技术领域
本发明是关于组织修复材料，特别是关于一种鱼皮衍生组织修复材料及其制造方法，其提供一鱼皮衍生组织修复材料，且此鱼皮衍生组织修复材料适用于作为贴片、敷料、载体、支架、植入物、或药剂来修复各种组织。
背景技术
组织工程系与生物以及药物之生物材料息息相关，其能够使进行移植手术之病人增强血管造影、组织整合，以及组织重建；生物材料为人造且具生物相容性的组织修复材料，应用于重建人造器官、修复或修补，甚至取代人体组织。
胶原蛋白是组织修复材料的重要组成，其具有使组织生长、伤口愈合等功能。此外，由于以胶原蛋白为组织修复材料的应用领域规模不断地扩大，因此，开发更具有医疗价值及更多样性的具有胶原蛋白的组织修复材料，以应用于各种用途，是现今研发者的主要研究之一。
目前的组织修复材料多半是源自于自体、捐赠者或动物。然而，在某些疾病的治疗上，无法取得自体的组织修复材料，或无法取得足够的自体组织修复材料。再者，源自捐赠者的组织修复材料具有捐赠者的供应、制备程序复杂、成本相对高、免疫排斥的风险等问题。源自动物的组织修复材料仍具有制备程序复杂、成本相对高、免疫排斥的风险、人畜共生疾病等问题。
发明内容
在一实施例中，一种鱼皮衍生组织修复材料，其包括衍生自鱼皮且光学清晰的片状主体。此光学清晰的片状主体为去细胞的，且其包括含胶原蛋白基质及于胶原蛋白基质中的水。
在一些实施例中，此光学清晰的片状主体可具有大于或等于70％的透光度、大于或等于5MPa的极限应力、以及大于或等于40g的可缝性。
在一些实施例中，此胶原蛋白基质可为具有胶原蛋白纤维的层状结构，并且各胶原蛋白纤维可沿着光学清晰的片状主体的表面延伸。在另一些实施例中，此胶原蛋白基质可为具有胶原蛋白纤维的层状结构，并且一部分的胶原蛋白纤维是沿着从光学清晰的片状主体的一表面到另一表面的方向延伸。
在一些实施例中，此光学清晰的片状主体可衍生自完全无鱼鳞及鱼肉的鱼皮。
在一些实施例中，此光学清晰的片状主体可衍生自鱼皮且无磨碎过。
在一些实施例中，此光学清晰的片状主体可由一制造方法制成，且此制造方法包括：去除鱼皮上的鱼鳞、油脂、细胞、色素及口袋结构以获得一纯化后鱼皮、以酸液处理纯化后鱼皮以获得未崩解的一塑型态片状主体、进行塑型态片状主体的塑型以获得具有特定形状的塑型后片状主体、以及进行一稳定化程序以稳定塑型后片状主体。
在一实施例中，一种鱼皮衍生组织修复材料的制造方法，其包括：取得无鱼肉的鱼皮、去除鱼皮上的鱼鳞、油脂、细胞、色素及口袋结构以获得一纯化后鱼皮、以及以酸液处理纯化后鱼皮以获得未崩解的塑型态片状主体。
在一些实施例中，鱼皮衍生组织修复材料的制造方法可更包括：水洗塑型后片状主体。在一些实施例中，组织修复材料的制造方法可更包括：在水洗步骤之前或之后，干燥塑型后片状主体。在一些实施例中，组织修复材料的制造方法可更包括：在干燥步骤之后，使塑型后片状主体回水。
在一些实施例中，鱼皮衍生组织修复材料的制造方法可更包括：进行塑型态片状主体的塑型以获得具有特定形状的塑型后片状主体。在一些实施例中，塑型步骤可包括裁切塑型态片状主体以获得塑型后片状主体，且此塑型后片状主体的表面为塑型态片状主体的截面。在另一些实施例中，塑型步骤可包括裁切塑型态片状主体以获得塑型后片状主体，且此塑型后片状主体的表面为塑型态片状主体的表面。
在一些实施例中，鱼皮衍生组织修复材料的制造方法可更包括：从塑型态片状主体萃取出胶原蛋白溶液。
在一些实施例中，鱼皮衍生组织修复材料的制造方法可更包括：冻干塑型态片状主体。
在一些实施例中，鱼皮衍生组织修复材料的制造方法可更包括：去除塑型态片状主体的外侧层、以及以酸液处理外侧层去除后的塑型态片状主体。
在一实施例中，一种鱼皮衍生组织修复材料是由前述任一制造方法所制造。
综上，根据本发明实施例之鱼皮衍生组织修复材料及其制造方法适用于提供组织修复材料，且此组织修复材料适用于作为贴片、敷料、载体、支架、植入物、或药剂来修复各种组织。此组织修复材料具有胶原蛋白以促进损伤组织的修复并具有预期之组织修复应用所需的特定特征。再者，依照目前各研究显示，此组织修复材料无残留人鱼共生疾病(病毒所引发的)的致病因子。
附图说明
图1为一实施例的鱼皮衍生组织修复材料的制造方法的流程图。
图2为一实施例的步骤S20的流程图。
图3为一实施例的步骤S30的流程图。
图4为另一实施例的鱼皮衍生组织修复材料的制造方法的流程图。
图5为第一实施例的步骤S40的流程图。
