一种花药特异表达启动子及其应用 技术领域 本发明属于生物技术和植物学领域 ； 更具体地， 本发明涉及一种花药特异表达启 动子及其应用。
背景技术 人类通过对自然突变基因和重组体的选择与利用， 对作物的品种进行改良已有近 千年的历史。 近百年来， 通常采用人工杂交的方法， 实现优良基因的重组和外源基因的导入 培育作物新品种。 杂交育种技术能够实现种内基因转移， 但是， 亲缘关系较远的品种之间的 基因转移则存在障碍 ； 另一方面， 杂交育种技术不能准确选择和操纵某个基因， 因此， 增加 了育种结果的复杂性。
通过转基因的手段进行作物品种的选育， 其优势在于转基因不受生物体间亲缘关 系的限制， 从转基因的技术角度来讲， 候选转化的基因来源几乎不受限制 ； 因此， 本发明人 可以通过转基因的手段聚合各种有效基因， 培育高产、 优质、 抗逆的作物新品种。 另一方面， 转基因技术所操作和转移的基因是功能明确、 控制目标性状的基因， 因此， 转基因后代的表 型更具有可预见性。目前， 转基因技术已经成为作物品种改良的重要手段， 转基因大豆、 玉 米、 棉花和油菜的种植面积已达 4 种作物全球总种植面积的 25％ (James， 2005 ； Sankula et al.， 2005)。
在植物的转基因中需要两个必需的元件， 即启动子和目的基因。启动子是位于基 因转录起始位点上游的顺式调控序列， 与反式作用的识别因子结合， 通过识别因子与 RNA 聚合酶的相互作用， 启动基因的转录 ； 因此， 启动子调控基因的表达模式， 即目的基因表达 的时空特异性及表达的强度， 是转基因成败或成效高低的关键因素之一。
针对转基因的目的不同， 转化的基因选择不同的表达模式， 主要包括组成型高表 达、 组织特异性表达及诱导型表达等。如在棉花、 玉米、 水稻等农作物中转入苏云金芽孢杆 菌 (Bacillus thuringiensis， Bt) 的抗虫蛋白采用的是组成型高表达的方式， 在作物中高 剂量表达 Bt 抗虫蛋白的优势在于高剂量可以确保杀虫的效果， 同时有利于延长 Bt 抗虫蛋 白的有效期。在金稻谷 (Golden rice) 的创制过程中， 其目标是通过在水稻胚乳中引入了 维生素 A 前体的合成途径， 从而在稻米中强化维生素 A， 解决维生素 A 营养缺乏的问题 ； 因 此， 转基因时采用的启动子为在水稻胚乳中特异表达的谷蛋白启动子。在植物抗病基因的 转化中， 常采用病原菌诱导表达的启动子。
随着转基因农作物在全球的大面积推广， 启动子在转基因中的重要性得到广泛的 共识， 本发明人需要不同类型的启动子帮助本发明人提供转基因表达模式的解决方案。例 如， 在水稻组织特异启动子的研究领域中， 人们最为关注的是花药特异的启动子。 水稻花药 是水稻雄性配子花粉产生的器官， 与水稻穗的发育、 育种及水稻的产量等密切相关。
因此， 本领域需要进一步研究植物花药特异性表达的启动子， 以用于在花药中特 异性表达一些功能基因或结构基因， 达到品种改良的目的。
发明内容 本发明的目的在于提供一种花药特异表达启动子及其应用。
在本发明的第一方面， 提供一种分离的多核苷酸 ( 启动子 )， 所述的多核苷酸 ：
(a) 位于 osigcfa001g12 基因 (GenBank 登录号 ： CT833313) 的 5’ 端及其上游 ；
(b) 碱基长度为 200-2000 个 ；
(c) 具有引发转录的必要位点及转录起始点 ； 且
(d) 具有在植物花药中特异表达功能。
在本发明的一个优选例中， 所述的 osigcfa001g12 基因来源于禾本科植物 ； 更佳 地来源于水稻 (Oryza Sativa)。
在本发明的一个优选例中， (a) 中， 位于 osigcfa001g12 基因上游 -1000 至编码区 第 100 位。
在本发明的另一优选例中， 所述的多核苷酸是 ：
(1)SEQ ID NO ： 1 中第 1-521 位所示的核苷酸序列的多核苷酸 ；
(2)SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示的核苷酸序列的多核苷酸 ；
(3)(1) 或 (2) 任一限定的多核苷酸， 其中第 1-22 位碱基缺失 ( 即 ： SEQ ID NO ： 1 中第 23-552 位所示的核苷酸序列的多核苷酸 ； 或： SEQ ID NO ： 1 中第 23-521 位所示的核苷 酸序列的多核苷酸 ) ；
(4) 由 SEQ ID NO ： 1 中 (1-22) ～ (521-552) 位所示的核苷酸序列构成的多核苷酸； (6) 核苷酸序列在严格条件下能够与 (1)-(4) 任一限定的多核苷酸序列杂交且具 有指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸 ；
(7) 核苷酸序列与 (1)-(4) 任一限定的多核苷酸序列有 80％以上 ( 较佳地 85％以 上； 更佳地 90％以上 ； 更佳地 95％以上 ； 更佳地 99％以上 ； ) 同源性且具有指导目的基因在 植物花药中特异表达功能的多核苷酸 ； 或
(8) 核苷酸序列与 (1)-(4) 任一限定的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸。
在本发明的另一优选例中， 所述的多核苷酸是 ： 基于 SEQ ID NO ： 1 中第 1-521 位 或 SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示核苷酸序列， 第 436-442 位、 第 146-153 位、 第 278-283、 第 305-311 位和 / 或第 287-312 位 (26bp) 核苷酸序列不变， 其它位点与 (1)-(4) 任一限定 的多核苷酸序列具有 50％ ( 较佳地 60％ ； 更佳地 70％ ； 更佳地 80％ ； 更佳地 90％ ； 更佳地 95％ ； 更佳地 99％ ) 以上相同性的， 且指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷 酸。
在本发明的另一优选例中， 所述的多核苷酸是 ： 基于 SEQ ID NO ： 1 中第 1-521 位或 SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示核苷酸序列， 第 99-104 位、 第 115-120 位和 / 或第 131-138 位核苷酸序列不变， 其它位点与 (1)-(4) 任一限定的多核苷酸序列具有 50％ ( 较佳地 60％； 更佳地 70％ ； 更佳地 80％ ； 更佳地 90％ ； 更佳地 95％ ； 更佳地 99％ ) 以上相同性的， 且具有 指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸。
在本发明的另一优选例中， 所述的植物是单子叶植物。
在本发明的另一优选例中， 所述的植物包括 ( 但不限于 ) ： 禾本科植物、 石蒜科植 物、 百合科植物、 鸢尾科植物、 或薯蓣科植物等。
更优选的， 所述的植物是禾本科植物。 例如所述植物包括但不限于 ： 水稻、 小麦、 大 麦、 玉米、 高粱等。
在本发明的另一方面， 提供所述的多核苷酸的用途， 用于指导目的基因在植物花 药中特异表达。
在本发明的另一方面， 提供一种载体， 所述的载体含有所述的多核苷酸， 作为启动 子元件。
在本发明的一个优选例中， 所述的载体还含有与所述的多核苷酸操作性连接的目 的基因。
在本发明的另一优选例中， 所述的目的基因是结构基因。
在本发明的另一优选例中， 所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。
在本发明的另一优选例中， 所述的目的基因是外源基因。
在 本 发 明 的 另 一 优 选 例 中， 所述的目的基因包括 ( 但不限于 ) ： 细胞毒基因 (Cytotoxic gene)， 如来自于解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 的核糖核酸 酶 (Barnase) 基因或者连接来自于曲霉菌 (Aspergillus oryzae) 的核糖核酸酶 T1(RNase T1) 基因 ； 拟南芥中影响花药绒粘层功能及花粉形成的 DYT1 基因， ABORTED MICROSPORE 基因 (AMS) 及 MALE STERILITY 1 基因 (MS1) 等 ； 水稻中影响绒粘层功能及花粉形成的 MULTIPLE SPOROCYTE1 基因 (MSP1)， OsTDL1A 基因， UNDEVELOPED TAPETUM 基因 (OsUDT1) 及 TAPETUM DEGENERATION RETARDATION 基因 (OsTDR) 等。
在本发明的另一优选例中， 所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游， 且与所述 多核苷酸的间隔小于 1000bp。优选的， 小于 500bp ； 更优选的， 小于 100bp ； 最优选的， 小于 50bp。
在本发明的另一方面， 提供一种遗传工程化的宿主细胞， 所述的细胞 ：
含有所述的载体 ； 或
其基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面， 提供一种使目的基因在植物花药中特异表达的方法， 所述 的方法包括 ：
将构建物转化植物细胞， 所述的构建物含有所述的多核苷酸以及与所述的多核苷 酸操作性连接的目的基因 ；
筛选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞 ； 和
将所述植物细胞再生成植株。
在本发明的另一优选例中， 所述的方法包括 ：
(a) 提供携带表达载体的农杆菌， 所述表达载体中含有构建物， 所述的构建物含有 所述的多核苷酸以及与所述的多核苷酸操作性连接的目的基因 ；
(b) 将植物细胞、 组织或器官与步骤 (a) 中的农杆菌接触， 从而使所述的构建物转 入植物细胞。
在本发明的另一优选例中， 所述方法还包括 ：
(c) 选择出转入了所述构建物的植物细胞、 组织或器官 ； 以及
(d) 将步骤 (c) 中的植物细胞、 组织或器官再生成植物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见的。 附图说明 图 1 显示了 PCR 扩增潮霉素序列 ( 转基因载体中用于抗性筛选的基因 )， 鉴定转 基因水稻苗中是否含有 T-DNA 插入的电泳结果。M， DNA Marker DL2000(DNA 分子量标准 ) ； 1-12 代表来自于不同转基因系 (lines) 的不同转基因植株的鉴定结果。
图 2 显示了启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。其中 ：
A， 水稻幼穗中的 GUS 染色 ；
B， 水稻颖花中的 GUS 染色 ；
C， 与图 B 为同一阶段， 将颖花的两片颖壳 ( 内颖与外颖 ) 剥开来， 箭头所指的为特 异染成蓝色的花药组织 ；
D， 水稻颖花中的 GUS 染色 ； a， 花药 ； s， 柱头 ； o， 子房。
E， 开花后的颖花的 GUS 染色 ；
F， 与图 E 为同一阶段， 将颖花的两片颖壳剥掉， 显示雄蕊及雌蕊的染色 ； a， 花药 ； s， 柱头 ； o， 子房。
G， 与图 E 为同一阶段， 放大的花药部分， 显示花药染色 ；
H， 与图 E 为同一阶段， 显示花粉染色 ；
I， 根的 GUS 染色 ；
J， 叶片的 GUS 染色 ；
K， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色 ；
L， 茎的 GUS 染色 ；
图中， G、 H 中的标尺为 100μm， 其它图中的标尺均为 1mm。
图 3 显示了花药切片中 GUS 染色结果， 蓝色表明 GUS 染色为阳性。A， 花药 ； T， 绒粘 层； L： 颖壳 ； E， 表皮 ； MC， 减数分裂的细胞。
图 4 显示了 GUS 基因在穗中特异高表达的定量结果的柱形图。
图 5、 M1 启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。
A， 根的 GUS 染色 ； B， 叶片的 GUS 染色 ； C， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色 ； D， 茎的 GUS 染色 ； E， 花的 GUS 染色。图中的标尺均为 1mm。
图 6、 M2 启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。
A， 根的 GUS 染色 ； B， 叶片的 GUS 染色 ； C， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色 ； D， 茎的 GUS 染色 ； E， 花的 GUS 染色。图中的标尺均为 1mm。
图 7、 M3 启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。
A， 根的 GUS 染色 ； B， 叶片的 GUS 染色 ； C， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色 ； D， 茎的 GUS 染色 ； E， 花的 GUS 染色。图中的标尺均为 1mm。
