神经酰胺产生促进剂的制造方法 【技术领域】
本发明涉及能够促进皮肤产生神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺的神经酰胺产生 促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法。背景技术
皮肤具有产生神经酰胺 (ceramide) 和葡萄糖神经酰胺 (glucosylceramide) 的 能力。在皮肤中、 特别是表皮角质层中聚集着由表皮细胞合成分泌得到的神经酰胺， 它是 细胞间脂质的主要成分。而由表皮细胞合成得到的神经酰胺暂时以葡萄糖神经酰胺或者 神经鞘磷脂 (sphingomyelin) 的形式被储存起来 ； 之后被排出至细胞外， 在葡糖脑苷酯酶 (glucocerebrosidase) 和神经磷脂酶 (sphingomyelinase) 的作用下， 再次形成神经酰胺， 从而发挥作为细胞间脂质的功能。 皮肤中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺具有提高皮肤的保 湿功能和皮肤的屏障功能等的生理作用。
但是， 近来由于环境、 气候等的影响， 皮肤容易变得干燥， 因此由皮肤自身产生神 经酰胺等来改善皮肤的保湿功能就显得不足够。
因而人们尝试了从外部向皮肤补充神经酰胺的方法。例如， 在专利文献 1 中记载 了培养假丝酵母 (Candida) 属的微生物来制造葡萄糖神经酰胺的方法， 通过将该葡萄糖神 经酰胺涂布在人体的干燥性皮肤上能够改善皮肤的保湿功能。 该方法是直接从培养后的菌 体中获取大量存在的葡萄糖神经酰胺， 因此所合成的葡萄糖神经酰胺的神经酰胺骨架与人 体中存在的神经酰胺类的神经酰胺骨架不同， 其在两处具有碳碳双键且具有支链。 因此， 将 这种从微生物中直接提取得到的葡萄糖神经酰胺涂布在人体皮肤上的话， 有可能不能与人 体皮肤相适应而产生使用安全性方面的问题。
另外， 从外部向皮肤补充神经酰胺的方法与以往使用的保湿剂等同样有保湿效果 的持续性不够的问题， 而且有些状态的皮肤对从外界补给的神经酰胺等的吸收不充分， 从 而导致不能充分发挥保湿效果。
而另一方面， 如果能够增强或促进皮肤本身的神经酰胺或葡萄糖神经酰胺的产生 能力， 则无需从外部补充神经酰胺或葡萄糖神经酰胺， 而能够通过促进皮肤自身产生神经 酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺来提高皮肤的屏障功能和保湿功能。这样， 由于是由皮肤自身 产生神经酰胺或葡萄糖神经酰胺， 所合成的是皮肤所具有的常规结构的神经酰胺等， 因而 其不存在与皮肤的适应性不好等的安全性问题。
因此最近关于在皮肤角质层中产生促进表皮神经酰胺等的生成的物质的研究 相当热门。其中， 作为能够促进神经酰胺生成的物质， 已报道的有以灵芝、 蜂花粉 (Bee Pollen)、 川芎等的提取物为有效成分的神经酰胺产生促进剂 ( 专利文献 2 ～ 4)。然而， 由 于这些神经酰胺产生促进剂全都是从植物原料提取得到， 其提取操作耗费时间长， 且在天 然资源的可利用性方面有限制， 因而其制造成本高。
另外， 在专利文献 5 中， 公开了一种能够活化皮肤表层内部的表皮细胞自身的神 经酰胺合成的神经酰胺合成促进剂， 其以含有烟酸和 / 或烟酰胺的菌培养物为有效成分，该菌培养物可以是乳酸菌培养物、 双歧杆菌培养物、 香菇菌体培养物或者酵母菌培养物。 但 是， 该促进剂的制备过程中使用的培养基实质上以烟酸和 / 或烟酰胺作为有效成分， 因此 这种神经酰胺合成促进剂的制备成本较高。
另外， 毕赤 (Pichia) 属酵母具有如下性质和用途等。
毕赤酵母属菌种细胞呈球形、 椭圆形、 拉长形， 偶尔呈锥形， 但不形成尖顶。 无性繁 殖方式为多边芽殖， 有些种类可形成节孢子。每个子囊通常包含 1 ～ 4 个子囊孢子， 偶尔多 于 4 个。孢子呈帽状、 半球形或球形有棱。子囊成熟后一般裂开， 少数不裂开， 接合或不接 合形成子囊， 接合在母细胞和芽体或两个独立细胞之间发生。 菌丝和假菌丝都可作为子囊， 但形态不会变大或变成纺锤形， 同宗或异宗配合 ； 可同化硝酸盐， DBB 反应阴性。
毕 赤 (Pichia) 属 酵 母 的 分 类 地 位 为 ： 子 囊 菌 门 (Ascomycota)、 半子囊菌纲 (Hemiascomycetes)、 酵母目 (Saccharomycetales)、 酵母菌科 (Saccharomycetaceae)、 毕 赤酵母属 (Pichia)。
毕赤 (Pichia) 属酵母的用途有， 例如， 利用甲醇产生一些有用物质， 如抗生素， 生 物蛋白等 ； 或者也可以作为基因工程菌运用。 巴斯德毕赤酵母用于生产还原型谷胱甘肽， 还 有别的一些毕赤酵母用于生产一些蛋白质 / 酶类。 但是， 目前还没有利用毕赤属酵母来制备神经酰胺产生促进剂或葡萄糖神经酰胺 产生促进剂的报道。
专利文献 1 ： 日本特开 2010-22217 号公报
专利文献 2 ： 日本特开 2005-194240 号公报
专利文献 3 ： 日本特开 2010-70499 号公报
专利文献 4 ： 日本特开 2010-150237 号公报
专利文献 5 ： 日本特开平 9-194383 号公报
发明内容 本发明就是为了解决上述现有技术中存在的技术问题而做出的， 目的在于提供一 种低成本且高效地制造神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的方法。
本发明人为了解决上述技术问题进行了专心研究， 结果发现 ： 在含有豆渣和糖类 的培养基中培养毕赤酵母属 (Pichia) 的微生物， 能够高效地获得神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 ； 从而完成了本发明。
本发明提供一种神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造 方法， 其中， 在含有豆渣和糖类的培养基中培养毕赤酵母属 (Pichia) 的微生物， 从其上清 液中获得神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