图6为第二实施例的步骤S40的流程图。
图7为第三实施例的步骤S40的流程图。
图8为第四实施例的步骤S40的流程图。
图9为第五实施例的步骤S40的流程图。
图10为第六实施例的步骤S40的流程图。
图11为第七实施例的步骤S40的流程图。
图12为第八实施例的步骤S40的流程图。
图13为又一实施例的鱼皮衍生组织修复材料的制造方法的流程图。
图14为一实施例的原始鱼皮的表面的照片。
图15-17为一实施例的原始鱼皮的扫描式电子显微镜(SEM)的显微照片。
图18为一实施例的第二纯化后鱼皮的SEM的显微照片。
图19为一实施例的第一塑型态片状主体的照片。
图20为一实施例的第一塑型态片状主体的SEM的显微照片。
图21为一实施例的第一塑型态片状主体的染色切片的显微照片。
图22为一实施例的第一稳定态片状主体的照片。
图23-24为一实施例的第一稳定态片状主体的SEM的显微照片。
图25为一实施例的第四稳定态片状主体的SEM的显微照片。
图26为一实施例的第五稳定态片状主体的SEM的显微照片。
图27为一实施例的第六稳定态片状主体的SEM的显微照片。
图28为一实施例的第七稳定态片状主体的SEM的显微照片。
具体实施方式
以下述及的「第一」、「第二」、「第三」…等序号用语，其系用以区别所指的元件，而非用以排序或限定所指元件的差异性，且亦非用以限制本发明的范围。
在一实施例中，鱼皮衍生组织修复材料包括衍生自鱼皮的片状主体。此片状主体为去细胞的，且其包括胶原蛋白基质及于胶原蛋白基质中的水。此衍生自鱼皮的片状主体具有足以适用于各种组织修复应用的可缝性。其中，鱼皮衍生组织修复材料适用于作为贴片、敷料、载体、支架、植入物、或药剂来修复各种组织，例如：眼科组织、口内组织、皮肤、骨组织等。在一些实施例中，此片状主体可为光学清晰的片状主体，以便于观察伤口及/或适用于修复眼科组织。在一些实施例中，此片状主体可更具有足以作为贴片、敷料、载体、支架或植入物的极限应力。
在一些实施例中，光学清晰的片状主体可具有大于或等于70％的透光度、大于或等于5MPa的极限应力、以及大于或等于40g的可缝性。
在一些实施例中，胶原蛋白基质可为层状结构，并且此层状结构包括复数胶原蛋白纤维。在一些实施例中，各胶原蛋白纤维可沿着片状主体的表面延伸。在另一些实施例中，复数胶原蛋白纤维可有一部分的胶原蛋白纤维是沿着从片状主体的一表面到另一表面的方向延伸，而另一部分则以不同方向延伸(如，沿着片状主体的表面延伸)。
参照图1，在一实施例中，鱼皮衍生组织修复材料的制造方法主要具有执行在取得无鱼肉的一鱼皮(步骤S10)之后的一纯化程序(步骤S20)及一塑型程序(步骤S30)。
在步骤S10的一些实施例中，鱼皮可为具有鱼鳞但无鱼肉的一原始鱼皮。在一些实施例中，可从能提供产销履历等相关证明文件的鱼场取得一鱼，再将取得的鱼皮肉分离，以得到带有鱼鳞但无鱼肉的原始鱼皮。在一些实施例中，提供鱼皮的鱼的鱼种可为诸如鲈鱼、鲷鱼、鮨科鱼(如，石斑鱼等)、吴郭鱼…等色素仅存在于鱼皮表层的鱼种。
参照图2，纯化程序(步骤S20)包括去除鱼皮上的鱼鳞(步骤S210)、去除鱼皮上的油脂和细胞(步骤S230)、以及去除鱼皮上的色素和口袋结构(步骤S250)。此纯化程序(步骤S20)执行完成即得到一纯化后鱼皮。
在步骤S210的一实施例中，可通过至少一种方式(以下称第一方式)完全去除原始鱼皮上的鱼鳞以得到一去鱼鳞鱼皮，然后以干净的水清洗去鱼鳞鱼皮以去除去鱼鳞鱼皮上的杂质，例如：组织液、血水或其组合。在一些实施例中，第一方式可是物理方式、化学方式或其组合。举例来说(但不限于此)，在物理方式上，可用手将原始鱼皮上的鱼鳞剥除、可用刨刀刮除原始鱼皮上的鱼鳞、可用液体剪切力将原始鱼皮上的鱼鳞去除、可用高压气(液)体将原始鱼皮上的鱼鳞去除、或将原始鱼皮浸泡在25℃～60℃的温水中以去除鱼鳞。在化学方式的一实施例中，举例来说(但不限于此)，原始鱼皮通过浸泡酸液以去除鱼鳞。在一些实施例中，酸液可为有机酸或无机酸。其中，酸液可为琥珀酸、甲酸、醋酸、柠檬酸、丙酮酸、胡索酸、盐酸(HCl)、硝酸(HNO3)、或硫酸(H2SO4)。在化学方式的另一实施例中，举例来说(但不限于此)，原始鱼皮是通过浸泡碱液，以去除鱼鳞。其中，碱液可为氢氧化钠(NaOH)或氢氧化钾(KOH)。在化学方式的又一实施例中，举例来说(但不限于此)，原始鱼皮通过浸泡双氧水(H2O2)，以去除鱼鳞。
