流感病毒抑制剂及其应用.pdf

本发明公开了一种流感病毒抑制剂及其应用，流感病毒抑制剂包括化学式Ι表示的化合物或其药学上可接受的盐，化学式Ι如下所示：其中，X为N或CH，Y为NH、N(R2)、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R1为H、F、Cl、Br、I、C1～C4的烷基或C1～C4的烷氧基，R2为C1～C6的烷基。这种流感病毒抑制剂具有上述化学式Ι，不同于NAIs，同时根据具体实施例中的实验数据可以看出，这种流感病毒抑制剂具有抗流感病毒活性。这种新型流感病毒抑制剂不仅可能被有效的用于治疗对NAI产生耐药型的流感病毒，或者可以和NAIs一起的联合使用来有效地预防和治疗流感。

1.  一种流感病毒抑制剂，包括化学式Ι表示的化合物或其药学上可接受的盐，化学式Ι如下所示：

其中，X为N或CH，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R¹为H、F、Cl、Br、I、C₁～C₄的烷基或C₁～C₄的烷氧基，R²为C₁～C₆的烷基。

2.  如权利要求1所述的流感病毒抑制剂，其特征在于，X为N，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N，W为O。

3.  如权利要求1或2所述的流感病毒抑制剂，其特征在于，R¹为H，R²为叔丁基。

4.  一种流感病毒抑制剂组合物，其特征在于，包括：
化学式Ι表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及
药学上可接受的载体；
化学式Ι如下所示：

其中，X为N或CH，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R¹为H、F、Cl、Br、I、C₁～C₄的烷基或C₁～C₄的烷氧基，R²为C₁～C₆的烷基。

5.  如权利要求4所述的流感病毒抑制剂组合物，其特征在于，X为N，Y 为NH、N(R²)、S或O，Z为N，W为O。

6.  如权利要求4或5所述的流感病毒抑制剂组合物，其特征在于，R¹为H，R²为叔丁基。

7.  一种流感病毒抑制剂组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将化学式Ι表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，一起配制；
化学式Ι如下所示：

其中，X为N或CH，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R¹为H、F、Cl、Br、I、C₁～C₄的烷基或C₁～C₄的烷氧基，R²为C₁～C₆的烷基。

流感病毒抑制剂及其应用
【技术领域】
本发明涉及流感病毒治疗领域，尤其涉及一种流感病毒抑制剂及其应用。
【背景技术】
早在2009猪流感病毒A H1N1的出现再一次给了一个警示：流感病毒的新菌株可能在一个意想不到的时刻在全世界传播，^1-2在2011被鸟类流感病毒感染的病人又在中国的香港和深圳被鉴定。³后来2013年三月，一种新型的禽流感病毒A H7N9类在中国被发现。⁴因此流感病毒的预防和治疗对于保护公共健康具有重要意义。
控制新发流感病毒株的最有效的方法是使用抗流感病毒的药物，因为安全有效的疫苗需要数月的时间才能被开发出来，这将导致疫苗滞后于流感病毒的传播。目前，市场上主流的治疗流感病毒感染的药物是神经氨酸苷酶抑制剂(NAIs)，例如奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦。^5-9NAIs结合到神经氨酸苷酶的活性位点，这是A型和B型流感病毒的主要表面抗原，然后抑制新产生的流感病毒从感染细胞中释放。^10-11然而，神经氨酸苷酶活性位点发生突变可能削弱NAIs和神经氨酸酶的结合能力。其中一个突变相当频繁的位点是神经氨酸酶第274位的组氨酸。^12-15当第274位组氨酸突变为酪氨酸或者其他的氨基酸时，NAIs不再紧密结合到神经氨酸苷酶，所以突变的流感病毒产生耐药性。由于耐药性流感病毒的频繁出现，现有的NAI药物因为长期的使用而导致部分流感病毒对其产生耐药性，因此必须开发新型的流感病毒抑制剂来预防和治疗流感在人类中传播。
涉及的文献资料如下：
1、G.J.D.Smith,D.Vijaykrishn,J.Bahl,S.J.Lycett,M.Worobey,O.G.Pybus,S.K.Ma,C.L.Cheung,J.Raghwani,S.Bhatt,J.S.M.Peiris,Y.Guan and A.Rambaut,Nature2009,459,1122.
2、K.Nalluswami,A.Nambia,L.Perrianne,M.Moll,J.Lute and O.Simwale,MMWR,Morbidity Mortality WklyRep2011,60,1213.
3、Global animal epidemic situation review in2011.China Journal of Animal QuArantine2011,28(12),82.
4、R.Gao,B.Cao and Y.Hu,N.Engl.J.Med.2013,368,1888.
5、F.Hayden,Clin Infect Dis.2009,48(Suppl1),S3.
6、I.M.L Agoja,E.De Clercq,Med.Res.Rev.2008,28,1.
7、M.von Itzstein,Nat.Rev.Drug Discovery2007,6,967.
8、H.P.Hsieh andJ.T.Hsu,Curr.PhArm.Des.2007,13,3531.
9、E.De Clercq E,Nat.Rev.Drug Discovery2006,5,1015.
10、P.Palese and R.W.Compans,The Journal of General Virology1976,33,159.
11、C.Liu,M.C.Eichelberger,R.W.Compans and G.M.Air,Journal of Virology1995,69,1099.
12、L.V.Gubareva,L.Kaiser,M.N.Matrosovich,Y.Soo-Hoo and F.G.Hayden,J.Infect.Dis.2001,183,523.
13、A.Moscona,N.Engl.J.Med.2009,360,953.
14、F.Carrat and A.Flahault,Vaccine2007,25,6852.
15、J.Treanor,N.Engl.J.Med.2004,350,218.
【发明内容】
基于此，有必要提供一种不同于NAIs的流感病毒抑制剂及其应用。
一种流感病毒抑制剂，包括化学式Ι表示的化合物或其药学上可接受的盐，化学式Ι如下所示：

其中，X为N或CH，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R¹为H、F、Cl、Br、I、C₁～C₄的烷基或C₁～C₄的烷氧基，R²为C₁～C₆的烷基。
在一个实施例中，X为N，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N，W为O。
在一个实施例中，R¹为H，R²为叔丁基。
一种流感病毒抑制剂组合物，包括：
化学式Ι表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及
药学上可接受的载体；
化学式Ι如下所示：

其中，X为N或CH，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R¹为H、F、Cl、Br、I、C₁～C₄的烷基或C₁～C₄的烷氧基，R²为C₁～C₆的烷基。
在一个实施例中，X为N，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N，W为O。
在一个实施例中，R¹为H，R²为叔丁基。
一种流感病毒抑制剂组合物的制备方法，包括如下步骤：将化学式Ι表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，一起配制；
化学式Ι如下所示：

其中，X为N或CH，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R¹为H、F、Cl、Br、I、C₁～C₄的烷基或C₁～C₄的烷氧基，R²为C₁～C₆的烷基。
这种流感病毒抑制剂具有上述化学式Ι，不同于NAIs，同时根据具体实施例中的实验数据可以看出，这种流感病毒抑制剂具有抗流感病毒活性。
这种流感病毒抑制剂可能被有效的用于治疗NAI抗性流感病毒或者被包括到和NAIs一起的联合治疗中去降低药物抗性流感病毒出现的几率。
【附图说明】
图1为注入流感病毒和抑制剂的96孔板培养48小时后的照片；
图2为对P114F5进行EC₅₀值测定得到的EC₅₀柱状图；
图3为P114F5的结构优化图；
图4为对化合物11e进行EC₅₀值测定得到的EC₅₀柱状图。
【具体实施方式】
由于目前的抗流感病毒的药物主要是神经氨酸苷酶抑制剂(NAIs)，而NAIs的效用可能因为流感病毒神经氨酸苷酶活性位点发生突变而被削弱，当流感病毒突变后会对现有NAIs药物产生耐药性，从而导致治疗流感失败。
基于此，有必要提供一种不同于NAIs的流感病毒抑制剂。
通过对含有10000个小分子化合物的商业化小分子化合物库(MyriaScreen library，来自Sigma-Aldrich公司)进行高通量抗流感病毒活性筛选，发现了一类哌啶基衍生物具有抗流感病毒活性。
而此前并无此类化合物的抗流感病毒活性的任何记录，此类小分子化合物 作为流感病毒抑制剂，具有广泛的应用前景。
基于此，提供上述化合物作为流感病毒抑制剂，该化合物包括化学式Ι表示的化合物或其药学上可接受的盐。
化学式Ι如下所示：