根据本发明的制造方法， 能够使用特定的微生物并利用豆渣这样的容易获得的物 质作为培养基的主要原料， 从而能够廉价且高效地获得神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖 神经酰胺产生促进剂， 该促进剂能够有效提高皮肤所具有的产生神经酰胺 / 葡萄糖神经酰 胺的能力， 从而有效提高皮肤的保湿能力。
具体实施方式
本发明的制造方法是在含有豆渣和糖类的培养基中培养毕赤酵母属的微生物， 并从其上清液中获得神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
作为在本发明中使用的毕赤酵母属 (Pichia) 的微生物， 可以列举出食品工业领 域中常用的异常毕赤酵母 (Pichia anomala)、 季也蒙毕赤酵母 (Pichia guilliermondii)、 挪威毕赤酵母 (Pichia norvegensis)、 膜璞毕赤酵母 (Pichia membranifaciens)、 伯顿毕 赤酵母 (Pichia burtonii)、 粉状毕赤酵母 (Pichia farinose)、 克鲁弗毕赤酵母 (Pichia Kluyveri) 等。
其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效果和 / 或葡萄糖神经 酰胺产生促进效果的观点考虑， 优选异常毕赤酵母 (Pichia anomala)、 季也蒙毕赤酵母 (Pichia guilliermondii)、 挪威毕赤酵母 (Pichia norvegensis)、 膜璞毕赤酵母 (Pichia membranifaciens)、 伯顿毕赤酵母 (Pichia burtonii)。
其中， 膜璞毕赤酵母 (Pichia membranifaciens) 又称为膜醭毕赤酵母 (Pichia membranaefaciens)、 嗜 酒 毕 赤 酵 母 (Pichia alcoholophila)、 明 孢 毕 赤 酵 母 (Pichia hyalospora)、 Pichia scaptomyzae、 Willia belgica 或 Zygopichia guilliermondii。
伯 顿 毕 赤 酵 母 (Pichia burtonii) 又 称 为 纤 维 假 丝 酵 母 (Candida fibrae)、 Dematium chodati、 柯 达 氏 拟 内 孢 霉 (Endomycopsis chodati)、 隐伯顿毕赤酵母 (Hyphopichia burtonii) 或贝雷丝孢酵母 (Trichosporon behrendii)。
本发明所涉及的毕赤酵母属 (Pichia) 的微生物都可以从中国普通微生物保藏管 理中心 (CGMCC)、 中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)、 江南大学工业微生物资源和信息中心 (CICIM) 等商业渠道购买得到。
在本发明的制造方法中， 可以单独使用 1 种上述微生物， 也可以组合 2 种以上的上 述微生物进行使用。
本发明中使用的培养基是含有豆渣和糖类的培养基。 豆渣和糖类都是容易获得的 物质， 因而， 本发明的培养基具有成本低的优点。并且， 除此之外， 也可以适当添加例如 1％ 的蛋白胨、 0.5％的酵母粉等。
其中， 豆渣是指， 将大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后粉碎、 再经过滤、 除水、 沥 干而得到的物质。也可以使用食品产业中压榨豆浆等的豆制品制造工序中残留的大豆残 渣。
糖类可以是葡萄糖、 蔗糖、 麦芽糖等， 它们可以任意单独使用或混合使用。而从提 高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑， 其中优选葡萄糖。
从提高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑， 本 发明的培养基优选由豆渣、 葡萄糖和水构成， 进一步优选培养基中豆渣的含量为 5 ～ 20w/ v％、 更优选 8 ～ 12w/v％， 葡萄糖的含量为 0.2 ～ 2w/v％、 更优选 0.8 ～ 1.2w/v％。
从毕赤酵母属 (Pichia) 微生物的生理特性、 以及提高神经酰胺产生促进效果和 葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑， 优选在 27 ～ 35℃下进行上述培养。
从毕赤酵母属 (Pichia) 微生物的生理特性、 以及提高神经酰胺产生促进效果和 葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑， 上述培养时间优选为 1 ～ 7 天， 更优选为 48 ～ 96 小时， 更优选为 68 ～ 76 小时。
从得到更纯的产品的观点出发， 优选将通过所述培养获得的培养物进一步进行精 制从而得到上清液。作为精制的方法， 可以根据需要适当组合使用过滤、 离心分离、 离子交换或吸附色谱、 溶剂提取、 结晶化等的常用的操作来进行。优选通过离心分离获得上清液， 该离心分离的速度优选为 2000 ～ 4000rpm、 更优选为 2500 ～ 3500rpm， 离心时间优选为 0 ～ 20 分钟， 更优选为 5 ～ 15 分钟。
可以在离心后获得的上述上清液中加入乙醇， 用来进行灭菌， 并将加入了乙醇的 上清液作为神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
也可以通过离心分离从培养液中除去菌体， 再超声波处理， 离心分离， 回收上清 液。 接着， 再将回收后的上清液过滤除去杂质等， 真空下干燥处理后作为本发明的神经酰胺 和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
通过培养本发明的毕赤酵母属 (Pichia) 微生物并从培养上清液中得到的大豆残 渣发酵提取物， 具有在正常人体的角化细胞中使神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺的量增加 的作用。
