一种制备核酸探针库的方法 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域中制备微阵列探针库的方法，特别涉及制备核酸探针库的方法。
背景技术
“生物芯片”的概念自上个世纪九十年代被提出后，生物芯片技术以其集成化、微型化、易于自动化等特点远远超越了许多传统的生物技术，并以其巨大的应用价值和市场潜力，吸引了世界范围的广泛兴趣，在短短的10年时间内获得了飞跃性的发展和完善，基于生物芯片的新技术、新方法层出不穷。目前，生物芯片已由最初的微阵列芯片，基因芯片发展出了许多纷繁复杂的门类，其中包括蛋白质芯片，抗体微阵列，神经元芯片，组织芯片，毛细管芯片以及芯片实验室等。在技术本身不断完善地同时，生物芯片的应用领域也在不断地拓宽，除传统的表达分析，突变检测之外，生物芯片在生命科学以及与生命科学相关的各个领域亦被广泛应用(Lockhart DJ，et al.NatBiotechnol 1996；14：1675-1680；Hacia JG，et al.Nat Genet 1996；14：441-447；Wodicka L，et al.Nat Biotechnol 1997；15：1359-1367；Hacia JG.Nat Genet 1999；21：42-47；Schena M，et al.Science 1995；270：467-470)。
发展得最为成熟、应用最为广泛的是用于表达谱变化分析的微阵列芯片。探针的制备是微阵列芯片中的一个关键技术环节。常规的表达谱芯片中的探针一般为双链PCR产物。这种形式探针的获得方式如下：以探针克隆为模板进行PCR扩增，琼脂糖电泳检测扩增效果，纯化浓缩PCR产物，纯化的方式一般是试剂盒或者简单的乙醇沉淀(Hegde P，et al.Biotechniques 2000；29：548-4，556.)，也可以不纯化，直接浓缩而用于点样(Diehl F，et al. Nucl Acids Res 2002；30：e79.)。这种方式的缺点是以含有探针克隆的工程菌为起始，需要经常性的动用原始的克隆库，反复的冻融易导致克隆菌的死亡，而且在实际的操作中容易导致不同的克隆菌相互之间的交叉污染，克隆菌作为原始的保藏物，一旦死亡或者污染，会造成很大、甚至不可挽回的损失。另外克隆菌作为活的生物体，保藏条件较为苛刻，对环境变化的抗性较弱。在实际操作中，尤其是在对外提供服务时，需要对克隆进行反复测序以确保其准确性，增加了操作的复杂度和费用。为了克服传统生物芯片探针制备方式上的问题，有研究者用合成的70mer长的单链探针代替常规的PCR产物而作为探针(Fisher MA，et al.J Bacteriol2002；184：4025-32.；Dudley AM，et al.Proc Natl Acad Sci USA 2002；99：7554-59.)。这种探针库的优点是序列明确，探针的浓度明确，且不同探针间的浓度一致，较容易保存，引入交叉污染的概率较小。合成的长的单链探针已经可以从专业公司获得(Qiagenoperon)。这种探针制备方式的缺点在于一次性购置成本高昂；另外，这种探针所采用的是明确的序列，只能用于分析已知基因，而不能够分析或者发现未知基因；再者，探针库本身不能够复制，一旦用完，需要重新购买。这种探针库在目前并没有得到广泛的应用，在已有的应用中，对于其效果的评价也是好坏参半。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种廉价、批量制备核酸探针库的方法。
一种制备核酸探针库的方法，是以在5’带有与克隆的探针序列、载体序列以及培养菌的基因序列无关的通用序列，3’带有探针扩增序列的寡核苷酸为引物，以含有探针克隆的培养菌或者质粒为模板进行扩增，得到一级探针库；然后以通用序列为引物，一级探针库为模板进行扩增，得到二级探针库；以此类推，以探针扩增序列为引物，以前面得到的探针库为模板进行扩增，获得核酸探针库。