其中，X为N或CH，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R¹为H、F、Cl、Br、I、C₁～C₄的烷基或C₁～C₄的烷氧基，R²为C₁～C₆的烷基。
优选的，X为N，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N，W为O。
优选的，R¹为H，R²为叔丁基。
特别的，结构如化学式ΙΙ所示的化合物，具有特别高的抗流感病毒活性。
化学式ΙΙ如下所示：

此外，还提供一种流感病毒抑制剂组合物，包括：
化学式Ι表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及
药学上可接受的载体；
化学式Ι如下所示：

其中，X为N或CH，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R¹为H、F、Cl、Br、I、C₁～C₄的烷基或C₁～C₄的烷氧基，R²为C₁～C₆的烷基。
药学上可接受的载体，包括但不限于稀释剂和填充剂，选自赋形剂，例如：碳酸钙、高岭土、碳酸氢钠、乳糖、D-甘露醇、淀粉、结晶纤维素、滑石、精细研磨的糖和多孔物质；粘合剂，例如：糊精、树胶、α-淀粉、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和茁霉多糖(pullulan)；增稠剂，例如：天然树胶、纤维素衍生物、丙烯酸衍生物；崩解剂，例如：羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代的羟丙基纤维素和部分预胶化淀粉；溶剂，例如：注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油和玉米油；分散剂，例如：吐温80、HC060、聚乙二醇、羧甲基纤维素和海藻酸钠；增溶剂，例如：聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、苯甲酸节基酯(benzoic acid benzyl)、乙醇、三氨基甲烷、三乙醇胺、碳酸钠和柠檬酸钠；悬浮剂，例如：硬脂基三乙醇胺、月桂基硫酸钠、苯扎氯铵、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素；安慰剂，例如：苄醇；等渗剂，例如：氯化钠和甘油；缓冲剂，例如：磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐和柠檬酸盐；润滑剂，例如：硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、淀粉和苯甲酸钠；着色剂，例如：焦油颜料、焦糖、氧化铁、二氧化钛和核黄素；矫味剂，例如：甜味剂和香料；稳定剂，例如：亚硫酸钠和抗坏血酸；以及防腐剂，例如：对羟基苯甲酸酯和山梨酸。
优选的，X为N，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N，W为O。
优选的，R¹为H，R²为叔丁基。
一实施方式的流感病毒抑制剂组合物的制备方法，包括如下步骤：将化学式Ι表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，一起配制；
化学式Ι如下所示：

其中，X为N或CH，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R¹为H、F、Cl、Br、I、C₁～C₄的烷基或C₁～C₄的烷氧基，R²为C₁～C₆的烷基。
优选的，X为N，Y为NH、N(R²)、S或O，Z为N，W为O。
优选的，R¹为H，R²为叔丁基。
特别的，一种流感病毒抑制剂组合物，包括化学式ΙΙ表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及
药学上可接受的载体；
化学式ΙΙ如下所示：

上述流感病毒抑制剂组合物的制备方法，包括如下步骤：将化学式ΙΙ表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，一起配制；
化学式ΙΙ如下所示：

以下为具体实施例部分。
在具体实施例中，将详细描述本发明的具体筛选方案，以及筛选到的化合物的抗流感病毒活性试验。
实施例1
先导化合物P114F5的筛选。
为了筛选出新型流感病毒抑制剂，建立一种基于细胞水平的流感病毒抑制剂高通量筛选方法。
具体的实施方案是：将从中国菌种保藏中心(China Center for Type Culture Collection)获得的MDCK细胞用96孔板在37℃、5％CO₂条件下培养24个小时。当细胞密度达到90％时，每个孔内注入300PDU的流感病毒A/Udorn/72(H3N2)。病毒感染48小时后，将细胞固定染色，得到图1。
如图1所示，孔A1-D1未感染作为细胞对阳性照组1，孔E1-H1感染流感病毒接种液做为阴性对照组。病毒唑(50μM，1％DMSO)加在孔A12-D12作为阳性对照2，以及膜融合抑制剂F136(参考专利WO2011160024制备)加在孔E12-H12，选来做为阳性对照组3。
F136的结构式为：
在病毒接种到细胞1个小时后，化合物库的化合物加入到培养基至终浓度为100μg/mL。利用这种高通量筛选方法，从10000种化合物中发现一种可能的哌啶衍生物，4-(喹啉4-基硫代)哌啶1-甲酸叔丁酯(ethyl 4-(quinolin-4-ylthio)piperidine-1-carboxylate)，记为P114F5。
P114F5的结构式为：
对P114F5进行EC₅₀值测定得到图2，图2显示P114F5的EC₅₀数值为 13.9μM。文献检索没有检测到有文章报道这类药物可以作为抗病毒药剂。
实施例2
先导化合物P114F5的结构优化。
为了获得更多的P114F5作用机制信息，系统地改变了P114F5的化学结构来探索以P114F5作为结构基础时对抗流感活性的作用。
为了研究P114F5的构效关系(SAR)，如图3所示，P114F5可以被分割为4个亚基：亚基(A)喹啉组分，亚基(B)S组分，亚基(C)哌啶组分和亚基(D)氨基甲酸酯组分。
为了测试亚基(A)喹啉组分对于抗病毒活性的影响，将P114F5中的喹啉组分进行替换，并且对替换得到的化合物分别进行EC₅₀值测定，具体测试方法和病毒参照实施例1，测得EC₅₀如下表1所示。

表1：P114F5的亚基(A)进行替换得到的化合物的EC₅₀测量结果。
其中，化合物1a-i是通过亲核取代一个环化化合物为硫醇化合物对应于化合物1a-i(L.Savini,A.Gaeta,C.Fattorusso,B.Catalanotti,G.Campiani,L.Chiasserini,C.Pellerano,E.Novellino,D.McKissic and A.Saxena,J.Med.Chem.2003,46,1.)。
特别的，化合物1a-c和化合物1g-i还可以直接来自商业化高产率4-氢氯酸化合物通过在DMF中加略多于一倍氢化钠50℃处理获得。其中，乙基4-硫醇基-1-羧酸叔丁酯(ethyl 4-mercaptopiperidine-1-carboxylate)的制备参照专利WO2007030366。
此外，商用苯硫酚或者2-萘硫醇衍生物与镇静剂化合物一起在氢化钠中处理也可以得到化合物1d-f。其中，乙基4-溴哌啶基-1-羧酸叔丁酯(ethyl4-bromopiperidine-1-carboxylate)的制备参照专利WO2003062224。
由表1可以看出，亚基(A)的改变对化合物的抗病毒活性影响是有很大差异的，如包含喹啉组分的化合物1a-c和包含香豆素环组分的化合物1g-i的抗病毒活性并没有得到显著的改善，它们的EC₅₀值都在100微摩尔以上。而用苯环和萘环做为亚基(A)的化合物11d-f的抗病毒活性和P114F5的活性相当。这些结果表明，改变亚基(A)并不能显著的改善化合物的抗病毒活性，这也意味着亚基(A)的选择具有多样性。
实施例3
先导化合物P114F5的结构优化，亚基(B)S组分的替换。
为了测试亚基(B)对于抗病毒活性的影响，将P114F5中的S组分进行替换，并且对替换得到的化合物分别进行EC₅₀值测定，具体测试方法和病毒参照实施例1，测得EC₅₀如下表2所示。