图 8、 M4 启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。
A， 根的 GUS 染色 ； B， 叶片的 GUS 染色 ； C， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色 ； D， 茎的 GUS 染色 ； E， 花的 GUS 染色。图中的标尺均为 1mm。
图 9、 启动子及其截短形式的 GUS 定量结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 首次分离到一个可在植物花药中特异性表达的 启动子。所述的启动子可指导目的基因在植物花药中特异性高表达， 而在植物的其它组织 中低表达或不表达。
术语
如本文所用， 所述的 “植物” 主要是指单子叶植物， 包括 ( 但不限于 ) ： 禾本科植物、 石蒜科植物、 百合科植物、 鸢尾科植物、 或薯蓣科植物等。 更优选的， 所述的植物是禾本科植 物， 包括但不限于 ： 水稻、 小麦、 大麦、 玉米、 高粱等。
如本文所用， “分离的” 是指物质从其原始环境中分离出来 ( 如果是天然的物质， 原 始环境即是天然环境 )。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开， 则为分离纯化 的。
如本文所用， 所述的 “可操作地连接” 或 “操作性连接” 是指两个或多个核酸区域 或核酸序列的功能性的空间排列。例如 ： 启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定 位置， 使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导， 从而， 启动子区域被 “可操作地连接” 到该核酸序列上。 如本文所用， 所述的 “启动子” 或 “启动子区 ( 域 )” 是指一种核酸序列， 其通常存 在于目的基因编码序列的上游 (5’ 端 )， 能够引导核酸序列转录为 mRNA。一般地， 启动子或 启动子区提供 RNA 聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中， 所述 的启动子或启动子区包括启动子的变体， 其通过插入或删除调控区域， 进行随机或定点突 变等来获得。
如本文所用， 术语 “特异性表达” 是指目的基因在特定的时间和 / 或特定的组织表 达。
如本文所用， “组织特异性启动子” 又称 “器官特异性启动子” ， 在这类启动子调控 下， 基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达， 并表现出发育调节的特性。本发明中， 所述的 “组织特异性启动子” 是植物花药特异表达启动子。
通常， 如果在某组织或器官中 mRNA 以比在其它组织或器官中高至少 10 倍， 优选至 少高 100 倍， 更优选至少高 1000 倍水平被表达， 则该启动子被认为是组织或器官特异性的。
如本文所用， “外源的” 或 “异源的” 是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质 序列之间的关系。 例如， 如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的， 则启动子 对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是 “外源的” 。
如本文所用， “顺式调控元件” 是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保 守性碱基序列。
如本文所用， “目的基因” 是指可由本发明的启动子启动或指导表达的基因。合 适的目的基因包括但不限于 ： 改良植物品质、 性状或代谢相关的基因。合适的目的基因 包括但不限于 ： 细 胞 毒 基 因 (Cytotoxic gene)， 如 来 自 于 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 的核糖核酸酶 (Barnase) 基因或者连接来自于曲霉菌 (Aspergillus oryzae) 的核糖核酸酶 T1(RNase T1) 基因 ； 拟南芥中影响花药绒粘层功能及花粉形成 的 DYT1 基因， ABORTED MICROSPORE 基因 (AMS) 及 MALE STERILITY 1 基因 (MS1) 等。水
稻中影响绒粘层功能及花粉形成的 MULTIPLE SPOROCYTE1 基因 (MSP1)， OsTDL1A 基因， UNDEVELOPED TAPETUM 基因 (OsUDT1) 及 TAPETUM DEGENERATION RETARDATION 基因 (OsTDR) 等。
如本文所用， 所述的 “含有” ， “具有” 或 “包括” 包括了 “包含” 、 “主要由 ...... 构 成” 、 “基 本 上 由 ...... 构 成” 、 和 “由 ...... 构 成” “主 要 由 ...... 构 成” ； 、 “基 本 上 由 ...... 构成” 和 “由 ...... 构成” 属于 “含有” 、 “具有” 或 “包括” 的下位概念。
如本文所用， 所述的 “SEQ ID NO ： 1 中 (1-22) ～ (521-552) 位所示的核苷酸序列” 也即指所述序列可起始于 SEQ ID NO ： 1 中第 1 位至第 22 中的任一位的碱基， 终止于 SEQ ID NO ： 1 中第 521 位至第 552 位的任一位的碱基。
启动子
本发明提供一种花药特异性表达启动子， 所述的启动子具有以下特点 ： (a) 位于 osigcfa001g12 基因的 5’ 端及其上游 ； (b) 碱基长度为 200-2000 个 ； (c) 具有引发转录的 必要位点及转录起始点 ； 且 (d) 具有在植物花药中特异表达功能。
本发明的启动子具有引发转录的必要位点及转录起始点， 本发明人具体地研究了 该启动子的发挥功能的关键位点， 包括 ： 序列及 26bp 序列 盒 (TATAAAT)， (CCAATGCA)， 这些位点是本发明的启动子发挥启动基因表达功能以及发挥花药特异性表达功能的关键区域。
作为本发明的一种实施方式， 所述的启动子具有 SEQ ID NO ： 1 中第 1-521 位、 第 1-552 位、 第 23-552 位所示的核苷酸序列。
多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术， 特定的一对核酸的杂交特性指示 它们的相似性或同一性。因此， 本发明还涉及与前述指定的核苷酸序列杂交且两个序列之 间具有至少 50％， 较佳地至少 70％， 更佳地至少 80％ ( 例如 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％、 或 99％ ) 相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸 可杂交的多核苷酸。
“严格条件” (或 “严紧条件” ) 是指 ： (1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗 脱， 如 0.2×SSC， 0.1％ SDS， 60℃； 或 (2) 杂交时加有变性剂， 如 50％ (v/v) 甲酰胺， 0.1％小 牛血清 /0.1％ Ficoll， 42℃等 ； 或 (3) 仅在两条序列之间的相同性至少在 50％， 优选 60％ 以上、 65％以上、 70％以上、 75％以上、 80％以上、 85％以上或 90％以上， 更优选是 95％以上 时才发生杂交。 并且， 可杂交的多核苷酸也具有指导目的基因在花药中特异性表达的功能。
本发明还包括与本发明的任一种启动子序列具有 50％或以上 ( 优选 60％以上， 70％以上， 80％以上， 更优选 90％以上， 最优选 95％以上， 如 98％、 99％ ) 相同性的核酸， 所 述核酸也具有指导目的基因在花药中特异性表达功能。 “相同性” 是指按照位置相同的百分 比， 两条或多条核酸之间的相似水平 ( 即序列同源性、 相似性或同一性 )。
应理解， 尽管本发明的实例中提供了来源于水稻的该启动子及其功能， 然而， 来源 于其它单子叶植物的与该启动子具有一定相同性 ( 保守性 ) 的启动子也包括在本发明的范 围内， 只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植 物中分离得到该启动子。
启动目的基因表达
本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上， 该目的基因相对于启动子而言可以是外源 ( 异源 ) 的。对所述目的基因的核酸序列没有特别的限制 ( 如一种结构性核 酸序列 )， 所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白， 例如某些在农业或植物改良上具 有重要特性或功能的蛋白。
本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上， 该目的基因 相对于启动子是外源 ( 异源 ) 的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例 如， 目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量， 提高氨基酸序列的翻译， 改变翻译后的 修饰 ( 如磷酸化位点 )， 将翻译产物转运到细胞外， 改善蛋白的稳定性， 插入或删除细胞信 号等。
此外， 启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接 到目的基因序列上来实现， 该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反 义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。
任何一种前述的启动子和 / 或目的基因序列可被包含在重组载体中。
作为一种方式， 所述的重组载体包括本发明的启动子， 在所述启动子的下游包含 多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时， 将目的基因连接入适合的多克 隆位点或酶切位点内， 从而将目的基因与启动子可操作地连接。
作为另一种方式， 所述的重组载体包括 ( 从 5’ 到 3’ 方向 ) ： 启动子， 和目的基因。 如果需要， 所述的重组载体还可以包括 3’ 转录终止子， 3’ 多聚核苷酸化信号， 其它非翻译核 酸序列， 转运和靶向核酸序列、 抗性选择标记、 增强子或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语 “重组表达载体” 指本领域熟知 的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之， 只要 其能够在宿主体内复制和稳定， 任何质粒和载体都是可以被采用的。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和 / 或目的 基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组 DNA 技术、 DNA 合成技术、 体内重组技术等。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外， 表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转化 的宿主细胞的表型性状， 如二氢叶酸还原酶、 新霉素抗性、 潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白 (GFP) 等。
重组载体中除了含有本发明的启动子， 还可含有一种或多种其它启动子。所述的 其它启动子例如是 ： 组织特异性的、 组成型的或诱导型的。 例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花 叶病毒 19S 和 35S(CaMV19S CaMV35S)、 增强的 CaMV、 烟草 RB7 等。
包含上述适当的启动子和目的基因的载体， 可以用于转化适当的宿主细胞， 以使 其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞 ； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞 ； 或是高 等真核细胞， 如植物细胞。代表性例子有 ： 大肠杆菌， 链霉菌属、 农杆菌 ； 真菌细胞如酵母 ； 植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。