在步骤S230的一实施例中，去鱼鳞鱼皮上的油脂和细胞能通过同一处理作业或不同处理作业去除。最后，处理后鱼皮(即，去油脂和去细胞后的去鱼鳞鱼皮)进行水洗以去除处理后鱼皮上的杂质及/或中和处理后鱼皮的pH值。其中，所使用的水可为干净的水、去离子水、二次去离子水(DDW)、生理盐水、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、或磷酸缓冲溶液(PB)。在一些实施例中，去鱼鳞鱼皮可以化学药剂来去除油脂。其中，所使用的化学药剂可为醇类溶液、碱液或其任意组合。举例来说(但不限于此)，醇类溶液可为异丙醇。举例来说(但不限于此)，碱液可为NaOH或KOH。在一些实施例中，去鱼鳞鱼皮可通过至少一种方式(以下称第二方式)来去除细胞。在一些实施例中，第二方式可为化学方式、酵素处理方式、物理方式、或其任意组合。在化学方式上，是使用化学药剂来去除去鱼鳞鱼皮上的细胞。其中，所使用的化学药剂可为盐类、碱液、酸液、氧化剂、螯合剂、或其任意组合。举例来说(但不限于此)，盐类可为氯化钠(NaCl)或氯化钾(KCl)。举例来说(但不限于此)，碱液可为NaOH或KOH。举例来说(但不限于此)，酸液可为琥珀酸、甲酸、醋酸、柠檬酸、丙酮酸、胡索酸、HCl、HNO3、或H2SO4。举例来说(但不限于此)，氧化剂可为双氧水或过硫酸根。举例来说(但不限于此)，螯合剂可为含过度金属元素的试剂，例如：Ca2+、Fe2+、Mn2+…等。在酵素处理方式上，是使用至少一种酵素来去除去鱼鳞鱼皮上的细胞。其中，所使用的酵素可为蛋白酶、核酸内切酶、或核酸外切酶。举例来说(但不限于此)，核酸内切酶可为EcoRI、BamHI、HindIII、TaqI、NotI、HinfI、或Sau3A。举例来说(但不限于此)，核酸外切酶可为核糖核酸酶R、核糖核酸酶II、核糖核酸酶D、RNase BN、核糖核酸酶PH、或核酸外切酶I。在物理方式的一些实施例，能通过冷冻去鱼鳞鱼皮以去除去鱼鳞鱼皮上的细胞。在步骤S230的一示范例上，将去鱼鳞鱼皮浸泡在NaOH与NaCl的混合溶液中12～24小时，并且于浸泡过程中置换混合溶液数次，以得到处理后鱼皮。于浸泡后，处理后鱼皮以DDW洗去浸泡的混合溶液，直到鱼皮的pH值恢复中性。在一些实施例中，于步骤S230的执行过程中，处理温度可控制在4℃～20℃。举例来说(但不限于此)，在步骤S230的执行过程中，所有使用的溶液均具有4℃～20℃的溶液温度及/或将环境温度控制在4℃～20℃。
在步骤S250的一实施例中，去鱼鳞鱼皮(中性)上的色素和口袋结构能通过同一处理作业或不同处理作业去除。在一实施例中，处理后鱼皮浸泡在至少一种酸液中，以致使处理后鱼皮膨润(以下称膨润鱼皮)。然后，膨润鱼皮施以去口袋方式，以去除膨润鱼皮上的口袋结构。其中，举例来说(但不限于此)，所使用的酸液可为琥珀酸、甲酸、醋酸、柠檬酸、丙酮酸、胡索酸、HCl、HNO3、或H2SO4。于此，依照不同种类的酸液会选用不同的酸液浓度。并且，依照不同的酸液浓度会搭配不同的浸泡时间。举例来说(但不限于此)，当使用0.01M～0.5M醋酸时，浸泡时间可为0.5小时～18小时；或者，当使用0.3M醋酸时，浸泡时间可为约30分钟～50分钟。再者，处理参数(即，酸液浓度和浸泡时间)亦会依照处理后鱼皮的尺寸而有所调整。在一示范例中，于实施去口袋方式时，可同时将膨润鱼皮上的色素去除。在另一示范例中，膨润鱼皮能另外施以去色素药剂来去除膨润鱼皮上的色素。在去口袋方式的一些实施例中，能使用钝器来以去除膨润鱼皮上的口袋结构。举例来说(但不限于此)，所使用的钝器可为手(如，手指)、铁片、塑胶片、或任何不会损伤鱼皮表面的器具。在一些实施例中，所使用的去色素药剂可为氧化剂(如，双氧水或次氯酸纳)或界面活性剂(如，Triton X100)。在一些实施例中，于实施去口袋方式的过程中，能同时去除掉膨润鱼皮上的纹路、肌肉组织和不必要的残留组织。
应能明了的，流程的步骤顺序仅为示意，其是供本技术领域具有通常知识者了解本发明之用，而非对本发明的实施范围加以限制，本领域技术人员应可了解在合理情况下部分步骤的执行顺序可同时进行、先后对调或合并执行。举例来说，根据各步骤的执行内容，步骤S210、步骤S230和步骤S250中任二个步骤或三个步骤可合并成一个步骤。举例来说，将鱼皮浸泡在酸液中以使鱼皮膨润，然后以钝器同时去除膨润鱼皮上的鱼鳞和口袋结构。