表2：P114F5的亚基(B)进行替换得到的化合物的EC₅₀测量结果。
乙基4-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯(ethyl 4-aminopiperidine-1-carboxylate)的制备参照“B.Miriyala,S.Bhattacharyya and J.S.Williamson,Tetrahedron2004,60,1463.”，其中的S分别被O和NH代替。
化合物6a-b的合成和化合物1a-i类似，4-氯代喹啉被氧或者氨基亲核取代到对应化合物中6a-b。
从表格2中可以看出，用O作为亚基(B)的化合物6a的抗病毒活性要比P114F5的活性提高6倍，而用NH作为亚基(B)的化合物6b的几乎没有任何抗病毒活性。这实验结果表明，用O作为亚基(B)是对于显著改善抑制剂的抗病毒活性是至关重要的。
实施例4
先导化合物P114F5的结构优化，亚基(C)哌啶基组分的替换。
为了测试亚基(C)对于抗病毒活性的影响，将P114F5中的哌啶基组分进行替换，同时，也将P114F5中的亚基(B)进行替换，并且对替换得到的化合物分别进行EC₅₀值测定，具体测试方法和病毒参照实施例1，测得EC₅₀如下表3所示。

表3：P114F5的亚基(B)和亚基(C)进行替换得到的化合物的EC₅₀测量结果。
化合物8a-f的合成与化合物1a-i相似，通过亲核取代反应得到。
由表格3可以看出，化合物8a-f的活性差别很大。用苯基替代哌啶基组分将导致抑制活性的降低，无论是用S，NH或者O做为亚基(B)，例如化合物 8a-c。然而，环己烷组分替换哌啶组分的化合物表现了很好的抑制活性，EC₅₀值从10μM到36μM，例如化合物8d-f。这些结果表明，用非刚性环系做为亚基(C)是非常重要的，可能的原因是抑制剂在和受体相互作用时，非刚性的环系可以通过改变其构象来增加和受体的相互作用，从而展现抗病毒活性。
实施例5
先导化合物P114F5的结构优化，亚基(D)氨基甲酸酯组分的替换。
为了测试亚基(D)氨基甲酸酯组分对于抗病毒活性的影响，将P114F5中的氨基甲酸酯组分进行替换，并且对替换得到的化合物分别进行EC₅₀值测定，具体测试方法和病毒参照实施例1，测得EC₅₀如下表4所示。

表4：P114F5的亚基(D)进行替换得到的化合物的EC₅₀测量结果。
化合物11a-j能够通过如下合成路线合成：用4-氯代喹啉和叔丁基4-硫醇基 -1-甲酸乙酯(tert-butyl 4-mercaptopiperidine-1-carboxylate)或者叔丁基4-羟基哌1-甲酸乙酯(tert-butyl 4-hydroxypiperidine-1-carboxylate)可以很容易获得化合物11b-c，接着用TFA处理得到11g-h，然后用N,N'-carbonyldiimidazole(CDI)处理，添加R-OH得到11c-f。
11i-j的合成是通过4-氯代喹啉和四氢呋喃-3-醇(tetrahydrofuran-3-ol)或者四氢-2H-吡喃-4-醇(tetrahydro-2H-pyran-4-ol)进行亲核取代反应获得的(J.Kong,C.Y.Chen,J.Balsells-Padros,Y.Cao,R.F.Dunn,S.J.Dolman,J.Janey,H.Li and M.J.Zacuto,J.Org.Chem.2012,77,3820.&M.E.Jung,G.Deng,J.Org.Chem.2012,77,11002.)。
表4可以看出，对于用S为亚基(B)的化合物11a-c，和P114F5相比，改变亚基(D)氨基甲酸酯组分的烷基并不能显著改善它们的抗病毒活性。然而，对于用O为亚基(B)的化合物11d-f，氨基甲酸酯组分上烷基的改变能够显著的改善化合物的抗病毒活性，它们的抗病毒活性在10μM左右。特别是用叔丁基为烷基的化合物11e，它的抗病毒活性是P114F5的100倍。而对于去掉氨基甲酸酯组分(没有亚基(D))的化合物11g-j，它们的抗病毒活性显著下降，甚至失去抗病毒活性。这些研究结果清晰表明，用氨基甲酸酯组分作为亚基(D)对于化合物展现抗病毒活性是非常重要的。一个可能的原因是carbamate能通过氢键作用和受体产生专一性的相互作用。而用空间位阻大的烷基，如：叔丁基，作为在氨基甲酸酯的烷基可能在抑制剂与靶点作用时形成紧密结合。
实施例6
抑制剂的细胞毒性研究。
为了排除观察到的抗流感活性不是由于抑制剂的细胞毒性产生，抑制剂在三个细胞系中，如狗肾传代细胞细胞(MDCK),人胚肾细胞(HEK293cells)和人类上皮癌细胞(HeLa cells)，用MTT实验验证了最有效的抑制剂化合物11e(J.An,D.C.W.Lee,A.H.Y.Law,C.L.H.Yang,L.L.M.Poon,A.S.Y.Lau and S.J.M.Jones,J.Med.Chem.2009,52,2667.)，结果如下表5所示。

表5：化合物11e的MTT实验结果。
由表5可以看出，化合物11e在任何细胞系中都不具有细胞毒性，甚至浓度上升到mM范围，选择指数值(SI＝MLD₅₀/EC₅₀)超过160,000。这些结果表明哌啶衍生物的极好的抗流感病毒活性并不是非特异性细胞毒素作用。
实施例7
流感病毒抑制剂对不同流感病毒株的抗病毒活性研究。
一个好的抗流感药物应当对于不同流感病毒菌株都具有极好的抑制活性。在对于流感病毒A/Udorn/72(H3N2)的抗性评估之后，检测了最优化合物11e对其他流感病毒株的抗病毒活性。为此，选择流感病毒A的4个病毒株(两株H3N2和两株H1N1株)和一株流感病毒B分别进行EC₅₀值测定，以化合物P114F5为对照，具体测试方法测试参照实施例1，测得EC₅₀如下表6所示。