其中经常应用的是，得到二级探针库后，以探针扩增序列为引物，一级探针库或二级探针库为模板进行扩增，获得核酸探针库。
在本发明的方法中，所述一级探针库制备时的通用序列以及探针扩增序列的引物在环境温度低于PCR扩增的退火温度时为发卡结构。所述发卡结构是在通用序列的5’端带有4到10个碱基长的序列，该序列与从3’端开始的与其等长的序列完全互补。
为了使扩增的效果更好，所述通用序列与要扩增的探针库所对应的物种的基因序列、探针库所处的载体的序列以及载体所处的工程菌的序列不同源。
在本发明的方法中，所述扩增的产物应经纯化、序列测定和稀释后待用。所述探针库制备时的稀释倍数一般为10到100,000倍。所述探针库制备时的纯化方式为凝胶回收纯化，高效液相色谱纯化或毛细管电泳纯化。
所述探针库的保藏条件之一为冷冻干燥后置于室温避光保存或者-80℃至-20℃冷冻保存。保藏条件之二为溶于pH为6-8的去离子水或pH为7-9的TE缓冲液后置于-80℃至-20℃保存。
本发明的原理及工作流程如图1、图2所示，图1中，a，模板；b，在室温下呈发卡结构的发卡引物；c，通用引物；d，常规引物；以在5’带有与克隆的探针序列、载体序列以及培养菌的基因序列无关的通用序列c，3’带有探针扩增序列d的寡核苷酸为引物，以含有探针克隆的菌培养或者质粒为模板a进行扩增，扩增的产物经纯化，序列测定和适当稀释后成为一级探针库。然后以通用序列为引物，一级探针库为模板进行扩增，扩增的产物经纯化和适当稀释后成为二级探针库。然后以探针扩增序列为引物，一级探针库或二级探针库为模板进行扩增，并依此类推获得制备表达谱芯片所需要的核酸探针。
本发明方法综合了传统探针制备以及合成70mer探针的优点。通过严格的前期处理(高保真扩增，胶回收纯化及序列测定)后，可以得到与合成的70mer探针质量相当的PCR产物探针；探针库本身可以通过PCR产物而大量复制，因而极大地降低了对原始克隆库的依赖，同时大大的降低了库的成本。可以批量(1000～10,000倍于常规方式或者106～108倍于常规方式)、廉价地制作微阵列探针库，所制备的探针库以纯化的PCR核酸产物的稀释物形式存在，有利于保存，对意外情况的抗打击能力较强(例如冰箱临时断电)，不会发生象菌种死掉的情况。探针库是纯化的核酸，所以扩增条件比菌种和质粒更容易控制，基本不会有非特异扩增，用于点样的扩增产物的纯化也可以较现在的常规方式简单。因为可以抽干保存，输送起来极其方便。本发明的方法可以用于血液相关病毒快速检测芯片，进一步扩大后可以用于常规的表达谱芯片，对于大批量制备表达谱芯片和高通量药物筛选芯片的探针库具有重要意义。
【附图说明】
图1为本发明的原理图。
图2为本发明的操作流程图。
图3为制备人基因微阵列探针的电泳检测图谱。
图4为制备感染性病原芯片探针的电泳检测图谱。
【具体实施方式】
实施例1：制备人类基因克隆探针库
1、人类基因探针克隆
从生物芯片北京国家工程研究中心的人类基因克隆库中随机挑选了三个不同长度的克隆175C1，175D3，175A5(生物芯片北京国家工程研究中心统一编号)，其所包含的人类基因克隆的长度分别为490bp，750bp和1000bp，从长度上基本覆盖全部的克隆。这些克隆将以两种不同的形式作为表达谱芯片探针制备的模板。第一种形式为保存的工程菌培养物，第二种形式为碱裂解法制备的质粒。
2、引物
常规引物：上游引物5’CTG CAA GGC GAT TAA GTT GGG TAA C 3’；
下游引物5’GTG AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGC 3’；
通用引物：上游引物5’TCA CTT GCT TCC GTT GAG G 3’；
下游引物5’GGT TTC GGA TGT TAC AGC GT 3’；
发卡引物：上游引物5’GTTA CC TCACTTGCTTCCGTTGAGG CTG CAA GGC GAT TAA GTT
GGG TAA C 3’；