参照图3，塑型程序(步骤S30)包括以酸液处理纯化后鱼皮以获得未崩解且衍生自鱼皮的塑型态片状主体(步骤S310)，以及将塑型态片状主体塑型成一特定形状，以获得具有特定形状且衍生自鱼皮的塑型后片状主体(步骤S330)。其中，此塑型后片状主体可为光学清晰的。
在步骤S310的一些实施例中，纯化后鱼皮浸泡在至少一种酸液中，以致使纯化后鱼皮膨润但未崩解(即，衍生自鱼皮的塑型态片状主体)。然后，将此塑型态片状主体以各种器具或模具塑型成特定形状以形成塑型后片状主体(即，具有特定形状的塑型态片状主体)。其中，举例来说(但不限于此)，所使用的酸液可为琥珀酸、甲酸、醋酸、柠檬酸、丙酮酸、胡索酸、HCl、HNO3或H2SO4。于此，依照不同种类的酸液会选用不同的酸液浓度。并且，依照不同的酸液浓度会搭配不同的浸泡时间。再者，处理参数(即，酸液浓度和浸泡时间)亦会依照处理后鱼皮的尺寸而有所调整。在一些实施例中，塑型后片状主体的特定形状可为二维片状、表面平整的袋状、弧状、管状、直线或非直线条状(如，单一条或多条串接成)、球状(如，粉末或细粒)、块状、针状、实心多边形、或中空多边形。
在一些实施例中，于执行塑型步骤(步骤S330)的过程中，塑型态片状主体可裁切成一特定尺寸。在一示范例中，于裁切之后，塑型后片状主体的表面是源自塑型态片状主体的表面(即，塑型态片状主体的表面的一小区块)。在另一示范例中，于裁切之后，塑型后片状主体的表面是源自塑型态片状主体的截面(即，塑型后片状主体的上表面及/或下表面为塑型态片状主体的截面，而塑型后片状主体的侧边为塑型态片状主体的表面的一小区块)。
在一些实施例中，于执行塑型步骤(步骤S330)的过程中，并未将塑型态片状主体磨碎。
在另一实施例中，参照图4，于执行塑型程序(步骤S30)之后，可执行一稳定化程序(步骤S40)。
在一实施例中，稳定化程序(步骤S40)可包括稳定塑型后片状主体以获得稳定态的光学清晰的片状主体。
在稳定步骤的第一实施例中，参照图5，于执行塑型程序(步骤S30)之后，可直接水洗塑型态片状主体，直至片状主体的pH值为中性(步骤S450)。换言之，于塑型程序(步骤S30)与水洗步骤(步骤S450)之间无任何干燥步骤。
在稳定步骤的第二实施例中，参照图6，于执行塑型程序(步骤S30)之后，可直接水洗塑型态片状主体，直至片状主体的pH值为中性(步骤S450)，以获得衍生自鱼皮的中性片状主体。于水洗步骤之后，干燥中性片状主体(步骤S470)，然后再浸泡在水中以使片状主体回水(步骤S490)。
在稳定步骤的第三实施例中，参照图7，于执行塑型程序(步骤S30)之后，可先干燥塑型后片状主体(步骤S430)，然后进行水洗直至片状主体的pH值恢复中性(步骤S452)，以获得衍生自鱼皮的中性片状主体。
在稳定步骤的第四实施例中，参照图8，于执行塑型程序(步骤S30)之后，可先干燥塑型后片状主体(步骤S430)，然后进行水洗直至片状主体的pH值恢复中性(步骤S452)，以获得衍生自鱼皮的中性片状主体。于水洗步骤之后，再干燥中性片状主体(步骤S472)，然后将中性片状主体浸泡在水中以使片状主体回水(步骤S490)。
在稳定化程序(步骤S40)中，所使用的水可为干净的水、去离子水、DDW、生理盐水、PBS或PB。在稳定化程序(步骤S40)中，所使用的干燥方式可以是温和的干燥方式，例如：风干或低温干燥。
在另一实施例中，参照图9～12，于稳定化程序(步骤S40)中，在执行稳定步骤之前，可先执行一表面图案化步骤(步骤S410)。
在表面图案化步骤(步骤S410)的一实施例中，可将塑型后片状主体放入具有特定图案的模具中，以致使塑型后片状主体的表面具有对应于特定图案的纹路(以下称表面纹路)。塑型后片状主体的表面纹路和模具内表面的特定图案是匹配的。举例来说(但不限于此)，表面纹路可为凸纹、凹纹或其组合。换句话说，模具内表面的特定图案可相对为凹槽图案、凸起图案或器组合。
在一些实施例中，表面图案化步骤(步骤S410)可合并至塑型步骤(步骤S330)。即，表面纹路可于塑型步骤(步骤S330)中形成，而于稳定化程序(步骤S40)中则无表面图案化步骤(步骤S410)。
在一些实施例中，塑型程序(步骤S30)和稳定化程序(步骤S40)可交替执行一次或反复执行数次(未显示)。
在又一实施例中，参照图13，于稳定化程序(步骤S40)之后，可执行一裁切程序(步骤S50)。于裁切程序(步骤S50)中，可依产品需求将稳定态之光学清晰的片状主体裁切成特定尺寸。