表6：化合物11e与不同流感病毒进行EC₅₀值测定得到的EC₅₀测量结果。
由表6可以看出，化合物11e有效抑制所有检测的流感病毒株，化合物11e的EC₅₀值可以低到0.05μM。
这些结果表明化合物11e是一个潜在的广谱性抗流感病毒抑制剂。
实施例8
抑制剂的给药时间实验研究。
为了确定哌啶类抑制剂能够有效的抑制流感病毒感染的哪一步，需要先完成一个病毒单程生长曲线，以便确定在病毒生长周期哪个时间点加入抑制剂能够更有效的效果。在目前阶段，已经获得了活性得到显著改善的化合物11e，其EC₅₀值达到了0.10μM。为此，用DMSO溶解化合物11e，并用生长液稀释至终浓度为1.0μM且含1％的DMSO。把抑制剂加入到病毒液(流感病毒A/Udorn/72，H3N2)或者细胞生长液中，(-2)小时意味着病毒液和抑制剂在接种到单层MDCK细胞之前先在37℃作用1小时。在其他的时间点，抑制剂在感染后指定的时间内加入到生长液中并达到使用终浓度。同时设立病毒对照。病毒液在37℃，单层MDCK细胞上吸附1h。然后加入生长液，使病毒感染持续18h。在感染结束后，用蚀斑方法测定每个时间点的病毒滴度，并分析病毒生长曲线和抑制剂加入后的时间之间的关系(J.Y.Yeh,M.S.Coumar,J.T.Horng,H.Y.Shiao,F.M.Kuo,H.L.Lee,I.C.Chen,C.W.Chang,W.F.Tang,S.N.Tseng,C.J.Chen,S.R.Shih,J.T.A.Hsu,C.C.Liao,Y.S.Chao and H.P.Hsieh,J.Med.Chem.2010,53,1519.)，测试结果如图4所示。
由图4可以看出，在感染后6小时内，化合物11e都能显著的抑制病毒的增值。这一结果证明化合物11e在病毒感染的早期阶段能较好的抑制病毒增值。
然而，化合物11e没有显示明显的流感病毒感染抑制性当和在感染之前接种的病毒孵育，相反这是用做对照的融合抑制剂。这项研究表明化合物11e可用于流感病毒复制周期的早期，包括进入或早期的复制阶段。
综上所述，通过化学优化导致发现优化的化合物11e，具有更高的潜力抑制流感病毒复制，化合物11e具有优异的抑制能力(EC₅₀＝0.10μM)。
化合物11e在体外能抑制流感病毒A型和B型菌株活性，并且它对不同的流感病毒株也表现出很好的抗病毒活性，此外，这类化合物的细胞毒性也很低，选择性指数也超过160,000。这些结果表明这类哌啶类化合物可以作为新型流感 病毒抑制剂进行进一步研发。
化合物11e的初步研究机理表明这种类型的哌啶基衍生物干扰流感病毒复制的早期阶段，与化合物11e相互作用的精确靶标还有待发现。这里鉴定的优化先导化合物可以为抗流感药物研发开拓新的机遇。
以下为附录。附录中对本申请中用到的各种检测方法以及筛选得到的部分化合物的合成方法进行简单介绍。
化学合成部分。
除非特别说明，本发明中提及的原材料都是从百灵威化学有限公司或者西格玛奥德里奇化学公司购买。无水THF和二恶烷由钠二苯甲酮蒸馏而来，二氯甲烷由氢化钙蒸馏而来。水是通过Milli-Q水系统(Millipore公司,贝德福德,马萨诸塞州)蒸馏净化，所有反应都是在氮气氛围，无水的干燥剂条件下实施，除非有特别的备注。反应用薄层色谱法(TCL)检测，用0.25毫米的岛津硅胶板(60F-254)，紫外灯作为显影剂，磷钼酸和高锰酸钾的乙醇溶液，加热为展开剂。岛津硅胶(60,粒径大小0.040～0.063毫米)被用做快速柱色谱法去纯化药物。收益率指色谱和光谱(1H NMR)均质材料，除非特别声明。熔点是用SGW X-4B显微熔点仪测量的未修正。所有的化合物用布鲁克300MHz核磁共振或者400MHz的核磁共振波谱仪标记上1H和13C。化学位移以ppm(δ)被记录相对于在对应的谱的残留溶剂峰。三氯甲烷δ7.26和δ77.5,二甲基亚砜-d6δ2.54和δ39.5。耦合常数(J)用赫兹(Hz)记录(其中,s＝singlet,b＝broad,d＝doublet,dd＝double doublet,bd＝broad doublet,ddd＝double doublet of dublet,t＝triplet,dt＝double triplet,q＝quartet,m＝multiplet)，并用ADC ACD核磁共振数据处理软件分析。高分辨率质谱拍摄用布鲁克Apex IV RTMS的电喷雾离子化技(ESI)术。质谱值报告为m/z。
化合物1a-c和化合物1g-i的制备：除气的4-乙基1-巯基哌啶羧化物(227毫克,1.20毫摩尔)溶液在5毫升无水DMF中0℃加入氢化钠(60％在矿物油中，48毫克，1.20毫摩尔)。这个悬浮液再在室温下搅拌15分钟。然后，商业化的4-氯喹啉衍生物2a-c或者其他芳香环的化合物2g-i(1.00毫摩尔)溶液在5毫升无 水DMF中加入上述的悬浮液，这种混合物再在50℃搅拌直到芳香环化合物消失。这个反应混合物再倒入冰水中并用乙酸乙酯萃取，硫酸镁干燥，然后浓缩。残渣再用快速色谱(二氧化硅，乙酸乙酯/己烷作为洗脱液)纯化得到的主要化合物1a-e和化合物1g-i有60-85％的产率。
1d-f的准备：除气的苯硫酚溶液或者1-巯基萘衍生物(1.20毫摩尔)在5毫升除气的DMF中0℃加入氢化钠(60％在矿物油中，48毫克，1.20毫摩尔)。这个悬浮液再在室温下搅拌15分钟。然后，商业化的4-乙基1-溴哌啶羧化物4(236毫克,1.00毫摩尔)溶液在5毫升无水DMF中加入上述的悬浮液，这种混合物再在50℃搅拌5h直到4消失。这个反应混合物再倒入冰水中并用乙酸乙酯萃取，硫酸镁干燥，然后浓缩。残渣再用快速色谱(二氧化硅，乙酸乙酯/己烷作为洗脱液)纯化得到的主要化合物1d-f有75-90％的产率。
化合物1a-i的制备流程如下，反应条件为NaH,DMF,50℃,5h,产率为60-85％：