下游引物5’GCTGTT GGTTTCGGATGTTACAGCGT GTG AGC GGA TAA CAATTT CAC ACA GGA AAC AGC 3’。发卡引物的下划线部分为反向互补序列，粗体部分为常规引物序列。
3、PCR体系及热循环
采用天为时代的便捷PCR反应系列(2×Pfu master mix)。PCR反应系中的天为时代的Pfu预混合物的终浓度为1×，上下游引物的终浓度均为0.5μM。模板为菌培养或者纯化的质粒，如果是菌培养，则加入量为2μL，质粒则为30ng。反应体系总体积为50μL。热循环条件为：预变性94℃3分钟；主循环94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保持。PCR反应在MJ的PTC-200热循环仪上进行。
4、电泳体系
采用1×TBE作为电泳缓冲液，琼脂糖凝胶的浓度为1.7％，电泳在EmbiTec Runone电泳仪上进行，施加100V电压，电泳时间为30分钟。分子量参照为TaKaRa的DL2000(6个条带的大小从小到大依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp和2000bp)。分子量参照的上样量为5μL，PCR产物的上样量为3μL。除非特别说明，实验所采用的均为同一电泳体系。
5、制备一级探针库
采用发卡引物，分别以菌培养物和纯化的质粒为模板进行高保真扩增。PCR体系及热循环程序如第3步所述。对PCR产物进行电泳检测，电泳体系如第4步所述。对以质粒为模板的高保真扩增产物进行凝胶回收纯化，电泳检测纯化结果。用pH值中性的无菌去离子水1,000倍稀释纯化产物获得一级探针库。实验中设置了常规引物扩增参照，其他条件同发卡引物扩增。
6、制备二级探针库
采用通用引物，以一级探针库为模板进行高保真扩增。PCR体系及热循环程序如第3步所述。对PCR产物进行电泳检测，电泳体系如第4步所述。不对PCR产物进行纯化，直接用pH值中性的无菌去离子水1,000倍稀释纯化产物获得二级探针库。
7、制备生物芯片点样用探针
采用常规引物，分别以一级探针库和二级探针库为模板进行扩增。PCR体系及热循环程序如第3步所述。对PCR产物进行电泳检测，电泳体系如第4步所述。电泳检测结果如图3所示，图中1、4：175C1，490bp；2、5：175D3，750bp；3、6：175A5，1000bp；1-6均采用常规引物进行扩增；1-3的模板为一级库，4-6的模板为二级库。从图中可以看出，以一级探针库和二级探针库为模板均可进行有效扩增，能以较高的效率获得特异的探针。可对扩增产物进行浓缩或者不浓缩而用于点样制备微阵列。
实施例2、制备临床感染性疾病病原克隆探针库
1、临床感染性疾病病原探针克隆
从生物芯片北京国家工程研究中心的临床感染性疾病病原克隆库中挑选了四个不同长度的克隆pTP205，pHCV244，pHIV309和pHBV538，其所包含的临床感染性疾病病原克隆的长度分别为205bp，244bp，309bp和538bp。这些克隆对应于四种不同的病原体：TP(梅毒螺旋体)，HCV(丙型肝炎病毒)，HIV(爱滋病病毒)以及HBV(乙型肝炎病毒)。这些克隆将以质粒的形式作为芯片探针制备的模板。
2、引物
常规引物：梅毒螺旋体：上游引物5’AAC ACG ATC CGC TAC GAC TAC TAC 3’，
下游引物5’CCC TAT ACC CGT TCG CAA TCA AAG 3’；
丙型肝炎病毒：上游引物5’CTC GCA AGC ACC CTA TCA GGC AGT 3’，
下游引物5’GCA GAA AGC GTC TAG CCA TGG CGT 3’；
艾滋病病毒：上游引物5’TGG GAA GTT CAA TTA GGA ATA CCA C 3’，
下游引物5’TCC TAC ATA CAA ATC ATC CAT GTA TTG 3’
乙型肝炎病毒：上游引物5’GTT CAA GCC TCC AAG CTG TG 3’，