在一些实施例中，在纯化程序(步骤S20)和塑型程序(步骤S30)之间、或在塑型程序(步骤S30)和稳定化程序(步骤S40)之间可执行一交联程序。再者，此交联程序亦可是与塑型程序(步骤S30)同时执行、或是与稳定化程序(步骤S40)同时执行。于执行交联程序的过程中，纯化后鱼皮或光学清晰的片状主体以至少一种交联方式进行处理，以进一步增强机械特性。在一些实施例中，交联方式可为物理交联方式或化学交联方式。举例来说(但不限于此)，物理交联方式可为照射紫外光(UV)、照射γ射线(γ-ray)或加热。举例来说(但不限于此)，化学交联方式可使用戊二醛(glutaraldehyde；GA)、丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether；BDDE)、天然胶联剂(genipin)、或EDC/NHS(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide/N-hydroxysuccinimide)等交联剂。
在一些修饰态样中，可调整塑型程序(S30)的步骤，并且移除于塑型程序(S30)之后的程序。其中，调整后的塑型程序可包括以酸液处理纯化后鱼皮以获得衍生自鱼皮的塑型态片状主体，以及从塑型态片状主体萃取出一胶原蛋白溶液。于此，胶原蛋白溶液即为得到的鱼皮衍生组织修复材料。在一些示范例中，调整后的塑型程序可移除塑型步骤(步骤S330)。在其他示范例中，调整后的塑型程序仍可保留有塑型步骤(步骤S330)以将塑型态片状主体裁切成适合进行萃取的特定尺寸及/或特定形状。
再者，在调整后的塑型程序中，可在酸处理步骤与萃取步骤之间，进行一中和步骤以使塑型态片状主体的pH值恢复中性。举例来说，中和步骤可包括水洗塑型态片状主体。
在其他修饰态样中，可调整塑型程序(S30)的步骤，并移除于塑型程序(S30)之后的程序。于此，调整后的塑型程序可包括以酸液处理纯化后鱼皮以获得未崩解且衍生自鱼皮的塑型态片状主体(步骤S310)，以及冻干塑型态片状主体以获得一胶原蛋白海绵。于此，胶原蛋白海绵即为得到的鱼皮衍生组织修复材料。在一些示范例中，调整后的塑型程序可移除塑型步骤(步骤S330)。在其他示范例中，调整后的塑型程序仍可保留有塑型步骤(步骤S330)并在酸处理步骤(步骤S310)与冻干步骤之间执行。
再者，在调整后的塑型程序中，可在酸处理步骤(步骤S310)(或塑型步骤(步骤S330))与冻干步骤之间，进行一中和步骤以使片状主体的pH值恢复中性。举例来说，中和步骤可包括水洗片状主体。
在又一些修饰态样中，可调整塑型程序(S30)的步骤。于此，调整后的塑型程序中可进行数次酸处理步骤(步骤S310)。并且，于任两次酸处理步骤(步骤S310)之间，去除塑型态片状主体的至少一外侧层。最后，能得到为胶原蛋白薄膜的鱼皮衍生组织修复材料。其中，每次酸处理步骤(步骤S310)的处理参数(如，酸液种类、酸液浓度、浸泡时间)可相同、或不同、或其组合。
在一些示范例中，调整后的塑型程序可移除塑型步骤(步骤S330)。在其他示范例中，调整后的塑型程序仍可保留有塑型步骤(步骤S330)并在任意一次酸处理步骤(步骤S310)之后执行。
在一些示范例中，可移除于塑型程序(S30)之后的程序。在其他示范例中，调整后的塑型程序仍可保留有仍可保留塑型程序(S30)之后的程序。若塑型程序(S30)之后的程序被移除，可在完成所有酸处理步骤(步骤S310)之后，进行一中和步骤以使片状主体的pH值恢复中性。举例来说，中和步骤可包括水洗片状主体。
制备程序1：SEM样本制备
样本(即，欲观察的鱼皮或欲观察的片状主体)置于去离子水中30分钟。然后，将去离子水置换成2.5％戊二醛溶液，并且将样本浸泡在戊二醛溶液中20分钟。于戊二醛溶液浸泡完成之后，以去离子水清洗样本10分钟且清洗三次。接着，加入1％锇酸(osmic acid)以与样本反应2小时。然后，除去锇酸，并且以去离子水清洗样本10分钟且清洗三次。接者，以梯度浓度(30％、50％、70％、80％、90％、95％、及100％)的酒精(alcohol)使样本脱水。然后，将样本放入临界点干燥机(EM CPD300,Leica)干燥，即获得能以扫描式电子显微镜(SEM)(S-3000N,Hitachi)进行SEM量测/观察的样品(以下称SEM样本)。