化合物1a由4-氯-2-苯基喹啉(4-chloro-2-phenylquinoline)和叔丁基4-硫醇基-1-甲酸乙酯(tert-butyl4-mercaptopiperidine-1-carboxylate)制得，产率为65％，产物为淡黄色固体，产物熔点为110-112℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.22(dd,J＝8.4,3.0,2H,Ar-H),8.11(J＝8.4,1.8,2H,Ar-H),7.78(s,1H,Ar-H),7.73(t,J＝6.9,1H,Ar-H),7.56-7.47(m,4H,Ar-H),4.12(q,J＝6.0,2H,OCH₂),4.09-4.00(m,2H,NCH₂),3.66-3.62(m,1H,SCH),3.20-3.11(m,2H,NCH₂),2.13-2.10(m,2H,NCH₂CH₂),1.78-1.72(m,2H,NCH₂CH₂),1.26(t,J＝6.9,3H, OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,CDCl₃):δ156.48,155.33,147.96,145.14,139.46,130.26,130.04,129.44,128.87,127.52,126.53,126.36,123.96,117.74,61.44,42.97,42.30,31.90,14.64.HRMS(ESI)：C₂₃H₂₅N₂O₂S[M+H]⁺计算值为393.1637,实测值为393.1630。
化合物1b由2,4-二氯喹啉(2,4-dichloroquinoline)和乙基4-硫醇基-1-羧酸叔丁酯(ethyl 4-mercaptopiperidine-1-carboxylate)制得，产率为60％，产物为类白色固体，产物熔点为98-100℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.14(dd,J＝7.5,3.0,1H,Ar-H),7.92(d,J＝8.1,1H,Ar-H),7.73(dt,J＝6.9,1.5,1H,Ar-H),7.53(dt,J＝8.1,1.2,1H,Ar-H),7.30(s,1H,Ar-H),4.32-4.26(m,1H,SCH),4.15(q,J＝7.0,2H,OCH₂),4.10-3.90(m,2H,NCH₂),3.27-3.18(m,1H,NCH₂),2.97-2.89(m,1H,NCH₂CH₂),2.20-2.14(m,1H,NCH₂CH₂),2.02-1.96(m,1H,NCH₂CH₂),1.80-1.56(m,1H,NCH₂CH₂),1.26(t,J＝7.0,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,CDCl₃):δ158.92,155.01,154.97,148.61,141.41,131.71,128.43,127.28,124.18,123.73,120.94,61.18,43.47,36.33,35.42,31.75,21.14,14.96.HRMS(ESI)：C₁₇H₁₉N₂O₂NaSCl[M+Na]⁺计算值为373.0753,实测值为373.0746。
化合物1c由4-氯吡啶(4-chloropyridine)和乙基4-硫醇基-1-羧酸叔丁酯(ethyl 4-mercaptopiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为85％，产物为灰色固体，产物熔点为88-90℃。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ8.62(d,J＝6.6,2H,Ar-H),7.90(d,J＝6.6,2H,Ar-H),4.06-3.99(m,3H,OCH₂and SCH),3.92-3.87(m,2H,NCH₂),3.15-3.07(m,2H,NCH₂),2.05-2.00(m,2H,NCH₂CH₂),1.56-1.51(m,2H,NCH₂CH₂),1.17(t,J＝6.9,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ161.39,154.88,140.32,122.97,61.22,43.11,40.73,31.17,14.98.HRMS(ESI)：C₁₃H₁₉N₂O₂S[M+H]⁺计算值为267.1167,实测值为267.1161。
化合物1d由4-甲基苯硫(4-methylbenzenethiol)和乙基4-溴哌啶基-1-羧酸叔丁酯(ethyl 4-bromopiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为75％，产物为淡黄色固体，产物熔点为82-85℃。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ7.34(d,J＝8.1,2H,Ar-H),7.12(d,J＝8.1,2H,Ar-H),4.12(q,J＝7.2,2H,OCH₂),4.03-3.99(m,2H,NCH₂),3.15-3.10(m,1H,SCH),2.99-2.90(m,2H,NCH₂),2.34(s,3H,Ar-CH₃), 1.94-1.88(m,2H,NCH₂CH₂),1.58-1.49(m,2H,NCH₂CH₂),1.25(t,J＝7.2,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ154.89,137.15,132.60,130.07,61.07,43.59,43.20,32.14,20.93,14.85.HRMS(ESI)：C₁₅H₂₂NO₂S[M+H]⁺计算值为,实测值为280.1367。
化合物1e由4-甲氧基苯(4-methoxybenzenethiol)和乙基4-溴哌啶基-1-羧酸叔丁酯(ethyl 4-bromopiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为80％，产物为淡黄色固体，熔点为90-92℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ7.39(d,J＝9.0,2H,Ar-H),6.84(d,J＝9.0,2H,Ar-H),4.10(q,J＝7.2,2H,OCH₂),4.04-3.95(m,2H,NCH₂),3.80(s,3H,OCH₃),3.05-2.96(m,1H,SCH),2.96-2.86(m,2H,NCH₂),1.90-1.84(m,2H,NCH₂CH₂),1.53-1.41(m,2H,NCH₂CH₂),1.23(t,J＝7.0,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ159.56,154.93,135.67,123.43,115.04,61.10,55.55,44.44,43.25,32.15,14.89.HRMS(ESI)：C₁₅H₂₂NO₃S[M+H]⁺计算值为296.1320，实测值为296.1309。
化合物1f由萘-1-硫醇(naphthalene-1-thiol)和乙基4-溴哌啶基-1-羧酸叔丁酯(ethyl 4-bromopiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为78％，产物为淡黄色固体，产物熔点为95-97℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.54(dd,J＝6.9,1.2,1H,Ar-H),7.89-7.82(m,2H,Ar-H),7.75(dd,J＝8.0,1.2,1H,Ar-H),7.42(dd,J＝8.4,1.2,1H,Ar-H),4.12(q,J＝7.2,2H,OCH₂),4.03-3.99(m,2H,NCH₂),3.28-3.21(m,1H,SCH),2.98-2.89(m,2H,NCH₂),1.93-1.88(m,2H,NCH₂CH₂),1.62-1.58(m,2H,NCH₂CH₂),1.26(t,J＝7.2,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ154.93,134.06,133.76,131.71,130.86,129.02,128.60,127.23,126.78,126.19,125.31,61.12,43.77,43.20,32.24,14.91.HRMS(ESI)：C₁₈H₂₂NO₂S[M+H]⁺计算值为316.1371,实测值为316.1363。
化合物1g由4-氯-7-甲基-2H-吡喃-2酮(4-chloro-7-methyl-2H-chromen-2-one)和乙基4-硫醇基-1-羧酸叔丁酯(ethyl 4-mercaptopiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为85％，产物为类白色固体，产物熔点为120-122℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ7.61(d,J＝8.4,2H,Ar-H),7.14-7.08(m,2H,Ar-H),6.15(s,1H,Ar-H),4.16(q,J＝7.2,2H,OCH₂),4.11-4.02(m,2H,NCH₂),3.59-3.53(m,1H, SCH),3.21-3.13(m,2H,NCH₂),2.45(s,3H,Ar-CH₃),2.19-2.14(m,2H,NCH₂CH₂),1.81-1.76(m,2H,NCH₂CH₂),1.26(q,J＝7.2,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ158.68,154.90,154.25,152.17,143.87,125.87,123.83,117.24,115.49,106.81,70.54,61.19,31.38,21.38,14.96.HRMS(ESI)：C₁₈H₂₂NO₄S[M+H]⁺计算值为348.1270,实测值为348.1265。
化合物1h由4-氯-7-甲氧基-2H-吡喃-2酮(4-chloro-7-methoxy-2H-chromen-2-one)和乙基4-硫醇基-1-羧酸叔丁酯(ethyl 4-mercaptopiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为80％，产物为类白色固体，产物熔点为125-127℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ7.63(d,J＝9.0,1H,Ar-H),6.86-6.81(m,2H,Ar-H),6.06(s,1H,Ar-H),4.16(q,J＝7.2,2H,OCH₂),4.10-4.03(m,2H,NCH₂),3.88(s,3H,Ar-OCH₃),3.58-3.55(m,1H,SCH),3.21-3.12(m,2H,NCH₂),2.19-2.23(m,2H,NCH₂CH₂),1.79-1.72(m,2H,NCH₂CH₂),1.28(t,J＝6.9,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ163.10,158.87,154.90,154.40,154.05,125.32,112.74,111.31,104.78,101.36,61.18,56.40,43.16,31.45,14.98.HRMS(ESI)：C₁₈H₂₂NO₅S[M+H]⁺计算值为364.1219,实测值为364.1209.
化合物1i由4-氯喹啉-2(1H)-酮(4-chloroquinolin-2(1H)-one)和乙基4-硫醇基-1-羧酸叔丁酯(ethyl 4-mercaptopiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为72％，产物为类白色固体，产物熔点为132-135℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ12.24(s,1H,CONH),7.81(d,J＝7.2,1H,Ar-H),7.47-7.45(m,1H,Ar-H),7.37-7.34(m,1H,Ar-H),7.17-7.15(m,1H,Ar-H),6.49(s,1H,Ar-H),4.10(q,J＝7.2,2H,OCH₂),4.03-3.98(m,2H,NCH₂),3.56-3.49(m,1H,SCH),2.15-2.09(m,2H,NCH₂CH₂),1.71-1.67(m,2H,NCH₂CH₂),1.22(t,J＝7.2,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ163.02,155.35,150.73,137.61,131.06,123.95,122.46,118.81,116.77,114.24,61.50,43.15,40.95,31.40,14.65.HRMS(ESI)：C₁₇H₂₁N₂O₃S[M+H]⁺计算值为333.1273,实测值为333.1272。
化合物6a-b的制备：除气的4-乙基1-羟基哌啶羧化物溶液或者4-乙基1-氨基哌啶羧化物(1.20毫摩尔)在5毫升无水DMF中0℃加入氢化钠(60％在矿物油中，48毫克，1.20毫摩尔)。这个悬浮液再在室温下搅拌15分钟。然后，商 业化的4-氯喹啉(163毫克，1.00毫摩尔)溶液在5毫升无水DMF中加入上述的悬浮液，这种混合物再在90℃搅拌直到4-氯喹啉消失。这个反应混合物再倒入冰水中并用乙酸乙酯萃取，硫酸镁干燥，然后浓缩。残渣再用快速色谱(二氧化硅，乙酸乙酯/己烷作为洗脱液)纯化得到的主要化合物6a-b有75-90％的产率。
化合物6a-b的制备流程如下，反应条件为NaH,DMF,50℃,5h,产率为75-90％：

