 管长为50-80nm。 0020 本发明至少包括以下有益效果： 0021 1.本发明的铱配合物含有蒽氧酰基， 有大共轭体系， 分子更稳定； 硫代氨基脲有许 多生物活性， 得到的铱配合物具有良好的生物活性。 0022 2.本发明的 -环糊精原料易得， 分子内部为一个呈 “V” 字型的疏水性空穴， 内腔高 度为0.79nm， 直径为0.47nm， 适合容纳本发明的铱配合物进入。 该铱配。
14、合物水溶性很差， 通 过超声使不溶于水的铱配合物均匀分散并进入二氧化钛纳米管中的 -环糊精疏水性空穴， 在这样的体系中铱配合物的抗菌和抗癌效果更持久。 该处理方法不仅简单， 而且所使用的 溶剂为水， 绿色， 环保。 具体实施方式 0023 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明， 以令本领域技术人员参照说明书 文字能够据以实施。 0024 实施例1 0025 本方案制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳米管的方法， 包括以下步骤： 0026 1)将间羧基苯甲醛4重量份溶于甲苯12重量份中， 加入1-(9-蒽基)乙醇10重量份， 然后加入浓度为98的硫酸1重量份， 加热到110搅拌回流2h， 将滤液。
15、旋干， 然后加入乙酸 乙酯8重量份萃取， 重复3次乙酸乙酯萃取过程， 然后合并乙酸乙酯层溶液， 加入无水碳酸钾 12重量份并旋干， 得到具有式(1)的化合物， 即间蒽氧酰基苯甲醛； 0027 0028 2)将间蒽氧酰基苯甲醛5重量份溶于15重量份的无水乙醇中， 并加入硫代氨基脲3 份， 65回流搅拌6h得到微紫色溶液， 旋干后加入乙醇8重量份和正己烷6重量份， 析出白色 晶体为具有式(2)的化合物， 即间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲； 说 明 书 3/9 页 6 CN 105396174 B 6 0029 0030 3)将间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲0.02重量份和二氯(五甲基环戊二烯基)合 铱。
16、(III)二聚体0.05重量份加入CH2Cl2 6重量份， 常温搅拌10小时， 将溶液减压蒸馏， 静置析 出橙色固体， 得到具有式(3)的铱配合物， 即一氯一间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲一五甲 基环戊二烯基合铱(III)； 0031 0032 4)将环糊精0.5重量份溶于10重量份的水中， 搅拌均匀， 然后加入二氧化钛纳米管 1重量份， 浸泡30min； 0033 5)加入所述铱配合物1重量份， 然后用25kHz超声波40min； 0034 6)取出二氧化钛纳米管并将二氧化钛纳米管干燥。 0035 实施例2 0036 本方案制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳米管的方法， 包括以下步骤： 0037。
17、 1)将间羧基苯甲醛3重量份溶于甲苯8重量份中， 加入1-(9-蒽基)乙醇5重量份， 然 后加入浓度为98的硫酸0.5重量份， 加热到100搅拌回流1h， 将滤液旋干， 然后加入乙酸 乙酯5重量份萃取， 重复2次乙酸乙酯萃取过程， 然后合并乙酸乙酯层溶液， 加入无水碳酸钾 10重量份并旋干， 得到具有式(1)的化合物， 即间蒽氧酰基苯甲醛； 说 明 书 4/9 页 7 CN 105396174 B 7 0038 0039 2)将间蒽氧酰基苯甲醛4重量份溶于10重量份的无水乙醇中， 并加入硫代氨基脲1 份， 60回流搅拌5h得到微紫色溶液， 旋干后加入乙醇5重量份和正己烷5重量份， 析出白色 晶。