下游引物5’CTG CGA GGC GAG GGA GTT CT 3’。
通用引物：上游引物5’TCA CTT GCT TCC GTT GAG G 3’，
下游引物5’GGT TTC GGA TGT TAC AGC GT 3’
发卡引物(下划线部分为反向互补序列，粗体部分为常规引物序列)
梅毒螺旋体：上游引物5’GTAGTAGT TCACTTGCTTCCGTTGAGG AAC ACG
ATC CGC TAC GAC TAC TAC 3’，
下游引物5’CTTTGATT GGTTTCGGATGTTACAGCGT CCC TAT
ACC CGT TCG CAA TCA AAG 3’；
丙型肝炎病毒：上游引物5’CTGCCTG TCACTTGCTTCCGTTGAGG CTC GCA
AGC ACC CTA TCA GGC AGT 3’，
下游引物5’GCCATG GGTTTCGGATGTTACAGCGT GCA GAA AGC
GTC TAG CCA TGG CGT 3’；
艾滋病病毒：上游引物5’GTGGTATTTCACTTGCTTCCGTTGAGG TGG GAA GTT
CAA TTA GGA ATA CCA C 3’，
下游引物5’CAATACAT GGTTTCGGATGTTACAGCGT TCC TAC ATA
CAA ATC ATC CAT GTA TTG 3’
乙型肝炎病毒：上游引物5’CACAGCTT TCACTTGCTTCCGTTGAGG GTT CAA
GCC TCC AAG CTG TG 3’，
下游引物5’AGAACTCC GGTTTCGGATGTTACAGCGT CTG CGA
GGC GAG GGA GTT CT 3’。
3、PCR体系及热循环
采用天为时代的便捷PCR反应系列(2×Pfu master mix)。PCR反应系中的天为时代的Pfu预混合物的终浓度为1×，上下游引物的终浓度均为0.5μM。模板为菌培养或者纯化的质粒，如果是菌培养，则加入量为2μL，质粒为30ng。反应体系总体积为50μL。热循环条件为：预变性94℃3分钟；主循环94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保持。PCR反应在MJ的PTC-200热循环仪上进行。
4、电泳体系
采用1×TBE作为电泳缓冲液，琼脂糖凝胶的浓度为1.7％，电泳在EmbiTec Runone电泳仪上进行，施加100V电压，电泳时间为30分钟。分子量参照为TaKaRa的DL2000(6个条带的大小从小到大依次为100bp，250b，500bp，750bp，1000bp和2000bp)。分子量参照的上样量为5μL，PCR产物的上样量为3μL。
5、制备一级探针库
采用发卡引物，分别以菌培养物和纯化的质粒为模板进行高保真扩增。PCR体系及热循环程序如第3步所述。对PCR产物进行电泳检测，电泳体系如第4步所述。对以质粒为模板的高保真扩增产物进行凝胶回收纯化，电泳检测纯化结果。用pH值中性的无菌去离子水1,000倍稀释纯化产物获得一级探针库。实验中设置了常规引物扩增参照，其他条件同发卡引物扩增。
6、制备二级探针库
采用通用引物，以一级探针库为模板进行高保真扩增。PCR体系及热循环程序如第3步所述。对PCR产物进行电泳检测，电泳体系如第4步所述。不对PCR产物进行纯化，直接用pH值中性的无菌去离子水1,000倍稀释纯化产物获得二级探针库。
7、制备生物芯片点样用探针
采用常规引物，分别以一级探针库和二级探针库为模板进行扩增。PCR体系及热循环程序如第3步所述。对PCR产物进行电泳检测，电泳体系如第4步所述。检测结果如图4所示，图中泳道1、2、3、4分别为205bp，244bp，309bp和538bp，均以二级库为模板，采用常规引物进行扩增。可以看出，以一级探针库和二级探针库为模板均可进行有效扩增，能以较高的效率获得特异的探针。可对扩增产物进行浓缩或者不浓缩而用于点样制备微阵列。