化合物6a由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和乙基4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(ethyl 4-hydroxypiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为90％，产物为淡黄色固体，产物熔点为95-97℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.73(d,J＝5.0,1H,Ar-H),8.23(dd,J＝8.4,0.9,1H,Ar-H),8.03(d,J＝8.7,1H,Ar-H),7.70(dd,J＝9.9,1.5,1H,Ar-H),7.51(dd,J＝8.4,0.9,1H,Ar-H),6.74(d,J＝5.4,1H,Ar-H),4.82-4.68(m,1H,OCH),4.17(q,J＝7.2,2H,OCH₂),3.78-3.70(m,2H,NCH₂),3.64-3.56(m,2H,NCH₂),2.04-1.93(m,4H,NCH₂CH₂),1.26(m,J＝7.2,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ159.77,155.47,151.07,149.45,129.83,128.88,125.63,121.78,101.39,72.12,61.42,40.40,29.97,14.66.HRMS(ESI)：C₁₇H₂₁N₂O₃[M+H]⁺计算值为301.1552,实测值为301.1544。
化合物6b由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和乙基4-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯(ethyl 4-aminopiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为75％，产物为白色固体，产物熔点为88-90℃。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ8.16(d,J＝7.8,1H,Ar-H),7.73(dd,J＝8.1,1.8,1H,Ar-H),7.42-7.35(m,2H,Ar-H),7.26(t,J＝8.1,1H,Ar-H),7.07(d,J＝8.1,1H,Ar-H),6.61(d,J＝7.8,1H,Ar-H),5.79(d,J＝7.8,1H,Ar-NH-CH),4.13-3.94(m,4H,NCH₂and OCH₂CH₃),3.75-3.68(m,1H, Ar-NH-CH),3.03-2.92(m,2H,NCH₂),2.01-1.97(m,2H,NCH₂CH₂),1.50-1.38(m,2H,NCH₂CH₂),1.18(t,J＝6.9,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ155.17,143.07,134.59,128.33,127.16,126.00,124.30,123.53,122.10,115.88,104.15,61.11,49.45,43.06,31.58,15.01.HRMS(ESI)：C₁₇H₂₁N₃O2[M]⁺计算值为299.1634,实测值为299.1750。
化合物8a-f的制备过程类似于化合物6a-b。
化合物8a-f的制备流程如下，反应条件为NaH,DMF,50℃,5h,产率为50-85％：