因此， 通过培养本发明的毕赤酵母属 (Pichia) 微生物并从培养上清液中得到的 大豆残渣发酵提取物， 可以用于促进神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生的治疗目的或非 治疗目的的使用， 也可以作为治疗目的或非治疗目的的神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖 神经酰胺产生促进剂使用。非治疗目的的使用是以美容为目的的使用， 或为维持健康状态 的使用等。并且， 所述治疗目的的使用和非治疗目的的使用是可以完全区分地进行的。 通过培养本发明的毕赤酵母属 (Pichia) 微生物并从培养上清液中得到的大豆残 渣发酵提取物， 也可以用于制造神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
本发明的神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂可以作为使角 质层中的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺增加并恢复和提高皮肤的屏障功能和保湿功能 的医药品、 准医药品、 化妆品等使用。另外， 该神经酰胺产生促进剂或葡萄糖神经酰胺产生 促进剂也可以作为以神经酰胺产生促进或葡萄糖神经酰胺产生促进为概念的、 并根据需要 标明该概念的准医药品、 化妆品使用。
作为本发明的神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的使用形 态， 可以是用于向培养细胞中添加的添加剂， 也可以是配合到皮肤洗净剂、 化妆品等皮肤外 用剂中使用。例如， 可以列举化妆水、 乳液、 凝胶、 霜、 软膏等各种形态。而作为外用剂的基 剂， 只要是公知的外用基剂即可， 没有特别限制。在配制各种皮肤外用剂时， 可以单独地使 用本发明的神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂， 或与在皮肤洗净剂和 化妆品等皮肤外用剂中通常配合的油性成分、 保湿剂、 粉体、 色素、 乳化剂、 增溶剂、 紫外线 吸收剂、 增稠剂、 药效成分、 香料、 防菌防霉剂、 植物提取物、 醇类等适当组合来使用。
将本发明的神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂添加到培养 的表皮细胞中来促进神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺的情况下， 作为该促进剂的干燥物的 添加量优选为 0.0001 ～ 10w/v％， 更优选为 0.001 ～ 5w/v％。当添加量为 0.0001w/v％以 上时， 能得到充分的促进效果 ； 而当添加量为 10w/v％以下时， 对表皮细胞的刺激性更小。
将本发明的神经酰胺产生促进剂和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂配合在皮肤 外用剂使用时， 从有效促进神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺的产生、 从而有效提高皮肤的 保湿能力、 而且不易显示出培养物的颜色和气味的观点出发， 其配合量优选为皮肤外用剂 总量的 0.01 ～ 20w/v％， 更优选为 0.1 ～ 10w/v％。
实施例
下面， 基于实施例对本发明进行更详细的说明， 但本发明并不限定于此。
实施例 1
< 神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备 ( 发酵液处理 )>
首先， 按照以下方法制备培养基 ： 将大豆放入水中浸泡 12 小时， 使大豆充分吸收 水分， 然后将吸收了水分的大豆研磨破碎， 将其过滤并除去液体成分， 剩余残渣沥干， 得到 豆渣。将该豆渣与葡萄糖以及水相混合， 并使豆渣和葡萄糖在混合物中的浓度分别达到 10w/v％和 1w/v％， 将该混合物作为培养基。
然 后， 将 100ml 的 上 述 培 养 基 加 至 三 角 烧 瓶 中， 接种一定量的异常毕赤酵母 (Pichia anomala)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编号 360-20-3)， 在 30℃下培养 3 天。
然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 取 1ml 混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 A， 存于 4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。
< 神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的评价 >
( 细胞培养 ) 首先， 取正常人的活化角质化细胞 (Cascade Co.， Ltd) 作为原代细胞， 于 75cm2 培 养瓶中 ( 含有生长因子的培养基 2ml)， 37℃、 CO2 浓度为 5％的条件下培养细胞至 80 ～ 90％ 2 浓度。进行传代， 传代细胞至 175cm 方瓶中继续培养细胞至 80 ～ 90％浓度。然后将传代 后的人体表皮细胞接种到 12 孔板中， 每孔容积为 2ml， 细胞浓度为 1×105 个细胞 /ml， 继续 培养细胞至 80 ～ 90％浓度。
然后， 在上述 12 孔板中更换不含有生长因子的培养基， 将样品 A 和对照品 ( 浓度 为 50v/v％的乙醇水溶液 ) 加入上述 12 孔板中 (n ＝ 2)， 相同培养条件下培养 3 天。
3 天培养后， 弃去上清培养液， 以 2ml PBS( 磷酸盐缓冲液 ) 对细胞进行 2 次清洗， 再加入 1ml 的 PBS 至板孔中， 以细胞收集器 ( 细胞铲 ) 收集细胞至试管中， 以备后续神经酰 胺 / 葡萄糖神经酰胺和蛋白质分析。
( 神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进效果的确认 )
在回收得到的含有细胞的 PBS 溶液中加入甲醇∶氯仿＝ 2.5ml ∶ 1.25ml 的溶剂， 进行振动 20 分钟， 进行离心 (3000rpm， 5 分钟 ) 分离， 从而得到上清液 a 和沉淀 b。将上清 液 a 用于神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺量的分析， 将沉淀 b 用于蛋白质含量的分析。