用重组 DNA 转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA 的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用 CaCl2 法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用 MgCl2。如果需要， 转化也可用电穿孔 的方法进行。当宿主是真核生物， 可选用如下的 DNA 转染方法 ： 磷酸钙共沉淀法， 常规机械方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等。 转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方 法， 例如叶盘法、 幼胚转化法、 花芽浸泡法等。 对于转化的植物细胞、 组织或器官可以用常规 方法再生成植株， 从而获得转基因的植物。
作为一种方式， 制备转基因植物的方法是 ： 将携带启动子和目的基因 ( 两者可操 作地连接 ) 的载体转入农杆菌， 农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的 染色体上。涉及的转基因受体植物例如是水稻、 小麦、 拟南芥、 烟草、 果树等。
在本发明的实例中， 所述的重组载体是 pCambia 载体， 其自带 β- 葡萄糖苷酶 (GUS) 基因， 将本发明的启动子构建到该载体中 GUS 基因的上游， 转化植株， 启动子将激活 GUS 基因的表达， 所述启动受到启动子区各顺式作用元件的调控， 模拟了基因在体内被激活 转录的状况。 β- 葡萄糖苷酶 (GUS) 能催化裂解一系列的 β- 葡萄糖苷， 产生具有发色团或 荧光的物质， 可用分光光度计、 荧光计或组织化学等方法对 GUS 活性进行定量和空间定位 分析。在本技术领域中， GUS 基因已被广泛地用作转基因植物、 细菌和真菌的报告基因， 特 别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。
应用
本发明的花药特异性启动子在理论研究和农艺改良中具有重要的应用价值。 本发 明可广泛应用于植物基因工程 ： 启动子作为植物基因工程中一个重要工具可与目标基因融 合， 通过转基因载体， 转化植物并获得转基因植株。 水稻花药特异启动子的应用价值， 包括但不限于以下的方面 ：
a、 利用水稻花药特异启动子创制水稻雄性不育系
在水稻杂交育种的过程中需要雄性不育系 (Male sterility)， 人们利用雄性不育 这一特性， 免去了人工去雄的操作过程， 从而节约了杂交育种的大量人力和时间。因此， 雄 性不育的植株具有重大的经济价值。利用水稻花药特异启动子可以创制雄性不育系。水稻 花药特异启动子连接细胞毒基因 (Cytotoxic gene)， 如来自于解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 的核糖核酸酶 (Barnase) 基因或者连接来自于曲霉菌 (Aspergillus oryzae) 的核糖核酸酶 T1(RNase T1) 基因， Barnase 与 RNase T1 基因在其表达的细胞中破 坏细胞的正常发育， 因此， 借助于 Barnase 或者 RNase T1 基因在花药中的特异表达， 可以抑 制花药的正常发育， 从而获得水稻雄性不育系。
b、 利用水稻花药特异启动子控制转基因在田间的基因扩散
目前， 转基因田间控制的一个重要问题是转基因作物的飘粉问题。转基因花粉不 受控制的传播会对周围环境中的其他物种造成基因污染， 水稻花药特异启动子可以帮助解 决这个问题。 如上所述， 将水稻花药特异启动子连接 Barnase， 一同转化水稻， 这样得到的水 稻转基因植株， 不能形成正常的花粉 ； 因此， 避免了转基因植株的花粉对周围环境中其他物 种造成的基因污染。
c、 利用水稻花药特异启动子研究影响水稻穗发育的重要基因， 为增加农作物产 量、 改进品质、 增加抗性提供优异的种源
花药特异启动子调控基因在花药中特异表达， 其表达部位集中在花药， 在其他组 织中不表达， 或者表达量很低。与组成型启动子相比较， 花药特异启动子的优势在于， 它使 得目的基因特异作用于花药器官， 减少了对水稻其他组织可能的影响。为通过基因工程的 方法进行水稻品种的改良提供重要的操作手段。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室指南 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和 份数按重量计算。
除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例 1、 水稻组织特异启动子的筛选及基因表达的鉴定
本发明人构建了水稻孕穗期的穗、 14 天幼苗的地上部分及根等组织的全长 cDNA 文库 (Liu， XH， Lu TT， Yu SL， Li Y， Huang YC.， Huang T.， Zhang L.， Zhu JJ， Zhao Q， Fan DL， Mu J， Shangguan YY， Feng Q， Guan JP， Ying K， Zhang Y， Lin ZX， Sun ZX， Qian Q， Lu YP， Han B.(2007)A collection of 10,096indica rice full-length cDNAs reveals highly expressed sequence divergencebetween Oryza sativa indica and japonica subspecies.Plant Mol Biol.65 ： 403-415)。在每个文库分别进行 2 万个克隆的 5’ 末端测 序。在每个文库 cDNA 冗余度统计的过程中， 本发明人发现每种组织的 cDNA 文库中都存在 一些拷贝数很高的 cDNA 克隆。将每个文库中 cDNA 的拷贝数， 按照从高到低排序， 找出每个 文库中 cDNA 拷贝数位于前 20 位的 cDNA ； 然后， 统计这些 cDNA 在水稻其他组织的 cDNA 文 库中的拷贝数， 如果这些 cDNA 在其他组织的文库不出现， 则这些 cDNA 成为组织特异性高表 达启动子分离的候选基因。 然后， 本发明人在水稻孕穗期的穗、 14 天幼苗的地上部分以及根 中， 通过 Real time RT-PCR 的方法对候选基因表达的组织特异性进行鉴定， 进一步确定候 选基因。
水稻花药特异启动子的克隆及水稻的转化 ： 通过候选基因全长 cDNA 序列与水稻 基因组序列的比对， 可以得到基因的上游调控区序列， 即启动子序列。然后通过 PCR 方法克 隆启动子序列， 将启动子序列插入到 pCambia1305.2( 获自 Cambia 公司 ) 表达载体 ( 含 GUS 报告基因 ) 的 BamHI 及 NcoI 位点间， 常规农杆菌法转化水稻， 通过检测转基因水稻中 GUS 基因的表达来鉴定启动子的表达特性。
实施例 2、 水稻花药特异启动子的筛选及基因表达组织特异性的鉴定
通过对水稻穗全长 cDNA 文库中全长 cDNA 拷贝数的统计， 本发明人得到了一个水 稻穗特异表达基因的候选基因， osigcfa001g12(GenBank 登录号 ： CT833313)。
然后， 本发明人对 osigcfa001g12 在水稻孕穗期的穗、 14 天幼苗的地上部分及根 中的表达进行 Realtime RT-PCR 的鉴定。以水稻组成型表达基因 actin1 作为参照基因， 结 果如表 1。表中 osigcfa001g12 基因的表达量是相对于参照基因 actin1 的相对表达量。
表1
上述结果表明， osigcfa001g12 在穗中的表达非常高， 而在水稻根及幼苗中表达非 常低。osigcfa001g12 是在穗中特异高表达的基因。实施例 3、 水稻花药特异启动子的序列分析、 启动子的克隆及转基因载体的构建 osigcfa001g12 基因的启动子区序列及基因编码区序列如 SEQ ID NO ： 1。 其中 ： 方 显示的为基因的编码区， 盒 (TATAAAT) 及 标示的为框表示的是蛋白的起始密码子及终止密码子。 基因的 5’ UTR 及 3’ UTR 区。双下划线为 体加着重号为 位点。
(CCAATGCA)。斜及序列。5’ 端 20 个碱基为用于扩增启动子区的引物对应的SEQ ID NO ： 1： ACCTCAGCCAAAACCGAAGACAGTACCGCCGAAGGACCTTATTTAA ACGGTTTTGTTAAGTTGGGGGACCCATCGTACCCGGTTTTGCGACC GGGGACGAAAATCGGACTAGGTGATAAATAGAGGGACCCAAAGTG AACTTATA ATTTCATATCAAACAGTCACGGATGGGCTT TAGGAAAGCAGAACTGGGCCCGGCCCAGTAGATCACATAGCCCAA CAAGATCTAAACCGCATGCTCTCGTTTCAACAAATTATCACACCGA TTG CATCTGCTGCACAGGCTAAAT GTAGCCATGA ACCATTCACCTCACAAGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGTTACCA GTGCAGGACGAAATGCTCAACTAGCCCAAGCAAGAATGGAGCATG ACAACCTCAGGCACCAAAAGCTC TCAAAAGTTTCC ATTTGCATTGCACAAA
GTGAGCAGGCTTCA CTTGATTGGCCACACTGATCACCTGGGTAAGAACTGACAATAACAC GCCGGCTCCTCTGGATTGCGACTTCCAGTGGGGCCCAGGTGTCGGT GTCAGCTGGGTAAGTTGGTGTCATCTGGTATGGGAAACTTTGATGT TTTGTACATGTGGTGGTGCTCTTGTCAACATTATATAGATAAGGAG AGAATAGGACAAACATGACGCTTGAATAGCAGAAGAGAAGTTCTA TCCAGCAATATCAAAAGTACAGCTGTCATTTTCAAAAAATGTAAAA CAAAAATAAAACGAAAAACCCACTATACTAGTGCCAATAAAAGAA GAAACAAAAGAGAACTACATTATTGTCAATGCCATTTGTTGATGTT ATTATTACTTTTGTTTATAAGAATAACAATTGTACTTATAAGGCCTACGATTTATTACAG本发明人选择的转基因载体为 pCambia1305.2， 克隆的酶切位点选择 BamHI 及 NcoI。pCambia1305.2 通过 BamHI 及 NcoI 酶切， 将载体中原有的 35S 启动子切掉， 割胶回收 得到载体片段。
扩增的 PCR 片段内无 BamHI 切点， 但是有 NcoI 切点。因此本发明人在设计的反向 引物中加入 BsaI 切点， 引物序列如下 ：
正向引物 ： ggatccacctcagccaaaaccgaaga(SEQ ID NO ： 2) ；
反向引物 ： ggtctc ccatgg cagccaggctagaagacttg(SEQ ID NO ： 3) ；
BsaI 的识别位点为 ggtctc， 酶切位点为其后的第 1 个及第 5 个碱基， 因此， 实际切 点仍然为 NcoI 切点 ccatgg。这样 PCR 产物经过 BamHI 及 BsaI 酶切后， 可以与经过 BamHI 及 NcoI 酶切的 pCambia1305.2 连接， 得到启动子转基因载体。
需要说明的是， 启动子与 pCambia1305.2 连接后， 在 GUS 蛋白编码序列前， 本发明 人引入了 osigcfa001g12 基因 N 端的 10 氨基酸编码序列， 因此， 表达的 GUS 蛋白是 N 端含 有 osigcfa001g12 基因 10 个氨基酸的融合蛋白。融合蛋白不影响 osigcfa001g12 启动子 表达组织特异性的鉴定。
实施例 4、 水稻的转化及转基因水稻中 GUS 基因的表达鉴定
本发明人通过农杆菌转化水稻幼胚的方法进行水稻的转化。启动子转基因载 体转入农杆菌 EHA105( 参见 Hood， E.E.， Gelvin， S.B.， Melchers， L.S. 和 Hoekema， A.， Transgenic Res.， 1993， 2， 208-218)， 然后通过 EHA105 转化日本晴 ( 获自中国水稻所 ) 幼 胚得到启动子的转基因植株。日本晴的幼胚首先经过次氯酸钠消毒， 置于诱导培养基上诱 导愈伤组织的产生。幼胚诱导产生的愈伤与农杆菌 26℃、 黑暗中共培养 3 天。然后， 转入含 有 40mg/l 潮霉素及 300mg/l 头孢霉素的筛选培养基上培养 4 个星期。 筛选得到的抗性愈伤 转入含有 0.5mg/l 萘乙酸 (NAA)， 4mg/l 激动素 (kinetin)， 6mg/l 6- 苄基氨基嘌呤 (6-BA)， 40mg/l 潮霉素， 300mg/l 头孢霉素的再生培养基， 培养 2-3 个星期。之后， 得到的再生小苗 转入 1/2MS 生根培养基中进行生根培养。2-3 个星期后， 转基因苗移入人工气候室培养。