制备程序2：冷冻切片及H&E染色
样本(即，欲观察的片状主体)以4％三聚甲醛(paraformaldehyde)固定24小时，再以30％蔗糖溶液(sucrose solution)于4℃下脱水，以预防水分产生冰晶破坏样本的组织。脱水样本放入预先加足包埋剂(O.C.T)的模具中，并且利用液态氮瞬间冰冻。待O.C.T定型完成后，以冷冻切片机(CM1900,Leica)于-25℃进行切片，以得到切片样本。于此，切片样本的切片厚度为10μm。将切片样本置入hematoxyline溶液进行染色，并于室温静置1分钟。接着，以去离子水浸泡冲洗切片样本10分钟，再置入eoxin溶液染色6分钟。然后，以去离子水冲洗切片样本8分钟。接着，将切片样本依序以梯度浓度(75％、85％、95％及100％)的酒精进行脱水，风干后将其封片，并于光学显微镜(DM6000B,Leica)下观察。
测试程序1：机械测试
将样本(即，欲测试的片状主体)依照ASTM D638-2003规范切成哑铃型，然后，固定于万能试验机(3365,INSTRON)的夹具上。机械测试以万能试验机以速度5mm/min及力量500N进行测试。于此，每组进行测试的切片样本数为大于或等于6，并计算切片样本所测得的极限应力的平均。
测试程序2：透光度测试
将样本(即，欲测试的片状主体)浸泡在DDW中16小时以使片状主体回水。其中，样本与DDW的比例为8片样本浸泡于500ml DDW中。将样本裁切成直径0.7cm的小圆片，然后将小圆片置于微量多孔盘底部，并加入100μl DDW。而微量多孔盘的控制孔中则只加入100μl DDW。然后，以酵素免疫分析测读仪(ELISA meter)(Sunrise,TECAN)进行400nm～700nm全波常进行读盘，并且计算读取到的全波长吸光值的平均。然后，根据下列公式计算出透光度：
A＝log(1/T)
T代表透光度，而A代表小圆片的读取吸光值的平均。
测试程序3：厚度测试
样本(即，欲测试的片状主体)的厚度是以膜厚计随机测定不同位置的多个点，然后取平均而得。
测试程序4：可缝性测试
将样本(即，欲测试的片状主体)裁切成1*1cm尺寸，以不可吸收缝线(STIN-ST4 4.0)穿线于鱼皮上下距边界0.2cm处。然后，将上缝线固定悬挂在可缝性测试台上，下缝线则悬挂重物。持续增加下缝线悬挂重物的重量直至鱼皮无法承受重量破裂，此时下缝线所悬挂重物的重量即为此样本的可缝性。
测试程序5：含水率测试
取干燥的样本(即，欲测试的片状主体)秤重并记录原始重量。接着，利用烘箱以105±3℃加热样本，直到重量变异小于原始重量的0.05％，并且持续两次。于加热之后，再将样本秤重并记录加热后重量。然后，根据下列公式计算出含水率：含水率＝[(原始重量-加热后重量)/原始重量]×100％。
实验1：原始鱼皮的观察
巨观下，带鱼鳞的原始鱼皮是白色不透明的，并且原始鱼皮在口袋结构的部分有大量的色素，如图14所示。
带鱼鳞的原始鱼皮以制备程序1处理成SEM样本。
图15显示原始鱼皮的截面，其中原始鱼皮的表面具有类似口袋凸起的结缔组织，以包覆鱼鳞。图16及17显示在高倍率观察下之原始鱼皮的截面，其中除了口袋结构，原始鱼皮为一层状结构。
实验2：纯化程序
于取得原始鱼皮(应置于小于4℃的低温下)之后，将原始鱼皮上的鱼鳞以人工方式完全去除以得到去鱼鳞鱼皮，然后以干净的水清洗去鱼鳞鱼皮以去除组织液与血水，以获得干净的去鱼鳞鱼皮。将干净的去鱼鳞鱼皮以0.5M NaOH/0.5M NaCl的混合溶液浸泡12小时，以致使去鱼鳞鱼皮膨润(肿胀)并呈现半透明(以下称处理后鱼皮)。然后，使用等体积的水搅拌清洗处理后鱼皮，并换水一次或多次，直至混合溶液洗净(即，直至鱼皮变白色且pH值为中性)。再将处理后鱼皮(中性)浸泡在1L/0.3M醋酸溶液60分钟。于醋酸的浸泡后，处理后鱼皮表面上的口袋结构会变的脆弱，然后以手完全去除口袋结构，以获得纯化后鱼皮(以下称第一纯化后鱼皮)。
实验3：纯化程序
于取得原始鱼皮(应置于小于4℃的低温下)之后，将原始鱼皮上的鱼鳞以人工方式完全去除以得到去鱼鳞鱼皮，然后以干净的水清洗去鱼鳞鱼皮以去除组织液与血水，以获得干净的去鱼鳞鱼皮。将干净的去鱼鳞鱼皮以0.1M NaOH/10M NaCl的混合溶液浸泡12小时，以致使去鱼鳞鱼皮膨润(肿胀)并呈现半透明(以下称处理后鱼皮)。然后，使用等体积的水搅拌清洗处理后鱼皮，并换水一次或多次，直至混合溶液洗净(即，直至鱼皮变白色且pH值为中性)。再将处理后鱼皮(中性)浸泡在0.1M醋酸溶液30分钟。于醋酸的浸泡后，处理后鱼皮表面上的口袋结构会变的脆弱，然后以钝器完全去除口袋结构，以获得纯化后鱼皮(以下称第二纯化后鱼皮)。