(1) 神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺量的分析
在由此得到的上清液 a 中加入 PBS ∶氯仿＝ 1.25ml ∶ 1.25ml 的溶剂， 进行振动 20 分钟， 进行离心 (3000rpm， 5 分钟 ) 分离， 得到上下两相。回收下相， 并在 30℃、 氮气保护 下进行干燥 40 分钟。在得到的干燥品中加入 100μl 的氯仿∶甲醇＝ 2ml ∶ 1ml 的溶剂进 行溶解， 并用下述薄板层析 (TLC) 法对其进行神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 ( 分别记为 Cer 和 GlyCer， 单位为 μg/ml) 的解析。
将 神 经 酰 胺 ( 或 葡 萄 糖 神 经 酰 胺 ) 标 准 品 与 样 品 溶 液 点 至 干 燥 TLC 板 上，以 CHCl3 ∶ CH3OH ∶ CH3COOH(190 ∶ 9 ∶ 1v/v/v) 为 展 层 剂 进 行 薄 板 层 析， 待 展 层 剂 行 至 薄 板 顶 端， 以吹风机吹干展层剂 ； 重 复 以 上 步 骤 一 次。 然 后 以 CHCl3 ∶ CH3OH ∶ C3H6O(76 ∶ 20 ∶ 4v/v/v) 为展层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄
板底端 2.5cm 处， 停止展层， 以吹风机吹干。喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180℃烘烤板上烘烤 7 分钟显色。扫描显色 TLC 板并进行神经酰胺 ( 或葡萄糖神经酰胺 ) 分析。
(2) 蛋白质含量的分析
为了表征细胞中的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量分析。在上述 沉淀 b 中加入 90μl 的 SDS( 十二烷基磺酸钠 ) 溶液并进行混合， 在 60℃下加热 2 小时使蛋 白质变性降解， 冷却后在其中添加 100μl 的 2N 的 HCl 溶液， 按照 BCA Kit( 蛋白质定量分 析试剂盒 ) 法测定其中蛋白质的量 ( 记为 Pro， 单位为 μg/ml)。
(3) 分析结果
对于本发明品和对照品的样品， 分别测定 Cer/Pro 和 GlyCer/Pro( 见下式 )。 以对 照品的 Cer/Pro 和 GlyCer/Pro 为 1， 在表 1 中表示本发明品的 Cer/Pro 和 GlyCer/Pro 的相 对值。另外， 以对照品每孔中的蛋白质的量为 100， 求出本发明品的每孔中的蛋白质的量的 相对值 (Pro.(％ ))， 并据此求出每孔的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 ( 相对于对照品的 相对量 )， 即， Cer/Well ＝ Cer/Pro×Pro.(％ )， GlyCer/Well ＝ GlyCer/Pro×Pro.(％ )。 一并在表 1 中表示。 如果 Cer/Pro( 或 Cer/Well) 大于 1( 对照品的值 )， 则表明该样品具有神经酰胺产 生促进效果 ； 如果 GlyCer/Pro( 或 GlyCer/Well) 大于 1( 对照品的值 )， 则表明该样品具有 葡萄糖神经酰胺产生促进效果。
如表 1 所示， 确认了本发明品 A 具有神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产 生促进效果。
实施例 2
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用季也蒙毕 赤酵母 (Pichia guilliermondii)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编 号 422-19-3) 代替异常毕赤酵母 (Pichia anomala)， 并且在豆渣发酵后得到的上清液中加 入 2.5 倍的无水乙醇稀释后， 混合液超声处理 10 分钟， 离心 (3000rpm)10 分钟， 收集上清液 ( 约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神 经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 B、 C， 干燥样品以 50％乙醇溶解， 将样品 B、 C分 别配制成 1％、 0.1％浓度的溶液， 存于 4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。除此之外， 与实 施例 1 同样进行操作， 并评价样品 B、 C 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 结果如 表 1 所示。
如表 1 所示， 确认了本发明品 B、 C 具有神经酰胺产生促进效果。
实施例 3
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用挪威毕 赤酵母 (Pichia norvegensis)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编号 CICIM Y0151) 代替异常毕赤酵母 (Pichia anomala)， 除此以外， 与实施例 1 同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 取 1ml 混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 D， 存于 4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 (3000rpm)10 分钟，
收集上清液 ( 约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为 本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 E、 F， 将样品 E、 F 分别以 50％乙醇 溶解而配制成 1％、 0.1％浓度的溶液， 存于 4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 1 同样的方法评价样品 D、 E、 F 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促 进效果， 结果一并表示在表 1 中。