通过水稻的转化， 本发明人得到 5-10 个系 (lines) 的转基因植株进行启动子活性 的鉴定。首先， 转基因水稻进行 T-DNA 插入的鉴定。抽提转基因水稻苗的基因组 DNA， 以转 基因水稻苗的基因组 DNA 为模板， PCR 扩增潮霉素序列 ( 转基因载体中用于抗性筛选的基 因 )， 鉴定转基因水稻苗中是否含有 T-DNA 插入， 见图 1。PCR 扩增阳性表明 T-DNA 插入为阳 性。通常筛选得到的转基因水稻中基本上都含有 T-DNA 插入。
实施例 5、 启动子转基因阳性植株的 GUS 活性鉴定 转基因植株的根、 叶片、 茎及花等组织浸于 GUS 染色液中， 37 ℃， 过夜。第二天，70-75％乙醇脱色， 将组织中的叶绿素脱掉。然后， 在解剖显微镜下观察并记录 GUS 染色的 结果。水稻 GUS 染色液的组分为 ：
Na2HPO4/NaH2PO4(1M， pH7.0) 5ml ；
X-Gluc 100mg ；
Triton X-100 0.5ml ；
甲醇 10ml ；
灭菌水 余量 ；
总体积 100ml。
报告基因 GUS 染色的结果 ：
图 2 显示的是启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。
A， 水稻幼穗中的 GUS 染色。幼穗长约 7mm， 水稻颖花长约 1mm。此时， 颖壳是透明 的， 无染色 ； 仅花药特异染色阳性。说明启动子调控基因在花药中特异表达。
B， 水稻颖花中的 GUS 染色。颖花长约 3.78mm， 此时， 颖壳无染色 ； 花药特异染色阳 性。
C， 与图 B 为同一阶段， 本发明人将颖花的两片颖壳 ( 内颖与外颖 ) 剥开来， 箭头所 指的为特异染成蓝色的花药组织。
D， 水稻颖花中的 GUS 染色， 颖花长约 6.53mm。颖壳无染色 ； 雌蕊的柱头及子房无 染色 ； 雄蕊的花药特异染成蓝色。启动子调控基因在花药中特异表达。
E， 开花后的颖花， 颖花长约 6.58mm。颖壳无染色， 花药特异染色蓝色。
F， 与图 E 为同一阶段， 将颖花的两片颖壳剥掉， 显示雄蕊及雌蕊的染色。雌蕊的柱 头无染色， 在花柱的起始位置及子房的基部有淡的染色 ； 花药染色为很强的阳性。
G， 与图 E 为同一阶段， 放大的花药部分， 显示花药为强的阳性。
H， 与图 E 为同一阶段， 花粉染色为阳性。
A-H 显示的是颖花的 GUS 染色， 在颖花发育的不同阶段 (1mm-7mm)， 均为花药特异 表达。
I， 根的 GUS 染色为阴性。
J， 叶片的 GUS 染色为阴性。
K， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色为阴性。
L， 茎的 GUS 染色。 节间的 GUS 染色为阴性， 节的 GUS 染色为很淡的阳性。 a， anther， 花药 ； s， stigma， 柱头 ； o， ovary， 子房。
结论 ： osigcfa001g12 基因的启动子连接 GUS 报告基因， 转化水稻， 通过转基因植 株中 GUS 报告基因的组化染色鉴定， 证明 osigcfa001g12 的启动子调控基因在水稻颖花雄 蕊的花药组织中特异高表达， 在颖壳， 雌蕊中不表达。在根、 叶片、 叶鞘中均不表达。在茎的 节间中不表达， 但是在茎的节中仅有很弱的表达。
花药的切片 ： 花药切片结果见图 3， 其中蓝色表明 GUS 染色为阳性。
图 A 结果表明， GUS 在花药的绒粘层细胞中特异表达， 在颖壳中不表达。 A， anther， 花药 ； T， Tapetum， 绒粘层 ； L， Lemma， 颖壳。图 B， 放大的花药部分， 显示 GUS 在绒粘层中特异 表达。E， epidermis， 表皮 ； MC， meiotic cell， 减数分裂的细胞。
在水稻的叶片、 叶鞘、 茎、 穗中的定量的结果也证实， GUS 基因特异性地在穗中特异高表达， 见图 4。
实施例 6、 启动子保留功能的变体研究
如前所述， 本发明的启动子区序列如 SEQ ID NO ： 1 中第 1-521 位所示， 而 SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示的序列也具有启动子的作用。经鉴定， 位于 SEQID NO ： 1 中第 436-442 位的
盒 (TATAAAT)、 第 146-153 位的(CCAATGCA) 为启动子发挥功能的关键位点 ( 引发转录的必要位点及转录起始点 )。 在 osigcfa001g12 基因的启动子区， 除了 TATA 盒 (TATAAAT) 及 CAAT 盒 (CCAATGCA) 外， 本发明人还找到了 ： E- 盒， 序列为 5’ -CATTTG-3’ (SEQ ID NO ： 1 中第 278-283 位 )。 E- 盒 是脂转运蛋白 (Lipid transfer protein) 基因家族的启动子区的顺式调控组件， 为转录因 子结合位点， 提示其是调控花药特异表达的关键位点。
此外， CAAACAC 序列是脂转运蛋白基因家族的启动子区的顺式调控组件， 是影响启 动子强度的关键位点。
因此， 基上述关键位点， 本发明人进行了启动子变体研究。
M1 ：
本发明人制备了基于 SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示序列的启动子， 其中 5’ 端减 少 22 个碱基 (M1)。基于关键位点的分析， TATA 盒， CAAT 盒， E- 盒和 CAAACAC 序列这些作 为保守性的位点保持不变。序列如下 ( 单下划线为用于扩增的引物序列 ) ：
GTACCGCCGAAGGACCTTATTTAAACGGTTTTGTTAAGTTGGGGGACCCA
TCGTACCCGGTTTTGCGACCGGGGACGAAAATCGGACTAGGTGATAAAT
AGAGGGACCCAAAGTGAACTTATA ATTTCATATCAAACAGT
CACGGATGGGCTTTAGGAAAGCAGAACTGGGCCCGGCCCAGTAGATCAC
ATAGCCCAACAAGATCTAAACCGCATGCTCTCGTTTCAACAAATTATCAC
ACCGATTGCATCTGCTGCACAGGCTAAATGTAGCCATGAACCATTCACCTCACAAGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGTTACCAGTG CAGGACGAAATGCTCAACTAGCCCAAGCAAGAATGGAGCATGACAACCT CAGGCACCAAAAGCTC ATTTGCATTGCACAAATCAAAAGTTTCC
启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果如图 5。
转基因水稻 GUS 染色的结果表明， 在水稻颖花中， 颖壳无 GUS 染色 ； 花药特异染色 阳性 ( 显示蓝色 ) ； 此外， 在根、 叶片、 叶鞘、 茎中均不表达。M1 启动子具有指导目的基因在 植物花药中特异表达的功能。
M2 ：
本发明人制备了较 M1 短 135bp 序列的启动子， 其中 5’ 端减少 135bp(M2)。基于关 键位点的分析， CAAT 盒 (CCAATGCA) 缺失， 而 TATA 盒， E- 盒和 CAAACAC 序列这些作为保守性 的位点保持不变。序列如下 ( 单下划线为用于扩增的引物序列 ) ：
CATATCAAACAGTCACGGATGGGCTTTAGGAAAGCAGAACTGGGCCCG GCCCAGTAGATCACATAGCCCAACAAGATCTAAACCGCATGCTCTCGTT TCAACAAATTATCACACCGATTG T CATCTGCTGCACAGGCTAAA GTAGCCATGAACCATTCACCTCACAAGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGTTACCAGTGCAGGACGAAATGCTCAACTAGCCCAAGCAA GAATGGAGCATGACAACCTCAGGCACCAAAAGCTC ATTTGC ATTGCACAAATCAAAAGTTTCC启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果见图 6。
可见， 截短的启动子 M2 转化水稻， 指导 GUS 报告基因在水稻颖花的花药中表达 ； 在 叶片及叶鞘中表达。但是， 在根中不表达， 在茎中不表达或者表达弱。
从上述 M2 与 M1 转基因植株 GUS 染色结果的比较来看， 在减少的 135bp 区域内同 时含有调控在叶片、 叶鞘中转录的关键位点， 此位点缺失后， 表现为在叶片与叶鞘中表达。
M3 ：
本发明人制备了较 M2 短 129bp 序列的启动子， 其中 5’ 端减少 129 个碱基 (M3)。 基于关键位点的分析， CAAT 盒 (CCAATGCA)、 E- 盒缺失， 而 TATA 盒和 CAAACAC 序列这些作为 保守性的位点保持不变。序列如下 ( 单下划线为用于扩增的引物序列 ) ：
GTAGCCATGAACCATTCACCTCACA AGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGTTACCAGTGCAGGACGAAATGCTC AACTAGCCCAAGCAAGAATGGAGCATGACAACCTCAGGCACCAAAAGC TC ATTTGCATTGCACAAATCAAAAGTTTCC
启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果见如图 7。可见， 截短的启动子 M3 转化水稻， 指导 GUS 报告基因在水稻颖花的花药中表达， 在 叶片、 叶鞘、 茎中表达 ； 但是在根中不表达。另外， 在颖花的颖尖中表达。
从上述 M3 与 M2 转基因植株 GUS 染色结果的比较来看， 在此 129bp 区域内含有调 控在茎中转录的关键位点， 此位点缺失后， 表现为在茎中高表达。
M2 启动子与 SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示序列的启动子 (Pro-osigcfa001g12) 相比， 其 5’ 端减少 157bp ； M3 又比 M2 减少 129bp ； 它们的 GUS 定量结果如图 9。图中所示， M4 启动子的强度相比于 Pro-osigcfa001g12 显著降低， 但与 M5 没有显著差异， 可见在这 157bp 中含有调控启动子在花药中表达强度的 motif ； 在此区段内有 CAAT 盒， CAAT 盒可能 通过同源序列的比对， 发现 GTGA 的 motif， GTGA 的 影响 GUS 报告基因的表达强度。另外， motif 可能影响启动子中在花药中的表达强度。M4 ：
本发明人制备了较 M3 短 26bp 序列的启动子， 其中 5’ 端减少 26 个碱基 (M4)。基 于关键位点的分析， CAAT 盒 (CCAATGCA)、 E- 盒、 CAAACAC 序列缺失， 而 TATA 盒作为保守性 的位点保持不变。序列如下 ( 单下划线为用于扩增的引物序列 ) ：
TAGCCATGAACCATTCACCTCACAAGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGT
TACCAGTGCAGGACGAAATGCTCAACTAGCCCAAGCAAGAATGGAGCAT
GACAACCTCAGGCACCAAAAGCTC AAAAGTTTCCATTTGCATTGCACAAATCM4 启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果见图 8。
可见， 截短的启动子 M4 转化水稻， 转基因水稻 GUS 染色的结果表明， 根， 叶片， 叶 鞘， 茎的节间， 以及花药的 GUS 染色均为阴性 ； 仅茎的节部位 GUS 染色为弱阳性 ( 显淡的蓝 色 )。
M4 较 M3 短 26bp， 从上述 M4 与 M3 转基因植株 GUS 染色结果的比较来看， 在缺失 这 26bp 序列的情况下， 启动子在叶片， 叶鞘， 茎的节间及花药中的表达消失了。在茎的节的 GUS 表达强度上也有非常显著的降低。因此， 这 26bp 是调控 osigcfa001g12 基因转录的关 键 motif， 也是花药表达的关键 motif。
实施例 7、 水稻花药特异启动子的序列分析
通过同源比对， 找到其他几个顺式调控组件，
GT1consensus ： 以下序列中第 99-104 位115-120 位与光调控基因表达相关。推测可能参与叶片、 叶鞘中基因表达的调控。
序列 ： 以下序列中第 131-138 位。与多个顺式调控组件具有序列 同源性， 如 CACTFTPPCA1， DOFCOREZM， TBOXATGAPB 等， 推测可能参与叶片、 叶鞘中基因表达 的调控。
ACCTCAGCCAAAACCGAAGACAGTACCGCCGAAGGACCTTATTTAAAC
GGTTTTGTTAAGTTGGGGGACCCATCGTACCCGGTTTTGCGACCGGGGA
C CGGACTAGGT TAGAGGGACC ACTTATA
背景技术 人类通过对自然突变基因和重组体的选择与利用， 对作物的品种进行改良已有近 千年的历史。 近百年来， 通常采用人工杂交的方法， 实现优良基因的重组和外源基因的导入 培育作物新品种。 杂交育种技术能够实现种内基因转移， 但是， 亲缘关系较远的品种之间的 基因转移则存在障碍 ； 另一方面， 杂交育种技术不能准确选择和操纵某个基因， 因此， 增加 了育种结果的复杂性。