实验4：第二纯化后鱼皮的观察
第二纯化后鱼皮以制备程序1处理成SEM样本。
第二纯化后鱼皮的截面具有胶原蛋白基质、此胶原蛋白基质为层状结构，且此层状结构形成有复数胶原蛋白纤维，如图18所示。参照图18，胶原蛋白纤维松散地排列成层状结构的复数层、在相同层的胶原蛋白纤维是以相同方向排列，并且不相邻二层的胶原蛋白纤维以90度交迭。并且，存在有垂直于水平层的纵向纤维。
实验5：塑型程序、稳定化程序及交联程序
将第一纯化后鱼皮浸泡在0.5L/0.3M醋酸溶液24小时，以致使第一纯化后鱼皮变成塑型态(以下称第一塑型态片状主体)，因此可简单地控制/调整其厚度与形状。
将第一塑型态片状主体置入平滑表面的模具内以得到塑型后片状主体，然后将塑型后片状主体与模具一同置入抽气柜中干燥直至塑型后片状主体完全干燥。于干燥后，再将塑型后片状主体浸泡在1L水中搅拌清洗至溶液洗去。接着，将塑型后片状主体再置入模具中，并且再次进行完全干燥。于是，即可得到稳定态的光学清晰的片状主体(以下称第一稳定态片状主体)。
在一实验中，第一稳定态片状主体置放于距紫外光灯管(110V、8W且254nm)50cm处，每一面照射60分钟并照射2次，以得到稳定态的光学清晰的片状主体(以下称第二稳定态片状主体)。
在另一实验中，第一稳定态片状主体放入1％BDDE(或0.05％GA)溶液中搅拌浸泡12小时，再以去离子水浸泡冲洗3次(每次10分钟)，以得到稳定态的光学清晰的片状主体(以下称第三稳定态片状主体)。
实验6：第一塑型态片状主体的观察
巨观下，第一塑型态片状主体呈透明的水胶状态，如图19所示。
第一塑型态片状主体以制备程序1处理成SEM样本。图20显示在SEM量测下之第一塑型态片状主体的截面，其中第一塑型态片状主体的层状结构为松散的。
第一塑型态片状主体以制备程序2处理成染色切片样本。从第一塑型态片状主体的染色切片样本可观察到第一塑型态片状主体无细胞残留，如图21所示。
实验7：第一到第三稳定态片状主体的观察
巨观下，第一稳定态片状主体是透明且平整的，如图22所示。
第一稳定态片状主体以制备程序1处理成SEM样本。图23及24显示在SEM量测下之第一稳定态片状主体的截面，其中第一稳定态片状主体的结构致密，并且第一稳定态片状主体的表面是平整的。
第一至第三稳定态片状主体的平均极限应力如下表1所示。
表1
由此可见，第一至第三稳定态片状主体的平均极限应力可接近或大于正常人类角膜。
实验8：塑型程序
第二纯化后鱼皮裁切成直径16mm的小圆片并且分成40组。40组小圆片以不同反应条件(如下表2)浸泡醋酸。
表2
于醋酸浸泡完成后，第30组及第33组至第40组的第二纯化后鱼皮已崩解，即，无法维持其形态。
实验9：塑型程序与稳定化程序
将第二纯化后鱼皮的鱼背、腹及尾巴等胶原蛋白含量少之部位(其无法达到良好的膨润状态)切除，以保留第二纯化后鱼皮的中央部位。中央部位的尺寸为7*24cm。再将中央部位裁切成7*3cm(共8片)。其中，每一片的表面源自中央部位的表面。将每一片浸泡在0.5L/0.1M醋酸溶液6小时，并且冷藏16小时。接着，每一片再分层成复数片状主体(以下称第二塑型态片状主体)。
第二塑型态片状主体根据前述第一实施例之稳定步骤进行处理，以得到稳定态之光学清晰的片状主体(以下称第四稳定态片状主体)。第二塑型态片状主体根据前述第二实施例之稳定步骤进行处理，以得到稳定态之光学清晰的片状主体(以下称第五稳定态片状主体)。第二塑型态片状主体根据前述第三实施例之稳定步骤进行处理，以得到稳定态之光学清晰的片状主体(以下称第六稳定态片状主体)。第二塑型态片状主体根据前述第四实施例之稳定步骤进行处理，以得到稳定态之光学清晰的片状主体(以下称第七稳定态片状主体)。
实验10：第四至第七稳定态片状主体的观察
图25显示在SEM量测下之第四稳定态片状主体的截面，其中第四稳定态片状主体虽保有纵向胶原蛋白纤维，但第四稳定态片状主体的结构是松散的且其平均极限应力相对低(膨润型态)。
图26显示在SEM量测下之第五稳定态片状主体，其中第五稳定态片状主体仍保有纵向胶原蛋白纤维，并且第二稳定态片状主体的透光度约为70％。