如表 1 所示， 确认了实施例 3 的样品 D、 E、 F 具有神经酰胺产生促进效果。
实施例 4
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用异常毕赤 酵母 (Pichia anomala)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编号 CICIM Y0297) 代替异常毕赤酵母 ( 编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 1 同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 取 1ml 混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 G， 存于 4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 (3000rpm)10 分钟， 收集上清液 ( 约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为 本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 H， 将样品 H 以 50％乙醇溶解而配 制成 1％浓度的溶液， 存于 4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 1 同样的方法评价样品 G、 H 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进 效果， 结果一并表示在表 1 中。
如表 1 所示， 确认了实施例 4 的样品 G、 H 具有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺产生促 进效果。
实施例 5
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用异常毕赤 酵母 (Pichia anomala)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编号 CICIM Y0349) 代替异常毕赤酵母 (Pichia anomala)( 编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 1 同样 进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 取 1ml 混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 I， 存于 4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 (3000rpm)10 分钟， 收集上清液 ( 约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为 本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 J、 K， 将样品 J、 K 分别以 50％乙醇 溶解而配制成 1％、 0.1％浓度的溶液， 存于 4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 1 同样的方法评价样品 I、 J、 K 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促 进效果， 结果一并表示在表 1 中。
如表 1 所示， 确认了实施例 5 的样品 I、 J、 K 具有神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺 产生促进效果。
实施例 6
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用膜璞毕赤酵母 (Pichia membranifaciens)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编 号 CICIM Y0360) 代替异常毕赤酵母 (Pichia anomala)( 编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施 例 1 同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 取 1ml 混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 L， 存于 4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 (3000rpm)10 分钟， 收集上清液 ( 约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为 本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 M、 N， 将样品 M、 N 分别以 50％乙醇 溶解而配制成 1％、 0.1％浓度的溶液， 存于 4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 1 同样的方法评价样品 L、 M、 N 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促 进效果， 结果一并表示在表 1 中。
如表 1 所示， 确认了实施例 6 的样品 L、 M、 N 具有神经酰胺产生促进效果。
实施例 7