通过转基因的手段进行作物品种的选育， 其优势在于转基因不受生物体间亲缘关 系的限制， 从转基因的技术角度来讲， 候选转化的基因来源几乎不受限制 ； 因此， 本发明人 可以通过转基因的手段聚合各种有效基因， 培育高产、 优质、 抗逆的作物新品种。 另一方面， 转基因技术所操作和转移的基因是功能明确、 控制目标性状的基因， 因此， 转基因后代的表 型更具有可预见性。目前， 转基因技术已经成为作物品种改良的重要手段， 转基因大豆、 玉 米、 棉花和油菜的种植面积已达 4 种作物全球总种植面积的 25％ (James， 2005 ； Sankula et al.， 2005)。
在植物的转基因中需要两个必需的元件， 即启动子和目的基因。启动子是位于基 因转录起始位点上游的顺式调控序列， 与反式作用的识别因子结合， 通过识别因子与 RNA 聚合酶的相互作用， 启动基因的转录 ； 因此， 启动子调控基因的表达模式， 即目的基因表达 的时空特异性及表达的强度， 是转基因成败或成效高低的关键因素之一。
针对转基因的目的不同， 转化的基因选择不同的表达模式， 主要包括组成型高表 达、 组织特异性表达及诱导型表达等。如在棉花、 玉米、 水稻等农作物中转入苏云金芽孢杆 菌 (Bacillus thuringiensis， Bt) 的抗虫蛋白采用的是组成型高表达的方式， 在作物中高 剂量表达 Bt 抗虫蛋白的优势在于高剂量可以确保杀虫的效果， 同时有利于延长 Bt 抗虫蛋 白的有效期。在金稻谷 (Golden rice) 的创制过程中， 其目标是通过在水稻胚乳中引入了 维生素 A 前体的合成途径， 从而在稻米中强化维生素 A， 解决维生素 A 营养缺乏的问题 ； 因 此， 转基因时采用的启动子为在水稻胚乳中特异表达的谷蛋白启动子。在植物抗病基因的 转化中， 常采用病原菌诱导表达的启动子。
随着转基因农作物在全球的大面积推广， 启动子在转基因中的重要性得到广泛的 共识， 本发明人需要不同类型的启动子帮助本发明人提供转基因表达模式的解决方案。例 如， 在水稻组织特异启动子的研究领域中， 人们最为关注的是花药特异的启动子。 水稻花药 是水稻雄性配子花粉产生的器官， 与水稻穗的发育、 育种及水稻的产量等密切相关。
因此， 本领域需要进一步研究植物花药特异性表达的启动子， 以用于在花药中特 异性表达一些功能基因或结构基因， 达到品种改良的目的。
发明内容 本发明的目的在于提供一种花药特异表达启动子及其应用。
在本发明的第一方面， 提供一种分离的多核苷酸 ( 启动子 )， 所述的多核苷酸 ：
(a) 位于 osigcfa001g12 基因 (GenBank 登录号 ： CT833313) 的 5’ 端及其上游 ；
(b) 碱基长度为 200-2000 个 ；
(c) 具有引发转录的必要位点及转录起始点 ； 且
(d) 具有在植物花药中特异表达功能。
在本发明的一个优选例中， 所述的 osigcfa001g12 基因来源于禾本科植物 ； 更佳 地来源于水稻 (Oryza Sativa)。
在本发明的一个优选例中， (a) 中， 位于 osigcfa001g12 基因上游 -1000 至编码区 第 100 位。
在本发明的另一优选例中， 所述的多核苷酸是 ：
(1)SEQ ID NO ： 1 中第 1-521 位所示的核苷酸序列的多核苷酸 ；
(2)SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示的核苷酸序列的多核苷酸 ；
(3)(1) 或 (2) 任一限定的多核苷酸， 其中第 1-22 位碱基缺失 ( 即 ： SEQ ID NO ： 1 中第 23-552 位所示的核苷酸序列的多核苷酸 ； 或： SEQ ID NO ： 1 中第 23-521 位所示的核苷 酸序列的多核苷酸 ) ；
(4) 由 SEQ ID NO ： 1 中 (1-22) ～ (521-552) 位所示的核苷酸序列构成的多核苷酸； (6) 核苷酸序列在严格条件下能够与 (1)-(4) 任一限定的多核苷酸序列杂交且具 有指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸 ；
(7) 核苷酸序列与 (1)-(4) 任一限定的多核苷酸序列有 80％以上 ( 较佳地 85％以 上； 更佳地 90％以上 ； 更佳地 95％以上 ； 更佳地 99％以上 ； ) 同源性且具有指导目的基因在 植物花药中特异表达功能的多核苷酸 ； 或
(8) 核苷酸序列与 (1)-(4) 任一限定的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸。
在本发明的另一优选例中， 所述的多核苷酸是 ： 基于 SEQ ID NO ： 1 中第 1-521 位 或 SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示核苷酸序列， 第 436-442 位、 第 146-153 位、 第 278-283、 第 305-311 位和 / 或第 287-312 位 (26bp) 核苷酸序列不变， 其它位点与 (1)-(4) 任一限定 的多核苷酸序列具有 50％ ( 较佳地 60％ ； 更佳地 70％ ； 更佳地 80％ ； 更佳地 90％ ； 更佳地 95％ ； 更佳地 99％ ) 以上相同性的， 且指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷 酸。
在本发明的另一优选例中， 所述的多核苷酸是 ： 基于 SEQ ID NO ： 1 中第 1-521 位或 SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示核苷酸序列， 第 99-104 位、 第 115-120 位和 / 或第 131-138 位核苷酸序列不变， 其它位点与 (1)-(4) 任一限定的多核苷酸序列具有 50％ ( 较佳地 60％； 更佳地 70％ ； 更佳地 80％ ； 更佳地 90％ ； 更佳地 95％ ； 更佳地 99％ ) 以上相同性的， 且具有 指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸。
在本发明的另一优选例中， 所述的植物是单子叶植物。
在本发明的另一优选例中， 所述的植物包括 ( 但不限于 ) ： 禾本科植物、 石蒜科植 物、 百合科植物、 鸢尾科植物、 或薯蓣科植物等。
更优选的， 所述的植物是禾本科植物。 例如所述植物包括但不限于 ： 水稻、 小麦、 大 麦、 玉米、 高粱等。
在本发明的另一方面， 提供所述的多核苷酸的用途， 用于指导目的基因在植物花 药中特异表达。
在本发明的另一方面， 提供一种载体， 所述的载体含有所述的多核苷酸， 作为启动 子元件。
在本发明的一个优选例中， 所述的载体还含有与所述的多核苷酸操作性连接的目 的基因。
在本发明的另一优选例中， 所述的目的基因是结构基因。
在本发明的另一优选例中， 所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。
在本发明的另一优选例中， 所述的目的基因是外源基因。
在 本 发 明 的 另 一 优 选 例 中， 所述的目的基因包括 ( 但不限于 ) ： 细胞毒基因 (Cytotoxic gene)， 如来自于解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 的核糖核酸 酶 (Barnase) 基因或者连接来自于曲霉菌 (Aspergillus oryzae) 的核糖核酸酶 T1(RNase T1) 基因 ； 拟南芥中影响花药绒粘层功能及花粉形成的 DYT1 基因， ABORTED MICROSPORE 基因 (AMS) 及 MALE STERILITY 1 基因 (MS1) 等 ； 水稻中影响绒粘层功能及花粉形成的 MULTIPLE SPOROCYTE1 基因 (MSP1)， OsTDL1A 基因， UNDEVELOPED TAPETUM 基因 (OsUDT1) 及 TAPETUM DEGENERATION RETARDATION 基因 (OsTDR) 等。
在本发明的另一优选例中， 所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游， 且与所述 多核苷酸的间隔小于 1000bp。优选的， 小于 500bp ； 更优选的， 小于 100bp ； 最优选的， 小于 50bp。
在本发明的另一方面， 提供一种遗传工程化的宿主细胞， 所述的细胞 ：
含有所述的载体 ； 或
其基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面， 提供一种使目的基因在植物花药中特异表达的方法， 所述 的方法包括 ：
将构建物转化植物细胞， 所述的构建物含有所述的多核苷酸以及与所述的多核苷 酸操作性连接的目的基因 ；
筛选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞 ； 和
将所述植物细胞再生成植株。
在本发明的另一优选例中， 所述的方法包括 ：
(a) 提供携带表达载体的农杆菌， 所述表达载体中含有构建物， 所述的构建物含有 所述的多核苷酸以及与所述的多核苷酸操作性连接的目的基因 ；
(b) 将植物细胞、 组织或器官与步骤 (a) 中的农杆菌接触， 从而使所述的构建物转 入植物细胞。
在本发明的另一优选例中， 所述方法还包括 ：
(c) 选择出转入了所述构建物的植物细胞、 组织或器官 ； 以及
(d) 将步骤 (c) 中的植物细胞、 组织或器官再生成植物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见的。 附图说明 图 1 显示了 PCR 扩增潮霉素序列 ( 转基因载体中用于抗性筛选的基因 )， 鉴定转 基因水稻苗中是否含有 T-DNA 插入的电泳结果。M， DNA Marker DL2000(DNA 分子量标准 ) ； 1-12 代表来自于不同转基因系 (lines) 的不同转基因植株的鉴定结果。
图 2 显示了启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。其中 ：
A， 水稻幼穗中的 GUS 染色 ；
B， 水稻颖花中的 GUS 染色 ；
C， 与图 B 为同一阶段， 将颖花的两片颖壳 ( 内颖与外颖 ) 剥开来， 箭头所指的为特 异染成蓝色的花药组织 ；
D， 水稻颖花中的 GUS 染色 ； a， 花药 ； s， 柱头 ； o， 子房。
E， 开花后的颖花的 GUS 染色 ；
F， 与图 E 为同一阶段， 将颖花的两片颖壳剥掉， 显示雄蕊及雌蕊的染色 ； a， 花药 ； s， 柱头 ； o， 子房。
G， 与图 E 为同一阶段， 放大的花药部分， 显示花药染色 ；
H， 与图 E 为同一阶段， 显示花粉染色 ；
I， 根的 GUS 染色 ；
J， 叶片的 GUS 染色 ；
K， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色 ；
L， 茎的 GUS 染色 ；
图中， G、 H 中的标尺为 100μm， 其它图中的标尺均为 1mm。
图 3 显示了花药切片中 GUS 染色结果， 蓝色表明 GUS 染色为阳性。A， 花药 ； T， 绒粘 层； L： 颖壳 ； E， 表皮 ； MC， 减数分裂的细胞。
图 4 显示了 GUS 基因在穗中特异高表达的定量结果的柱形图。
图 5、 M1 启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。
A， 根的 GUS 染色 ； B， 叶片的 GUS 染色 ； C， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色 ； D， 茎的 GUS 染色 ； E， 花的 GUS 染色。图中的标尺均为 1mm。
图 6、 M2 启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。
A， 根的 GUS 染色 ； B， 叶片的 GUS 染色 ； C， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色 ； D， 茎的 GUS 染色 ； E， 花的 GUS 染色。图中的标尺均为 1mm。
图 7、 M3 启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。
A， 根的 GUS 染色 ； B， 叶片的 GUS 染色 ； C， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色 ； D， 茎的 GUS 染色 ； E， 花的 GUS 染色。图中的标尺均为 1mm。
图 8、 M4 启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。
A， 根的 GUS 染色 ； B， 叶片的 GUS 染色 ； C， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色 ； D， 茎的 GUS 染色 ； E， 花的 GUS 染色。图中的标尺均为 1mm。