化合物8a由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和乙基4-巯基苯(ethyl 4-mercaptobenzoate)制备得到，产率为85％，产物为白色固体产物熔点为115-117℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.68(d,J＝9.4,1H,Ar-H),8.23(d,J＝0.9,1H,Ar-H),8.20(d,J＝0.9,1H,Ar-H),8.10(d,J＝8.4,2H,Ar-H),7.77(dt,J＝5.7,1.5,1H,Ar-H),7.60(dt,J＝6.2,1.2,1H,Ar-H)7.53(dd,J＝6.6,1.2,1H,Ar-H)7.03(d,J＝4.5,1H,Ar-H),4.40(q,J＝7.2,2H,OCH₂),1.40(t,J＝7.2,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ165.46,150.50,148.02,144.15,137.37,132.91,130.92,130.71,130.29,130.26,127.85,126.38,124.10,121.70,61.41,14.50.HRMS(ESI)：C₁₈H₁₆NO₂S[M+H]⁺计算值为310.0902,实测值为310.0891。
化合物8b由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和乙基4-羟基苯(ethyl4-hydroxybenzoate)制备得到，产率为80％，产物为灰白色固体，产物熔点为106-108℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.74(d,J＝4.2,1H,Ar-H),8.32(d,J＝1.0,1H),8.17(m,3H,Ar-H),7.80(dt,J＝5.1,0.9,1H,Ar-H),7.60(dt,J＝6.3,0.9, 1H,Ar-H),7.23(d,J＝3.6,2H,Ar-H),6.67(d,J＝3.9,1H,Ar-H),4.41(d,J＝5.1,2H,OCH₂),1.42(t,J＝5.4,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,CDCl₃):δ165.39,159.99,158.73,151.89,149.81,132.16,130.83,129.32,127.12,121.78,121.28,120.67,106.71,61.24,40.65,38.99,14.54.HRMS(ESI)：C₁₈H₁₆NO₃[M+H]⁺计算值为294.1130,实测值为294.1126。
化合物8c由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和乙基4-氨基苯甲酸(ethyl4-aminobenzoate)制备得到，产率为50％，产物为灰白色固体，产物熔点为98-100℃。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ9.32(s,1H,Ar-H),8.59(d,J＝4.0,1H,Ar-H),8.33(d,J＝6.0,1H,Ar-NH-Ar),7.93(m,3H,Ar-H),7.73(t,J＝1.0,1H,Ar-H),7.59(t,J＝1.0,1H,Ar-H),7.44(d,J＝6.0,2H,Ar-H),7.26(d,J＝4.0,1H,Ar-H),4.29(q,J＝6.0,2H,OCH₂),1.31(t,J＝6.0,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ165.78,151.08,149.41,146.50,146.17,131.15,129.96,129.63,125.59,123.33,122.77,121.10,119.35,105.18,60.74,14.64.HRMS(ESI)：C₁₈H₁₇N₂O₂[M+H]⁺计算值为293.1290,实测值为293.1287。
化合物8d(顺/反异构体)由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和乙基4-羟基环己烷(ethyl 4-hydroxycyclohexanecarboxylate，顺/反异构体)制备得到，产率为65％，产物为灰白色固体，产物熔点为91-96℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.73(d,J＝5.4,1H,Ar-H),8.20(d,J＝7.5,0.9,1H,Ar-H),8.03(d,J＝8.4,1H,Ar-H),7.70(dt,J＝8.1,1.5,1H,Ar-H),7.50(dd,J＝8.1,0.9,1H,Ar-H),6.74(d,J＝5.4,1H,Ar-H),4.56-4.52(m,1H,Ar-OCH),4.18(q,J＝6.9,2H,OCH₂),2.51-249(m,1H,CHCO₂Et),2.32-2.28(m,2H,CH₂CH₂),2.20-2.14(m,2H,CH₂CH₂),1.74-1.66(m,4H,CH₂CH₂),1.29(t,J＝6.9,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ174.91,159.83,151.84,149.29,130.04,128.90,125.90,122.03,121.62,102.56,75.27,60.25,55.23,41.37,30.04,26.46,14.46.HRMS(ESI)：C₁₈H₂₃NO₃[M+H]⁺计算值为300.1600,实测值为300.1591。
化合物8e(顺/反异构体)由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和乙基4-巯基环己烷(ethyl 4-mercaptocyclohexanecarboxylate，顺/反异构体)制备得到，产率为80％，产物为灰白色固体，产物熔点为94-99℃.¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.72 (d,J＝4.8,1H,Ar-H),8.22(d,J＝8.4,1H,Ar-H),8.09(d,J＝8.4,1H,Ar-H),7.73(dt,J＝8.1,0.9,1H,Ar-H),7.59(dt,J＝8.1,0.9,1H,Ar-H),7.26(s,1H,Ar-H),4.17(q,J＝7.2,2H,OCH₂),3.82-3.6(m,1H,Ar-SCH),2.53-2.48(m,1H,CHCO₂Et),2.14-2.05(m,2H,CH₂CH₂),2.01-1.96(m,4H,CH₂CH₂),1.86-1.79(m,2H,CH₂CH₂),1.28(t,J＝6.8,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ174.66,149.95,147.50,145.83,130.23,130.05,127.02,126.49,123.83,117.99,70.54,60.24,41.53,29.40,25.50,14.50.HRMS(ESI)：C₁₈H₂₂NO₂S[M+H]⁺实测值为316.1371,实测值为316.1365。
化合物8f(顺/反异构体)由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和乙基4-氨基环己烷(ethyl 4-aminocyclohexanecarboxylate，顺/反异构体)制备得到，产率为55％，产物为灰白色固体，产物熔点为87-92℃。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.54(t,J＝5.2,1H,Ar-H),7.98(d,J＝8.4,1H,Ar-H),7.71(t,J＝7.6,1H,Ar-H),7.63(dt,J＝6.8,0.9,1H,Ar-H),7.43(t,J＝7.2,1H,Ar-H),6.44(t,J＝5.6,1H,Ar-H),5.01(d,J＝6.8,0.6H,Ar-NH-CH),4.90-4.80(m,0.4H,Ar-NH-CH),4.20-4.11(m,2H,OCH₂),3.72(b,0.6H,Ar-NH-CH),3.54-3.50(m,0.4H,Ar-NH-CH),2.60-2.56(m,0.6H,CHCO₂Et),2.39-2.31(m,0.4H,CHCO₂Et),2.16-2.08(m,1H,CH₂CH₂),2.03-1.92(m,2H,CH₂CH₂),1.84-1.79(m,2H,CH₂CH₂),1.72-1.62(m,1H,CH₂CH₂),1.39-1.32(m,1H,CH₂CH₂),1.28(t,J＝6.8,3H,OCH₂CH₃).¹³C NMR(75.5MHz,CDCl₃):δ175.23,174.57,151.00,149.36,149.31,148.86,129.33,129.29,129.05,123.94,122.46,122.35,119.30,119.25,99.00,70.55,60.15,50.60,49.84,42.34,31.09,28.65,28.00,25.66,14.58,14.52.HRMS(ESI)：C₁₈H₂₃N₂O₂[M+H]⁺实测值为299.1760,计算值为299.1741。
化合物11a-b和化合物11d-e的制备：除气的4-烷基1-巯基哌啶羧化物溶液或者4-乙基1-羟基哌啶羧化物(1.20毫摩尔)在5毫升无水DMF中0℃加入氢化钠(60％在矿物油中，48毫克，1.20毫摩尔)。这个悬浮液再在室温下搅拌15分钟。然后，商业化的4-氯喹啉(1.00毫摩尔)溶液在5毫升无水DMF中加入上述的悬浮液，这种混合物再在50℃搅拌5h直到4-氯喹啉消失。这个反应混合物再倒入冰水中并用乙酸乙酯萃取，硫酸镁干燥，然后浓缩。残渣再用快速色谱 (二氧化硅，乙酸乙酯/己烷作为洗脱液)纯化得到的主要化合物11a-b和化合物11d-e有70-90％的产率。
化合物11g-h的制备：化合物11b或化合物11e(1.00毫摩尔)溶液在5毫升二氯甲烷中0℃加入三氟乙酸(1.0毫升,1.00毫摩尔)。然后，这个混合物室温搅拌直到化合物11b或化合物11e消失。这个反应混合物再减压浓缩。最后残渣再用乙酸乙酯溶解，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，硫酸镁干燥，浓缩。残渣再用快速色谱(二氧化硅，乙酸乙酯/己烷作为洗脱液)纯化得到的主要化合物11g-h有90-95％的产率。
化合物11c和化合物11f的制备：除气的正丁醇(1.00毫摩尔)溶液在5毫升除气的THF中0℃加入N,N’-羰二咪唑(162毫克，1.00毫摩尔)。这个混合物再在室温下搅拌15分钟。然后，化合物11g或化合物11h(1.00毫摩尔)在5毫升的无水THF溶液中加入上述的混合物。这个混合物再在室温下搅拌12h。这个反应混合物减压浓缩，残渣再用乙酸乙酯溶解，用10％的盐酸和饱和的氯化钠洗涤，硫酸镁干燥，浓缩。残渣再用快速色谱(二氧化硅，乙酸乙酯/己烷作为洗脱液)纯化得到的主要化合物11c和化合物11f有55-75％的产率。
化合物11i-j的制备：除气的3-开环四氢呋喃溶液或者四氢化-2H-4-开环吡喃(1.20毫摩尔)在5毫升无水的DMF中0℃加入氢化钠(60％在矿物油中，48毫克，1.20毫摩尔)。这个悬浮物再在室温下搅拌15分钟。然后，4-氯喹啉(1.00毫摩尔)溶液在5毫升无水DMF中加入上述的悬浮液，这种混合物再在50℃搅拌5h直到4-氯喹啉消失。这个反应混合物再倒入冰水中并用乙酸乙酯萃取，硫酸镁干燥，然后浓缩。残渣再用快速色谱(二氧化硅，乙酸乙酯/己烷作为洗脱液)纯化得到的主要化合物11a-b和化合物11i-j有90-95％的产率。
化合物11a-j的制备流程如下，反应条件为(a)NaH,DMF,50℃,5h,产率为70-90％；(b)TFA,DCM,室温,2h,产率为90-95％；(c)N,N'-carbonyldiimidazole(CDI),n-C₆H₁₃OH，室温，THF，12h,产率为55-70％：