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用异常毕赤 酵母 (Pichia anomala)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编号 CICIM Y0420) 代替异常毕赤酵母 (Pichia anomala)( 编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 1 同样 进行培养。 然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 取 1ml 混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 O， 存于 4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 (3000rpm)10 分钟， 收集上清液 ( 约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为 本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 P、 Q， 将样品 P、 Q 分别以 50％乙醇 溶解而配制成 1％、 0.1％浓度的溶液， 存于 4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 1 同样的方法评价样品 O、 P、 Q 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促 进效果， 结果一并表示在表 1 中。
如表 1 所示， 确认了实施例 7 的样品 O、 P、 Q 具有神经酰胺产生促进效果。
实施例 8
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用异常毕赤 酵母 (Pichia anomala)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编号 CICIM Y0421) 代替异常毕赤酵母 (Pichia anomala)( 编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 1 同样 进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 取 1ml 混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 R， 存于 4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 (3000rpm)10 分钟， 收集上清液 ( 约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为 本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 S、 T， 将样品 S、 T 分别以 50％乙醇
溶解而配制成 1％、 0.1％浓度的溶液， 存于 4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 1 同样的方法评价样品 R、 S、 T 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促 进效果， 结果一并表示在表 1 中。
如表 1 所示， 确认了实施例 8 的样品 R、 S、 T 具有神经酰胺产生促进效果。
实施例 9
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用伯顿毕赤 酵母 (Pichia burtonii)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编号 CICIM Y0424) 代替异常毕赤酵母 ( 编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 1 同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 取 1ml 混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 U， 存于 4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 (3000rpm)10 分钟， 收集上清液 ( 约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为 本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 V， 将样品 V 以 50％乙醇溶解而配 制成 1％浓度的溶液， 存于 4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。 按照与实施例 1 同样的方法评价样品 U、 V 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进 效果， 结果一并表示在表 1 中。
如表 1 所示， 确认了实施例 9 的样品 U、 V 具有神经酰胺产生促进效果。
实施例 10
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用季也蒙毕 赤酵母 (Pichia guilliermondii)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编 号 CICIM Y0440) 代替异常毕赤酵母 ( 编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 1 同样进行培 养。
然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 取 1ml 混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 W， 存于 4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。
按照与实施例 1 同样的方法评价样品 W 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进效 果， 结果一并表示在表 1 中。
如表 1 所示， 确认了实施例 10 的样品 W 具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。