图 9、 启动子及其截短形式的 GUS 定量结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 首次分离到一个可在植物花药中特异性表达的 启动子。所述的启动子可指导目的基因在植物花药中特异性高表达， 而在植物的其它组织 中低表达或不表达。
术语
如本文所用， 所述的 “植物” 主要是指单子叶植物， 包括 ( 但不限于 ) ： 禾本科植物、 石蒜科植物、 百合科植物、 鸢尾科植物、 或薯蓣科植物等。 更优选的， 所述的植物是禾本科植 物， 包括但不限于 ： 水稻、 小麦、 大麦、 玉米、 高粱等。
如本文所用， “分离的” 是指物质从其原始环境中分离出来 ( 如果是天然的物质， 原 始环境即是天然环境 )。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开， 则为分离纯化 的。
如本文所用， 所述的 “可操作地连接” 或 “操作性连接” 是指两个或多个核酸区域 或核酸序列的功能性的空间排列。例如 ： 启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定 位置， 使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导， 从而， 启动子区域被 “可操作地连接” 到该核酸序列上。 如本文所用， 所述的 “启动子” 或 “启动子区 ( 域 )” 是指一种核酸序列， 其通常存 在于目的基因编码序列的上游 (5’ 端 )， 能够引导核酸序列转录为 mRNA。一般地， 启动子或 启动子区提供 RNA 聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中， 所述 的启动子或启动子区包括启动子的变体， 其通过插入或删除调控区域， 进行随机或定点突 变等来获得。
如本文所用， 术语 “特异性表达” 是指目的基因在特定的时间和 / 或特定的组织表 达。
如本文所用， “组织特异性启动子” 又称 “器官特异性启动子” ， 在这类启动子调控 下， 基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达， 并表现出发育调节的特性。本发明中， 所述的 “组织特异性启动子” 是植物花药特异表达启动子。
通常， 如果在某组织或器官中 mRNA 以比在其它组织或器官中高至少 10 倍， 优选至 少高 100 倍， 更优选至少高 1000 倍水平被表达， 则该启动子被认为是组织或器官特异性的。
如本文所用， “外源的” 或 “异源的” 是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质 序列之间的关系。 例如， 如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的， 则启动子 对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是 “外源的” 。
如本文所用， “顺式调控元件” 是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保 守性碱基序列。
如本文所用， “目的基因” 是指可由本发明的启动子启动或指导表达的基因。合 适的目的基因包括但不限于 ： 改良植物品质、 性状或代谢相关的基因。合适的目的基因 包括但不限于 ： 细 胞 毒 基 因 (Cytotoxic gene)， 如 来 自 于 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 的核糖核酸酶 (Barnase) 基因或者连接来自于曲霉菌 (Aspergillus oryzae) 的核糖核酸酶 T1(RNase T1) 基因 ； 拟南芥中影响花药绒粘层功能及花粉形成 的 DYT1 基因， ABORTED MICROSPORE 基因 (AMS) 及 MALE STERILITY 1 基因 (MS1) 等。水
稻中影响绒粘层功能及花粉形成的 MULTIPLE SPOROCYTE1 基因 (MSP1)， OsTDL1A 基因， UNDEVELOPED TAPETUM 基因 (OsUDT1) 及 TAPETUM DEGENERATION RETARDATION 基因 (OsTDR) 等。
如本文所用， 所述的 “含有” ， “具有” 或 “包括” 包括了 “包含” 、 “主要由 ...... 构 成” 、 “基 本 上 由 ...... 构 成” 、 和 “由 ...... 构 成” “主 要 由 ...... 构 成” ； 、 “基 本 上 由 ...... 构成” 和 “由 ...... 构成” 属于 “含有” 、 “具有” 或 “包括” 的下位概念。
如本文所用， 所述的 “SEQ ID NO ： 1 中 (1-22) ～ (521-552) 位所示的核苷酸序列” 也即指所述序列可起始于 SEQ ID NO ： 1 中第 1 位至第 22 中的任一位的碱基， 终止于 SEQ ID NO ： 1 中第 521 位至第 552 位的任一位的碱基。
启动子
本发明提供一种花药特异性表达启动子， 所述的启动子具有以下特点 ： (a) 位于 osigcfa001g12 基因的 5’ 端及其上游 ； (b) 碱基长度为 200-2000 个 ； (c) 具有引发转录的 必要位点及转录起始点 ； 且 (d) 具有在植物花药中特异表达功能。
本发明的启动子具有引发转录的必要位点及转录起始点， 本发明人具体地研究了 该启动子的发挥功能的关键位点， 包括 ： 序列及 26bp 序列 盒 (TATAAAT)， (CCAATGCA)， 这些位点是本发明的启动子发挥启动基因表达功能以及发挥花药特异性表达功能的关键区域。
作为本发明的一种实施方式， 所述的启动子具有 SEQ ID NO ： 1 中第 1-521 位、 第 1-552 位、 第 23-552 位所示的核苷酸序列。
多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术， 特定的一对核酸的杂交特性指示 它们的相似性或同一性。因此， 本发明还涉及与前述指定的核苷酸序列杂交且两个序列之 间具有至少 50％， 较佳地至少 70％， 更佳地至少 80％ ( 例如 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％、 或 99％ ) 相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸 可杂交的多核苷酸。
“严格条件” (或 “严紧条件” ) 是指 ： (1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗 脱， 如 0.2×SSC， 0.1％ SDS， 60℃； 或 (2) 杂交时加有变性剂， 如 50％ (v/v) 甲酰胺， 0.1％小 牛血清 /0.1％ Ficoll， 42℃等 ； 或 (3) 仅在两条序列之间的相同性至少在 50％， 优选 60％ 以上、 65％以上、 70％以上、 75％以上、 80％以上、 85％以上或 90％以上， 更优选是 95％以上 时才发生杂交。 并且， 可杂交的多核苷酸也具有指导目的基因在花药中特异性表达的功能。
本发明还包括与本发明的任一种启动子序列具有 50％或以上 ( 优选 60％以上， 70％以上， 80％以上， 更优选 90％以上， 最优选 95％以上， 如 98％、 99％ ) 相同性的核酸， 所 述核酸也具有指导目的基因在花药中特异性表达功能。 “相同性” 是指按照位置相同的百分 比， 两条或多条核酸之间的相似水平 ( 即序列同源性、 相似性或同一性 )。
应理解， 尽管本发明的实例中提供了来源于水稻的该启动子及其功能， 然而， 来源 于其它单子叶植物的与该启动子具有一定相同性 ( 保守性 ) 的启动子也包括在本发明的范 围内， 只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植 物中分离得到该启动子。
启动目的基因表达
本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上， 该目的基因相对于启动子而言可以是外源 ( 异源 ) 的。对所述目的基因的核酸序列没有特别的限制 ( 如一种结构性核 酸序列 )， 所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白， 例如某些在农业或植物改良上具 有重要特性或功能的蛋白。
本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上， 该目的基因 相对于启动子是外源 ( 异源 ) 的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例 如， 目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量， 提高氨基酸序列的翻译， 改变翻译后的 修饰 ( 如磷酸化位点 )， 将翻译产物转运到细胞外， 改善蛋白的稳定性， 插入或删除细胞信 号等。
此外， 启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接 到目的基因序列上来实现， 该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反 义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。
任何一种前述的启动子和 / 或目的基因序列可被包含在重组载体中。
作为一种方式， 所述的重组载体包括本发明的启动子， 在所述启动子的下游包含 多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时， 将目的基因连接入适合的多克 隆位点或酶切位点内， 从而将目的基因与启动子可操作地连接。
作为另一种方式， 所述的重组载体包括 ( 从 5’ 到 3’ 方向 ) ： 启动子， 和目的基因。 如果需要， 所述的重组载体还可以包括 3’ 转录终止子， 3’ 多聚核苷酸化信号， 其它非翻译核 酸序列， 转运和靶向核酸序列、 抗性选择标记、 增强子或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语 “重组表达载体” 指本领域熟知 的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之， 只要 其能够在宿主体内复制和稳定， 任何质粒和载体都是可以被采用的。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和 / 或目的 基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组 DNA 技术、 DNA 合成技术、 体内重组技术等。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外， 表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转化 的宿主细胞的表型性状， 如二氢叶酸还原酶、 新霉素抗性、 潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白 (GFP) 等。
重组载体中除了含有本发明的启动子， 还可含有一种或多种其它启动子。所述的 其它启动子例如是 ： 组织特异性的、 组成型的或诱导型的。 例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花 叶病毒 19S 和 35S(CaMV19S CaMV35S)、 增强的 CaMV、 烟草 RB7 等。
包含上述适当的启动子和目的基因的载体， 可以用于转化适当的宿主细胞， 以使 其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞 ； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞 ； 或是高 等真核细胞， 如植物细胞。代表性例子有 ： 大肠杆菌， 链霉菌属、 农杆菌 ； 真菌细胞如酵母 ； 植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。
用重组 DNA 转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA 的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用 CaCl2 法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用 MgCl2。如果需要， 转化也可用电穿孔 的方法进行。当宿主是真核生物， 可选用如下的 DNA 转染方法 ： 磷酸钙共沉淀法， 常规机械方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等。 转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方 法， 例如叶盘法、 幼胚转化法、 花芽浸泡法等。 对于转化的植物细胞、 组织或器官可以用常规 方法再生成植株， 从而获得转基因的植物。