18、体为具有式(2)的化合物， 即间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲； 0040 0041 3)将间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲0.01重量份和二氯(五甲基环戊二烯基)合 铱(III)二聚体0.01重量份加入CH2Cl2 5重量份， 常温搅拌8小时， 将溶液减压蒸馏， 静置析 出橙色固体， 得到具有式(3)的铱配合物， 即一氯一间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲一五甲 基环戊二烯基合铱(III)； 0042 0043 4)将 -环糊精0.1重量份溶于3.5重量份的50水中， 搅拌均匀， 然后加入二氧化 钛纳米管0.5重量份， 浸泡20min； 0044 5)加入所述铱配合物0.2重量份后进行5000rpm离心5。
19、min， 再用15kHz超声波 30min； 说 明 书 5/9 页 8 CN 105396174 B 8 0045 6)取出二氧化钛纳米管并将二氧化钛纳米管用红外线100干燥22h。 0046 实施例3 0047 本方案制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳米管的方法， 包括以下步骤： 0048 1)将间羧基苯甲醛5重量份溶于甲苯15重量份中， 加入1-(9-蒽基)乙醇15重量份， 然后加入浓度为98的硫酸1.5重量份， 加热到120搅拌回流3h， 将滤液旋干， 然后加入乙 酸乙酯10重量份萃取， 重复4次乙酸乙酯萃取过程， 然后合并乙酸乙酯层溶液， 加入无水碳 酸钾15重量份并旋干， 得到具有式。
20、(1)的化合物， 即间蒽氧酰基苯甲醛； 0049 0050 2)将间蒽氧酰基苯甲醛10重量份溶于20重量份的无水乙醇中， 并加入硫代氨基脲 5份， 70回流搅拌8h得到微紫色溶液， 旋干后加入乙醇10重量份和正己烷10重量份， 析出 白色晶体为具有式(2)的化合物， 即间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲； 0051 0052 3)将间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲0.05重量份和二氯(五甲基环戊二烯基)合 铱(III)二聚体0.06重量份加入CH2Cl2 8重量份， 常温搅拌12小时， 将溶液减压蒸馏， 静置析 出橙色固体， 得到具有式(3)的铱配合物， 即一氯一间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲一五甲 基环。
21、戊二烯基合铱(III)； 说 明 书 6/9 页 9 CN 105396174 B 9 0053 0054 4)将 -环糊精0.6重量份溶于20重量份的50水中， 搅拌均匀， 然后加入管径为 10nm， 管长为80nm的二氧化钛纳米管1.5重量份， 浸泡60min； 0055 5)加入所述铱配合物1.2重量份后进行5000rpm离心10min， 再用30kHz超声波 60min； 0056 6)取出二氧化钛纳米管并将二氧化钛纳米管用红外线120干燥24h。 0057 实施例4 0058 本方案制备具有抗菌抗癌性能的二氧化钛纳米管的方法， 包括以下步骤： 0059 1)将间羧基苯甲醛4重量份溶于。
22、甲苯10重量份中， 加入1-(9-蒽基)乙醇10重量份， 然后加入浓度为98的硫酸1重量份， 加热到1-0搅拌回流2h， 将滤液旋干， 然后加入乙酸 乙酯8重量份萃取， 重复3次乙酸乙酯萃取过程， 然后合并乙酸乙酯层溶液， 加入无水碳酸钾 12重量份并旋干， 得到具有式(1)的化合物， 即间蒽氧酰基苯甲醛； 0060 0061 2)将间蒽氧酰基苯甲醛5重量份溶于15重量份的无水乙醇中， 并加入硫代氨基脲3 份， 65回流搅拌6h得到微紫色溶液， 旋干后加入乙醇6重量份和正己烷8重量份， 析出白色 晶体为具有式(2)的化合物， 即间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲； 说 明 书 7/9 页 10 CN。
23、 105396174 B 10 0062 0063 3)将间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲0.03重量份和二氯(五甲基环戊二烯基)合 铱(III)二聚体0.03重量份加入CH2Cl2 6重量份， 常温搅拌10小时， 将溶液减压蒸馏， 静置析 出橙色固体， 得到具有式(3)的铱配合物， 即一氯一间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基脲一五甲 基环戊二烯基合铱(III)； 0064 0065 4)将 -环糊精0.4重量份溶于15重量份的50水中， 搅拌均匀， 然后加入管径为 6nm， 管长为50nm的二氧化钛纳米管1重量份， 浸泡30min； 0066 5)加入所述铱配合物1重量份后进行5000rpm离心8min。