实施例 11
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用季也蒙毕 赤酵母 (Pichia guilliermondii)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编 号 CICIM Y0326) 代替异常毕赤酵母 ( 编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 1 同样进行培 养。
然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 取 1ml 混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 X， 存于 4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 (3000rpm)10 分钟， 收集上清液 ( 约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为
本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 Y， 将样品 Y 以 50％乙醇溶解而配 制成 0.1％浓度的溶液， 存于 4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 1 同样的方法评价样品 X、 Y 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进 效果， 结果一并表示在表 1 中。
如表 1 所示， 确认了实施例 11 的样品 X、 Y 具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。
实施例 12
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用季也蒙毕 赤酵母 (Pichia guilliermondii)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编 号 CICIM Y0329) 代替异常毕赤酵母 ( 编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 1 同样进行培 养。
然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 取 1ml 混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 Z， 存于 4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 (3000rpm)10 分钟， 收集上清液 ( 约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为 本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 a， 将样品 a 以 50％乙醇溶解而配 制成 1％浓度的溶液， 存于 4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。 按照与实施例 1 同样的方法评价样品 Z、 a 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进 效果， 结果一并表示在表 1 中。
如表 1 所示， 确认了实施例 12 的样品 Z、 a 具有神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产 生促进效果。
实施例 13
在实施例 1 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中， 用季也蒙毕 赤酵母 (Pichia guilliermondii)( 保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心 CICIM， 编 号 CICIM Y0414) 代替异常毕赤酵母 ( 编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 1 同样进行培 养。
然后将所得到的培养物离心分离 (3000rpm， 10 分钟 )。剩余上清液加入 2.5 倍的 无水乙醇稀释， 对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 (3000rpm)10 分钟， 收集上清液 ( 约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 b， 将样品 b 以 50％乙醇溶解 而配制成 1％浓度的溶液， 存于 4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 1 同样的方法评价样品 b 的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进效 果， 结果一并表示在表 1 中。
如表 1 所示， 确认了实施例 13 的样品 b 具有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺产生促进 效果。
表1
另外， 对于样品 A ～ Z 和 a、 b， 不将其加入到上述含角质化细胞的 12 孔板中 ( 即，不进行上述细胞培养 ) 而直接进行神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺量的分析， 除此以外的操作 与上述实施例 1 同样进行。结果确认了样品 A ～ Z 和 a、 b 本身中没有神经酰胺或葡萄糖神 经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰胺， 但本发明品具有 神经酰胺产生促进效果和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 可以作为神经酰胺和 / 或葡 萄糖神经酰胺产生促进剂使用。15