作为一种方式， 制备转基因植物的方法是 ： 将携带启动子和目的基因 ( 两者可操 作地连接 ) 的载体转入农杆菌， 农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的 染色体上。涉及的转基因受体植物例如是水稻、 小麦、 拟南芥、 烟草、 果树等。
在本发明的实例中， 所述的重组载体是 pCambia 载体， 其自带 β- 葡萄糖苷酶 (GUS) 基因， 将本发明的启动子构建到该载体中 GUS 基因的上游， 转化植株， 启动子将激活 GUS 基因的表达， 所述启动受到启动子区各顺式作用元件的调控， 模拟了基因在体内被激活 转录的状况。 β- 葡萄糖苷酶 (GUS) 能催化裂解一系列的 β- 葡萄糖苷， 产生具有发色团或 荧光的物质， 可用分光光度计、 荧光计或组织化学等方法对 GUS 活性进行定量和空间定位 分析。在本技术领域中， GUS 基因已被广泛地用作转基因植物、 细菌和真菌的报告基因， 特 别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。
应用
本发明的花药特异性启动子在理论研究和农艺改良中具有重要的应用价值。 本发 明可广泛应用于植物基因工程 ： 启动子作为植物基因工程中一个重要工具可与目标基因融 合， 通过转基因载体， 转化植物并获得转基因植株。 水稻花药特异启动子的应用价值， 包括但不限于以下的方面 ：
a、 利用水稻花药特异启动子创制水稻雄性不育系
在水稻杂交育种的过程中需要雄性不育系 (Male sterility)， 人们利用雄性不育 这一特性， 免去了人工去雄的操作过程， 从而节约了杂交育种的大量人力和时间。因此， 雄 性不育的植株具有重大的经济价值。利用水稻花药特异启动子可以创制雄性不育系。水稻 花药特异启动子连接细胞毒基因 (Cytotoxic gene)， 如来自于解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 的核糖核酸酶 (Barnase) 基因或者连接来自于曲霉菌 (Aspergillus oryzae) 的核糖核酸酶 T1(RNase T1) 基因， Barnase 与 RNase T1 基因在其表达的细胞中破 坏细胞的正常发育， 因此， 借助于 Barnase 或者 RNase T1 基因在花药中的特异表达， 可以抑 制花药的正常发育， 从而获得水稻雄性不育系。
b、 利用水稻花药特异启动子控制转基因在田间的基因扩散
目前， 转基因田间控制的一个重要问题是转基因作物的飘粉问题。转基因花粉不 受控制的传播会对周围环境中的其他物种造成基因污染， 水稻花药特异启动子可以帮助解 决这个问题。 如上所述， 将水稻花药特异启动子连接 Barnase， 一同转化水稻， 这样得到的水 稻转基因植株， 不能形成正常的花粉 ； 因此， 避免了转基因植株的花粉对周围环境中其他物 种造成的基因污染。
c、 利用水稻花药特异启动子研究影响水稻穗发育的重要基因， 为增加农作物产 量、 改进品质、 增加抗性提供优异的种源
花药特异启动子调控基因在花药中特异表达， 其表达部位集中在花药， 在其他组 织中不表达， 或者表达量很低。与组成型启动子相比较， 花药特异启动子的优势在于， 它使 得目的基因特异作用于花药器官， 减少了对水稻其他组织可能的影响。为通过基因工程的 方法进行水稻品种的改良提供重要的操作手段。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室指南 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和 份数按重量计算。
除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例 1、 水稻组织特异启动子的筛选及基因表达的鉴定
本发明人构建了水稻孕穗期的穗、 14 天幼苗的地上部分及根等组织的全长 cDNA 文库 (Liu， XH， Lu TT， Yu SL， Li Y， Huang YC.， Huang T.， Zhang L.， Zhu JJ， Zhao Q， Fan DL， Mu J， Shangguan YY， Feng Q， Guan JP， Ying K， Zhang Y， Lin ZX， Sun ZX， Qian Q， Lu YP， Han B.(2007)A collection of 10,096indica rice full-length cDNAs reveals highly expressed sequence divergencebetween Oryza sativa indica and japonica subspecies.Plant Mol Biol.65 ： 403-415)。在每个文库分别进行 2 万个克隆的 5’ 末端测 序。在每个文库 cDNA 冗余度统计的过程中， 本发明人发现每种组织的 cDNA 文库中都存在 一些拷贝数很高的 cDNA 克隆。将每个文库中 cDNA 的拷贝数， 按照从高到低排序， 找出每个 文库中 cDNA 拷贝数位于前 20 位的 cDNA ； 然后， 统计这些 cDNA 在水稻其他组织的 cDNA 文 库中的拷贝数， 如果这些 cDNA 在其他组织的文库不出现， 则这些 cDNA 成为组织特异性高表 达启动子分离的候选基因。 然后， 本发明人在水稻孕穗期的穗、 14 天幼苗的地上部分以及根 中， 通过 Real time RT-PCR 的方法对候选基因表达的组织特异性进行鉴定， 进一步确定候 选基因。
水稻花药特异启动子的克隆及水稻的转化 ： 通过候选基因全长 cDNA 序列与水稻 基因组序列的比对， 可以得到基因的上游调控区序列， 即启动子序列。然后通过 PCR 方法克 隆启动子序列， 将启动子序列插入到 pCambia1305.2( 获自 Cambia 公司 ) 表达载体 ( 含 GUS 报告基因 ) 的 BamHI 及 NcoI 位点间， 常规农杆菌法转化水稻， 通过检测转基因水稻中 GUS 基因的表达来鉴定启动子的表达特性。
实施例 2、 水稻花药特异启动子的筛选及基因表达组织特异性的鉴定
通过对水稻穗全长 cDNA 文库中全长 cDNA 拷贝数的统计， 本发明人得到了一个水 稻穗特异表达基因的候选基因， osigcfa001g12(GenBank 登录号 ： CT833313)。
然后， 本发明人对 osigcfa001g12 在水稻孕穗期的穗、 14 天幼苗的地上部分及根 中的表达进行 Realtime RT-PCR 的鉴定。以水稻组成型表达基因 actin1 作为参照基因， 结 果如表 1。表中 osigcfa001g12 基因的表达量是相对于参照基因 actin1 的相对表达量。
表1
上述结果表明， osigcfa001g12 在穗中的表达非常高， 而在水稻根及幼苗中表达非 常低。osigcfa001g12 是在穗中特异高表达的基因。实施例 3、 水稻花药特异启动子的序列分析、 启动子的克隆及转基因载体的构建 osigcfa001g12 基因的启动子区序列及基因编码区序列如 SEQ ID NO ： 1。 其中 ： 方 显示的为基因的编码区， 盒 (TATAAAT) 及 标示的为框表示的是蛋白的起始密码子及终止密码子。 基因的 5’ UTR 及 3’ UTR 区。双下划线为 体加着重号为 位点。
(CCAATGCA)。斜及序列。5’ 端 20 个碱基为用于扩增启动子区的引物对应的SEQ ID NO ： 1： ACCTCAGCCAAAACCGAAGACAGTACCGCCGAAGGACCTTATTTAA ACGGTTTTGTTAAGTTGGGGGACCCATCGTACCCGGTTTTGCGACC GGGGACGAAAATCGGACTAGGTGATAAATAGAGGGACCCAAAGTG AACTTATA ATTTCATATCAAACAGTCACGGATGGGCTT TAGGAAAGCAGAACTGGGCCCGGCCCAGTAGATCACATAGCCCAA CAAGATCTAAACCGCATGCTCTCGTTTCAACAAATTATCACACCGA TTG CATCTGCTGCACAGGCTAAAT GTAGCCATGA ACCATTCACCTCACAAGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGTTACCA GTGCAGGACGAAATGCTCAACTAGCCCAAGCAAGAATGGAGCATG ACAACCTCAGGCACCAAAAGCTC TCAAAAGTTTCC ATTTGCATTGCACAAA
GTGAGCAGGCTTCA CTTGATTGGCCACACTGATCACCTGGGTAAGAACTGACAATAACAC GCCGGCTCCTCTGGATTGCGACTTCCAGTGGGGCCCAGGTGTCGGT GTCAGCTGGGTAAGTTGGTGTCATCTGGTATGGGAAACTTTGATGT TTTGTACATGTGGTGGTGCTCTTGTCAACATTATATAGATAAGGAG AGAATAGGACAAACATGACGCTTGAATAGCAGAAGAGAAGTTCTA TCCAGCAATATCAAAAGTACAGCTGTCATTTTCAAAAAATGTAAAA CAAAAATAAAACGAAAAACCCACTATACTAGTGCCAATAAAAGAA GAAACAAAAGAGAACTACATTATTGTCAATGCCATTTGTTGATGTT ATTATTACTTTTGTTTATAAGAATAACAATTGTACTTATAAGGCCTACGATTTATTACAG本发明人选择的转基因载体为 pCambia1305.2， 克隆的酶切位点选择 BamHI 及 NcoI。pCambia1305.2 通过 BamHI 及 NcoI 酶切， 将载体中原有的 35S 启动子切掉， 割胶回收 得到载体片段。
扩增的 PCR 片段内无 BamHI 切点， 但是有 NcoI 切点。因此本发明人在设计的反向 引物中加入 BsaI 切点， 引物序列如下 ：
正向引物 ： ggatccacctcagccaaaaccgaaga(SEQ ID NO ： 2) ；
反向引物 ： ggtctc ccatgg cagccaggctagaagacttg(SEQ ID NO ： 3) ；
BsaI 的识别位点为 ggtctc， 酶切位点为其后的第 1 个及第 5 个碱基， 因此， 实际切 点仍然为 NcoI 切点 ccatgg。这样 PCR 产物经过 BamHI 及 BsaI 酶切后， 可以与经过 BamHI 及 NcoI 酶切的 pCambia1305.2 连接， 得到启动子转基因载体。
需要说明的是， 启动子与 pCambia1305.2 连接后， 在 GUS 蛋白编码序列前， 本发明 人引入了 osigcfa001g12 基因 N 端的 10 氨基酸编码序列， 因此， 表达的 GUS 蛋白是 N 端含 有 osigcfa001g12 基因 10 个氨基酸的融合蛋白。融合蛋白不影响 osigcfa001g12 启动子 表达组织特异性的鉴定。
实施例 4、 水稻的转化及转基因水稻中 GUS 基因的表达鉴定
本发明人通过农杆菌转化水稻幼胚的方法进行水稻的转化。启动子转基因载 体转入农杆菌 EHA105( 参见 Hood， E.E.， Gelvin， S.B.， Melchers， L.S. 和 Hoekema， A.， Transgenic Res.， 1993， 2， 208-218)， 然后通过 EHA105 转化日本晴 ( 获自中国水稻所 ) 幼 胚得到启动子的转基因植株。日本晴的幼胚首先经过次氯酸钠消毒， 置于诱导培养基上诱 导愈伤组织的产生。幼胚诱导产生的愈伤与农杆菌 26℃、 黑暗中共培养 3 天。然后， 转入含 有 40mg/l 潮霉素及 300mg/l 头孢霉素的筛选培养基上培养 4 个星期。 筛选得到的抗性愈伤 转入含有 0.5mg/l 萘乙酸 (NAA)， 4mg/l 激动素 (kinetin)， 6mg/l 6- 苄基氨基嘌呤 (6-BA)， 40mg/l 潮霉素， 300mg/l 头孢霉素的再生培养基， 培养 2-3 个星期。之后， 得到的再生小苗 转入 1/2MS 生根培养基中进行生根培养。2-3 个星期后， 转基因苗移入人工气候室培养。
通过水稻的转化， 本发明人得到 5-10 个系 (lines) 的转基因植株进行启动子活性 的鉴定。首先， 转基因水稻进行 T-DNA 插入的鉴定。抽提转基因水稻苗的基因组 DNA， 以转 基因水稻苗的基因组 DNA 为模板， PCR 扩增潮霉素序列 ( 转基因载体中用于抗性筛选的基 因 )， 鉴定转基因水稻苗中是否含有 T-DNA 插入， 见图 1。PCR 扩增阳性表明 T-DNA 插入为阳 性。通常筛选得到的转基因水稻中基本上都含有 T-DNA 插入。
实施例 5、 启动子转基因阳性植株的 GUS 活性鉴定 转基因植株的根、 叶片、 茎及花等组织浸于 GUS 染色液中， 37 ℃， 过夜。第二天，70-75％乙醇脱色， 将组织中的叶绿素脱掉。然后， 在解剖显微镜下观察并记录 GUS 染色的 结果。水稻 GUS 染色液的组分为 ：