图27显示在SEM量测下之第六稳定态片状主体，其中虽然第六稳定态片状主体损失一些纵向胶原蛋白纤维，但第六稳定态片状主体仍有大部分的纵向胶原蛋白纤维。第六稳定态片状主体的透光度约为80％-85％，并且第六稳定态片状主体的平均极限应力与第七稳定态片状主体无显著差异。
图28显示在SEM量测下之第七稳定态片状主体，其中虽然第七稳定态片状主体损失一些纵向胶原蛋白纤维，但其结构是整齐紧密堆迭，且第七稳定态片状主体仍具有大部分的纵向胶原蛋白纤维。第七稳定态片状主体的透光度大于90％，并且第七稳定态片状主体的平均极限应力是第五稳定态片状主体的2.5倍。
实验11：不同厚度
在一实验中，第二塑型态片状主体以2mm夹制具进行厚度裁切，并且根据前述第四实施例的稳定步骤进行处理，以获得稳定态之光学清晰的片状主体(以下称第八稳定态片状主体)。
在另一实验中，第二塑型态片状主体以5mm夹制具进行厚度裁切，并且根据前述第四实施例的稳定步骤进行处理，以获得稳定态之光学清晰的片状主体(以下称第九稳定态片状主体)。
第八稳定态片状主体的厚度约为208±36.8μm、第八稳定态片状主体的透光度大于或等于90％，并且第八稳定态片状主体的可缝性大于或等于40g。
第九稳定态片状主体的厚度约为500±60.8μm，并且第九稳定态片状主体的可缝性大于或等于55g。
于此，裁切厚度与最终厚度(于稳定化程序后)的比例约为1:0.1。
实验12：含水率测试
裁切第二塑型态片状主体，并且裁切后根据前述第四实施例的稳定步骤进行处理，以获得稳定态之光学清晰的状主体(以下称第十稳定态片状主体)。
当第十稳定态片状主体的厚度约为200μm时，其含水率约为90％。
实验13：毒性测试
毒性测试是根据ISO10993-12而进行。从第七稳定态片状主体萃取出材料萃取液，然后将材料萃取液加入至培养液中进行细胞培养。具有材料萃取液的培养液的测试值除以无材料萃取液的培养液的测试值，其得到的数值大于92％。毒性测试的结果大于70％即为符合法规规范。
实验14：塑型程序、稳定化程序及交联程序
将第二纯化后鱼皮的鱼背、腹及尾巴等胶原蛋白含量少之部位(其无法达到良好的膨润状态)切除，以保留第二纯化后鱼皮的中央部位。中央部位的尺寸为7*24cm。再将中央部位裁切成7*3cm(共8片)。其中，每一片的表面源自中央部位的截面。将每一片浸泡在0.5L/0.1M醋酸溶液6小时，并且冷藏16小时，以得到塑型态片状主体(以下称第三塑型态片状主体)。
接着，第三塑型态片状主体根据前述第四实施例之稳定步骤进行处理，以得到稳定态之光学清晰的片状主体(以下称第十一稳定态片状主体)。
实验15：第一稳定态片状主体的观察
当第十一稳定态片状主体的厚度约为50μm至60μm时，第十一稳定态片状主体的透光度大于或等于95％，且第十一稳定态片状主体的可缝性大于或等于60g。当第十一稳定态片状主体的厚度约为90μm至170μm时，第十一稳定态片状主体的透光度大于或等于90％，且第十一稳定态片状主体的可缝性大于或等于60g。当第十一稳定态片状主体的厚度约为190μm至250μm时，第十一稳定态片状主体的透光度大于或等于85％，且第十一稳定态片状主体的可缝性大于或等于60g。当第十一稳定态片状主体的厚度约为280μm至320μm时，第十一稳定态片状主体的透光度大于或等于70％，且第十一稳定态片状主体的可缝性大于或等于60g。其中，最大可缝性能大于150g。第十一稳定态片状主体的平均极限应力为第七稳定态片状主体的2倍。
实验16：制备胶原蛋白溶液
第二纯化后鱼皮浸泡在0.01M醋酸溶液中2小时，并且除去杂质，以得到塑型态片状主体。接着，再以一萃取程序从塑型态片状主体萃取出胶原蛋白溶液。
实验17：制备胶原蛋白海绵
第二纯化后鱼皮浸泡在0.1M醋酸溶液中1小时，然后冻干，以得到胶原蛋白海绵。
实验18：制备胶原蛋白薄膜
第二纯化后鱼皮浸泡在0.01M醋酸溶液中2小时，然后除去外侧层，以得到塑型态片状主体。接着，再将塑型态片状主体浸泡在0.1M醋酸溶液中1小时，以得到胶原蛋白薄膜。
综上，根据本发明实施例之鱼皮衍生组织修复材料及其制造方法适用于提供组织修复材料，且此组织修复材料适用于作为贴片、敷料、载体、支架、植入物、或药剂来修复各种组织。此组织修复材料具有胶原蛋白以促进损伤组织的修复并具有预期之组织修复应用所需的特定特征。再者，依照目前各研究显示，此组织修复材料无残留人鱼共生疾病(病毒所引发的)的致病因子。