24、， 再用25kHz超声波35min； 0067 6)取出二氧化钛纳米管并将二氧化钛纳米管用红外线100干燥24h。 0068 其中， 实施例1-4的铱配合物的化学名称为一氯一间蒽氧酰基苯甲醛缩硫代氨基 脲一五甲基环戊二烯基合铱(III)； 0069 其理化性质： 为橙色晶体， 易溶于有机溶剂， 其核磁共振氢谱数据为1H NMR(CDCl3 溶剂)： 610.12(br， 1H)， 9.33(br， 1H)， 7.76(s， 1H)， 7.57(m， 3H， J7.8Hz)， 7.51(t， 1H， J 7.8Hz)， 7.41(t， 2H， J7.9Hz)， 7.36(d， 1H， J7.2H。
25、z)， 8.35(s， 2H)， 7.78(s， 2H)， 7.40 (s， 2H)， 7.26(s， 1H)， 5.31(d， 1H， J6.0Hz)， 5.07(d， 1H， J6.0Hz)， 4.91(d， 1H)， 4.22(d， 1H)， 2.69(m， 1H， J6.9Hz)， 2.40(s， 3H)， 1.55， 1.35(2d， 6H)ppm。 0070 下面通过药效学实验来进一步说明本方法得到的二氧化钛纳米管的药物活性及 其应用。 0071 实验一： 抗菌能力实验： 0072 在6个灭菌试管中加入1mL浓度为106cfu/ml的菌液， 然后分别加入1mg实施例1-4 得到的产。
26、品、 常规二氧化钛纳米管、 常规铱配合物， 37培养24h。 培养到时间点后， 培养基 说 明 书 8/9 页 11 CN 105396174 B 11 收集起来用倍比稀释， 稀释倍数为10倍和涂布培养法检测活菌数。 试验结果表明： 由本发明 制得的产品对金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、 大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、 白假丝酵母 (ATCC 10231)、 枯草芽孢杆菌黑色变种(ATCC 9372)都具有很强的杀菌性， 其中， 加入实施 例1的杀菌率达99.996以上， 加入实施例2的杀菌率达99.995以上， 加入实施例3的杀菌 率达99.996以上， 加入实施例4的杀菌率达。
27、99.998以上， 而加入常规二氧化钛纳米管的 杀菌率15左右， 加入常规铱配合物的杀菌率为60左右。 0073 实验二： 体外抗肿瘤活性实验 0074 采用MTT方法， 进行体外细胞毒性测定。 将实施例1-4得到的产品、 常规二氧化钛纳 米管、 常规铱配合物与骨癌U2-OS细胞株和鼻咽癌CNE-1细胞株分别作用时间72小时进行对 比测定的IC50(umol/mL)值， 对比结果如表1所示。 IC50是指对肿瘤细胞株的半数有效浓度。 0075 表1： 0076 0077 从实验一和实验二的结果可知， 经过本发明的方法得到的二氧化钛纳米管具有良 好的抗菌和抗癌性能； 而常规的二氧化钛纳米管抗菌效。
28、果差， 并且其作用的IC50值100， 表明其不具有抗癌活性； 常规铱配合物的抗菌抗癌能力不佳， 而且难以直接在骨整手术中 长时间发挥作用， 而本发明的产品的抗菌抗癌效果持久有效。 因此， 本发明为研究开发新的 具有优良性能的骨科和牙科移植物材料提供了新的思路。 0078 尽管本发明的实施方案已公开如上， 但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域， 对于熟悉本领域的人员而言， 可容易地 实现另外的修改， 因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下， 本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的实施例。 说 明 书 9/9 页 12 CN 105396174 B 12 。