Na2HPO4/NaH2PO4(1M， pH7.0) 5ml ；
X-Gluc 100mg ；
Triton X-100 0.5ml ；
甲醇 10ml ；
灭菌水 余量 ；
总体积 100ml。
报告基因 GUS 染色的结果 ：
图 2 显示的是启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果。
A， 水稻幼穗中的 GUS 染色。幼穗长约 7mm， 水稻颖花长约 1mm。此时， 颖壳是透明 的， 无染色 ； 仅花药特异染色阳性。说明启动子调控基因在花药中特异表达。
B， 水稻颖花中的 GUS 染色。颖花长约 3.78mm， 此时， 颖壳无染色 ； 花药特异染色阳 性。
C， 与图 B 为同一阶段， 本发明人将颖花的两片颖壳 ( 内颖与外颖 ) 剥开来， 箭头所 指的为特异染成蓝色的花药组织。
D， 水稻颖花中的 GUS 染色， 颖花长约 6.53mm。颖壳无染色 ； 雌蕊的柱头及子房无 染色 ； 雄蕊的花药特异染成蓝色。启动子调控基因在花药中特异表达。
E， 开花后的颖花， 颖花长约 6.58mm。颖壳无染色， 花药特异染色蓝色。
F， 与图 E 为同一阶段， 将颖花的两片颖壳剥掉， 显示雄蕊及雌蕊的染色。雌蕊的柱 头无染色， 在花柱的起始位置及子房的基部有淡的染色 ； 花药染色为很强的阳性。
G， 与图 E 为同一阶段， 放大的花药部分， 显示花药为强的阳性。
H， 与图 E 为同一阶段， 花粉染色为阳性。
A-H 显示的是颖花的 GUS 染色， 在颖花发育的不同阶段 (1mm-7mm)， 均为花药特异 表达。
I， 根的 GUS 染色为阴性。
J， 叶片的 GUS 染色为阴性。
K， 叶鞘、 叶舌、 叶耳的 GUS 染色为阴性。
L， 茎的 GUS 染色。 节间的 GUS 染色为阴性， 节的 GUS 染色为很淡的阳性。 a， anther， 花药 ； s， stigma， 柱头 ； o， ovary， 子房。
结论 ： osigcfa001g12 基因的启动子连接 GUS 报告基因， 转化水稻， 通过转基因植 株中 GUS 报告基因的组化染色鉴定， 证明 osigcfa001g12 的启动子调控基因在水稻颖花雄 蕊的花药组织中特异高表达， 在颖壳， 雌蕊中不表达。在根、 叶片、 叶鞘中均不表达。在茎的 节间中不表达， 但是在茎的节中仅有很弱的表达。
花药的切片 ： 花药切片结果见图 3， 其中蓝色表明 GUS 染色为阳性。
图 A 结果表明， GUS 在花药的绒粘层细胞中特异表达， 在颖壳中不表达。 A， anther， 花药 ； T， Tapetum， 绒粘层 ； L， Lemma， 颖壳。图 B， 放大的花药部分， 显示 GUS 在绒粘层中特异 表达。E， epidermis， 表皮 ； MC， meiotic cell， 减数分裂的细胞。
在水稻的叶片、 叶鞘、 茎、 穗中的定量的结果也证实， GUS 基因特异性地在穗中特异高表达， 见图 4。
实施例 6、 启动子保留功能的变体研究
如前所述， 本发明的启动子区序列如 SEQ ID NO ： 1 中第 1-521 位所示， 而 SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示的序列也具有启动子的作用。经鉴定， 位于 SEQID NO ： 1 中第 436-442 位的
盒 (TATAAAT)、 第 146-153 位的(CCAATGCA) 为启动子发挥功能的关键位点 ( 引发转录的必要位点及转录起始点 )。 在 osigcfa001g12 基因的启动子区， 除了 TATA 盒 (TATAAAT) 及 CAAT 盒 (CCAATGCA) 外， 本发明人还找到了 ： E- 盒， 序列为 5’ -CATTTG-3’ (SEQ ID NO ： 1 中第 278-283 位 )。 E- 盒 是脂转运蛋白 (Lipid transfer protein) 基因家族的启动子区的顺式调控组件， 为转录因 子结合位点， 提示其是调控花药特异表达的关键位点。
此外， CAAACAC 序列是脂转运蛋白基因家族的启动子区的顺式调控组件， 是影响启 动子强度的关键位点。
因此， 基上述关键位点， 本发明人进行了启动子变体研究。
M1 ：
本发明人制备了基于 SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示序列的启动子， 其中 5’ 端减 少 22 个碱基 (M1)。基于关键位点的分析， TATA 盒， CAAT 盒， E- 盒和 CAAACAC 序列这些作 为保守性的位点保持不变。序列如下 ( 单下划线为用于扩增的引物序列 ) ：
GTACCGCCGAAGGACCTTATTTAAACGGTTTTGTTAAGTTGGGGGACCCA
TCGTACCCGGTTTTGCGACCGGGGACGAAAATCGGACTAGGTGATAAAT
AGAGGGACCCAAAGTGAACTTATA ATTTCATATCAAACAGT
CACGGATGGGCTTTAGGAAAGCAGAACTGGGCCCGGCCCAGTAGATCAC
ATAGCCCAACAAGATCTAAACCGCATGCTCTCGTTTCAACAAATTATCAC
ACCGATTGCATCTGCTGCACAGGCTAAATGTAGCCATGAACCATTCACCTCACAAGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGTTACCAGTG CAGGACGAAATGCTCAACTAGCCCAAGCAAGAATGGAGCATGACAACCT CAGGCACCAAAAGCTC ATTTGCATTGCACAAATCAAAAGTTTCC
启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果如图 5。
转基因水稻 GUS 染色的结果表明， 在水稻颖花中， 颖壳无 GUS 染色 ； 花药特异染色 阳性 ( 显示蓝色 ) ； 此外， 在根、 叶片、 叶鞘、 茎中均不表达。M1 启动子具有指导目的基因在 植物花药中特异表达的功能。
M2 ：
本发明人制备了较 M1 短 135bp 序列的启动子， 其中 5’ 端减少 135bp(M2)。基于关 键位点的分析， CAAT 盒 (CCAATGCA) 缺失， 而 TATA 盒， E- 盒和 CAAACAC 序列这些作为保守性 的位点保持不变。序列如下 ( 单下划线为用于扩增的引物序列 ) ：
CATATCAAACAGTCACGGATGGGCTTTAGGAAAGCAGAACTGGGCCCG GCCCAGTAGATCACATAGCCCAACAAGATCTAAACCGCATGCTCTCGTT TCAACAAATTATCACACCGATTG T CATCTGCTGCACAGGCTAAA GTAGCCATGAACCATTCACCTCACAAGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGTTACCAGTGCAGGACGAAATGCTCAACTAGCCCAAGCAA GAATGGAGCATGACAACCTCAGGCACCAAAAGCTC ATTTGC ATTGCACAAATCAAAAGTTTCC启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果见图 6。
可见， 截短的启动子 M2 转化水稻， 指导 GUS 报告基因在水稻颖花的花药中表达 ； 在 叶片及叶鞘中表达。但是， 在根中不表达， 在茎中不表达或者表达弱。
从上述 M2 与 M1 转基因植株 GUS 染色结果的比较来看， 在减少的 135bp 区域内同 时含有调控在叶片、 叶鞘中转录的关键位点， 此位点缺失后， 表现为在叶片与叶鞘中表达。
M3 ：
本发明人制备了较 M2 短 129bp 序列的启动子， 其中 5’ 端减少 129 个碱基 (M3)。 基于关键位点的分析， CAAT 盒 (CCAATGCA)、 E- 盒缺失， 而 TATA 盒和 CAAACAC 序列这些作为 保守性的位点保持不变。序列如下 ( 单下划线为用于扩增的引物序列 ) ：
GTAGCCATGAACCATTCACCTCACA AGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGTTACCAGTGCAGGACGAAATGCTC AACTAGCCCAAGCAAGAATGGAGCATGACAACCTCAGGCACCAAAAGC TC ATTTGCATTGCACAAATCAAAAGTTTCC
启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果见如图 7。可见， 截短的启动子 M3 转化水稻， 指导 GUS 报告基因在水稻颖花的花药中表达， 在 叶片、 叶鞘、 茎中表达 ； 但是在根中不表达。另外， 在颖花的颖尖中表达。
从上述 M3 与 M2 转基因植株 GUS 染色结果的比较来看， 在此 129bp 区域内含有调 控在茎中转录的关键位点， 此位点缺失后， 表现为在茎中高表达。
M2 启动子与 SEQ ID NO ： 1 中第 1-552 位所示序列的启动子 (Pro-osigcfa001g12) 相比， 其 5’ 端减少 157bp ； M3 又比 M2 减少 129bp ； 它们的 GUS 定量结果如图 9。图中所示， M4 启动子的强度相比于 Pro-osigcfa001g12 显著降低， 但与 M5 没有显著差异， 可见在这 157bp 中含有调控启动子在花药中表达强度的 motif ； 在此区段内有 CAAT 盒， CAAT 盒可能 通过同源序列的比对， 发现 GTGA 的 motif， GTGA 的 影响 GUS 报告基因的表达强度。另外， motif 可能影响启动子中在花药中的表达强度。M4 ：
本发明人制备了较 M3 短 26bp 序列的启动子， 其中 5’ 端减少 26 个碱基 (M4)。基 于关键位点的分析， CAAT 盒 (CCAATGCA)、 E- 盒、 CAAACAC 序列缺失， 而 TATA 盒作为保守性 的位点保持不变。序列如下 ( 单下划线为用于扩增的引物序列 ) ：
TAGCCATGAACCATTCACCTCACAAGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGT
TACCAGTGCAGGACGAAATGCTCAACTAGCCCAAGCAAGAATGGAGCAT
GACAACCTCAGGCACCAAAAGCTC AAAAGTTTCCATTTGCATTGCACAAATCM4 启动子转基因水稻中各不同组织 GUS 报告基因染色的结果见图 8。
可见， 截短的启动子 M4 转化水稻， 转基因水稻 GUS 染色的结果表明， 根， 叶片， 叶 鞘， 茎的节间， 以及花药的 GUS 染色均为阴性 ； 仅茎的节部位 GUS 染色为弱阳性 ( 显淡的蓝 色 )。
M4 较 M3 短 26bp， 从上述 M4 与 M3 转基因植株 GUS 染色结果的比较来看， 在缺失 这 26bp 序列的情况下， 启动子在叶片， 叶鞘， 茎的节间及花药中的表达消失了。在茎的节的 GUS 表达强度上也有非常显著的降低。因此， 这 26bp 是调控 osigcfa001g12 基因转录的关 键 motif， 也是花药表达的关键 motif。
实施例 7、 水稻花药特异启动子的序列分析
通过同源比对， 找到其他几个顺式调控组件，
GT1consensus ： 以下序列中第 99-104 位115-120 位与光调控基因表达相关。推测可能参与叶片、 叶鞘中基因表达的调控。
序列 ： 以下序列中第 131-138 位。与多个顺式调控组件具有序列 同源性， 如 CACTFTPPCA1， DOFCOREZM， TBOXATGAPB 等， 推测可能参与叶片、 叶鞘中基因表达 的调控。
ACCTCAGCCAAAACCGAAGACAGTACCGCCGAAGGACCTTATTTAAAC
GGTTTTGTTAAGTTGGGGGACCCATCGTACCCGGTTTTGCGACCGGGGA
C CGGACTAGGT TAGAGGGACC ACTTATA
ATTTCATATCAAACAGTCACGGATGGGCTTTAGGAAAGCA GAACTGGGCCCGGCCCAGTAGATCACATAGCCCAACAAGATCTAAACC GCATGCTCTCGTTTCAACAAATTATCACACCGATTG GCACAGGCTAAAT CATCTGCT GTAGCCATGAACCATTCACCTCACAAGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGTTACCAGTGCAGGACGAAATGCTCAACT AGCCCAAGCAAGAATGGAGCATGACAACCTCAGGCACCAAAAGCTC ATTTGCATTGCACAAATCAAAAGTTTCC在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。19CN 102465128 A
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