化合物11a由4-氯-喹啉(4-chloro-quinoline)和甲基4-巯基-1-羧酸叔丁酯(methyl 4-mercaptopiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为90％，产物为黄色固体，产物熔点为105-107℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.74(d,J＝4.8,1H,Ar-H),8.19(d,J＝8.4,1H,Ar-H),8.09(d,J＝8.4,1H,Ar-H),7.73(dt,J＝8.4,4.8,1H,Ar-H),7.56(dt,J＝8.4,4.8,1H,Ar-H),7.29(d,J＝4.8,1H,Ar-H),4.10-3.95(b,2H,NCH₂),3.70(s,3H,CO₂CH₃),3.64-3.59(m,1H,Ar-SCH),3.19-3.12(m,2H,NCH₂),2.16-2.05(m,2H,NCH₂CH₂),1.80-1.65(m,2H,NCH₂CH₂).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ155.93,149.16,147.76,145.69,130.16,130.03,127.46,126.83,124.15,118.62,52.89,43.29,41.95,31.77.HRMS(ESI)：C₁₆H₁₉N₂O₂S[M+H]⁺计算值为303.1167,实测值为303.1160.
化合物11b由4-氯-喹啉(4-chloro-quinoline)和叔丁基4-巯基-哌啶-1-甲酸叔丁酯(tert-butyl 4-mercapto-piperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为80％，产物为黄色固体，产物熔点为100-102℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.69(d,J＝4.8,1H,Ar-H),8.15(dd,J＝8.7,0.9,1H,Ar-H),8.03(d,J＝8.4,1H,Ar-H),7.67(dt,J＝6.9,1.5,1H,Ar-H),7.51(dt,J＝5.7,1.5,1,Ar-H H),7.24(d,J＝4.8,1H,Ar-H),3.95-3.88(m,2H,NCH₂),3.58-3.52(m,1H,SCH),3.08-2.99(m,2H,NCH₂),2.03-1.99(m,2H,NCH₂CH₂),1.68-1.58(m,2H,NCH₂CH₂),1.41(s,9H,OC₄H₉).¹³C NMR(75.5MHz,CDCl₃):δ154.52,149.10,147.69,145.34,129.91,129.80,127.19,126.48,123.91,118.21,79.77,41.79,31.60,28.28.HRMS(ESI)：C₁₉H₂₅N₂O₂S计算值为[M+H]⁺345.1637,实测值为345.1626。
化合物11c由化合物11g和正己醇(n-hexyl alcohol)制备得到，产率为55％，产物为淡黄色固体产物熔点为96-99℃。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.75(d,J＝4.8,1H,Ar-H),8.20(d,J＝8.4,1H,Ar-H),8.13(d,J＝8.4,1H,Ar-H),7.75(dt,J＝8.4,1.2,1H,Ar-H),7.60(d,J＝7.2,1H,Ar-H),7.31(d,J＝4.8,1H,Ar-H),4.10-3.90(m,4H,OCH₂C₅H₁₁and NCH₂),3.65-3.63(m,1H,SCH),3.20-3.13(m,2H,NCH₂),2.21-2.11(m,2H,NCH₂CH₂),1.80-1.70(m,2H,NCH₂CH₂),1.65-1.55(m,2H,OC₂H₄CH₂C₃H₇),1.37-1.25(m,6H,OC₂H₄C₃H₆CH₃),0.91(t,J＝3.6,3H,OC₅H₁₀CH₃).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ155.61,150.02,146.83,145.42,132.93,129.95,128.85,128.34,117.63,68.07,45.43,40.12,31.56,31.27,30.45,28.86,25.52,22.40,14.16,149.17,147.77,145.69,130.12,130.03,127.45,126.80,124.14,118.60,65.90,43.22,42.00,31.79,31.59,29.08,25.75,22.68,14.16.HRMS(ESI)：C₂₁H₂₉N₂O₂S[M+H]⁺计算值为373.1950，实测值为373.1945。
化合物11d由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和甲基4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(methyl 4-hydroxypiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为82％，产物为橘黄色固体，产物熔点为102-104℃。¹H-NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.73(d,J＝5.1,1H,Ar-H),8.22(dd,J＝8.4,1H,Ar-H),8.04(d,J＝8.4,1H,Ar-H),7.70(dt,J＝8.1,0.9,1H,Ar-H),7.50(dt,J＝8.4,0.9,1H,Ar-H),6.74(d,J＝5.1,1H,Ar-H),4.87-4.75(m,1H,OCH),3.79-3.68(m,5H,CO₂CH₃and,NCH₂),3.64-3.56(m,2H,NCH₂),2.08-1.95(m,4H,NCH₂CH₂).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ159.61,155.52,151.76,149.13,130.23,128.78,126.12,122.12,121.61,102.74,72.51,52.78,40.82,30.05.HRMS(ESI)：C₁₆H₁₉N₂O₃[M+H]⁺计算值为287.1396,实测值为287.1400。
化合物11e由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和叔丁基4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(tert-butyl 4-hydroxypiperidine-1-carboxylate)制备得到，产率为75％，产物为淡黄色固体，产率为95-97℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.74(d,J＝5.1,1H,Ar-H),8.23(dd,J＝6.3,0.9,1H,Ar-H),8.03(d,J＝8.4,1H,Ar-H),7.71(t,J＝6.6,1H,Ar-H),7.51(t,J＝6.6,1H,Ar-H),6.74(d,J＝4.2,1H,Ar-H),4.84-4.81(m,1H,OCH),3.74-3.68(m,2H,NCH₂),3.56-3.50(m,2H,NCH₂),2.07-1.94(m,4H, NCH₂CH₂),1.29(s,9H,OC₄H₉).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ159.48,154.32,151.84,149.37,130.10,128.97,126.01,122.11,121.64,102.69,79.20,72.62,30.20,28.68.HRMS(ESI)：C₁₉H₂₆N₂O₃[M+H]⁺计算值为329.1865,实测值为329.1855。
化合物11f由化合物11h和正己醇(n-hexyl alcohol)制备得到，产率为65％，产物为淡黄色固体，产物熔点为88-90℃。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.73(d,J＝5.4,1H,Ar-H),8.21(dd,J＝8.4,1.2,1H,Ar-H),8.06(d,J＝8.4,1H,Ar-H),7.70(dt,J＝5.4,1.2,1H,Ar-H),7.52(dd,J＝8.0,0.8,1H,Ar-H),6.74(d,J＝5.6,1H,Ar-H),4.90-4.80(m,1H,OCH),4.09(d,J＝6.7,2H OCH₂C₅H₁₁),3.80-3.70(m,2H),3.65-3.51(m,2H,NCH₂),2.10-1.90(m,4H,NCH₂CH₂),1.70-1.60(m,2H,OC₂H₄CH₂C₃H₇),1.40-1.30(m,6H,OC₂H₄C₃H₆CH₃),1.28(t,J＝6.3,3H,OC₅H₁₀CH₃).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ160.22,155.76,151.01,149.25,130.23,128.82,125.97,122.02,121.98,101.53,72.42,65.92,40.58,31.61,30.16,29.11,25.77,22.69,14.16.HRMS(ESI)：C₂₁H₂₉N₂O₂S[M+H]⁺计算值为373.1950，实测值为373.1948。
化合物11g由化合物11b和TFA制备得到，产率为90％，产物为黄色固体，产物熔点为99-103℃。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ9.20(b,2H,(CH₂)NH·HCl),8.99(d,J＝6.0,1H,Ar-H),8.27(d,J＝9.0,2H,Ar-H),8.10(t,J＝6.9,1H,Ar-H),7.96(d,J＝6.6,1H,Ar-H),7.85(t,J＝7.2,1H,Ar-H),4.40-4.15(m,1H,SCH),3.40-3.31(m,2H,NCH₂),3.15-3.10(m,2H,NCH₂),2.31-2.25(m,2H,NCH₂CH₂),1.96-1.93(m,2H,NCH₂CH₂).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ157.75,143.67,137.86,134.47,129.69,125.65,124.30,122.99,116.96,42.87,40.66,28.15.HRMS(ESI)：C₁₄H₁₇N₂S[M+H-HCl]⁺计算值为245.1112,实测值为245.1111。
化合物11h由化合物11e和TFA制备得到，产率为95％，产物为类白色固体，产物熔点为93-95℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.72(d,J＝5.2,1H,Ar-H),8.26(d,J＝8.4,1H,Ar-H),8.02(d,J＝8.4,1H,Ar-H),7.70(dt,J＝6.0,1.2,1H,Ar-H),7.51(t,J＝7.6,1H,Ar-H),6.74(d,J＝5.2,1H,Ar-H),5.69-5.31(b,1H, (CH₂)NH),4.47-4.71(m,1H,OCH),3.25-3.19(m,2H,NCH₂),2.88-2.81(m,2H,NCH₂),2.15-2.10(m,2H,NCH₂CH₂),1.91-1.75(m,2H,NCH₂CH₂).¹³C NMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ159.63,151.87,149.38,130.04,129.00,125.93,122.07,121.74,102.70,74.37,43.62,40.69,32.00.HRMS(ESI)：C₁₄H₁₇N₂O[M+H]⁺计算值为229.1341,实测值为229.1338。
化合物11i由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和四氢呋喃-3-醇(tetrahydrofuran-3-ol)制备得到，产率为90％，产物为淡黄色固体，产物熔点为87-90℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ9.07(b,1H,Ar-H),8.63(d,J＝6.31H,Ar-H),8.34(d,J＝6.3,1H,Ar-H),7.99(t,J＝6.01H,Ar-H),7.78(t,J＝6.31H,Ar-H),7.34(b,1H,Ar-H),5.52(s,1H,OCH),4.26-4.11(m,3H,OCH₂CHCH₂and CH₂OCH₂CH₂),4.05-3.95(m,1H,CH₂OCH₂CH₂),2.33(b,1H,CH₂OCH₂CH₂),2.20(b,1H,CH₂OCH₂CH₂).¹³C NMR(75.5MHz,CDCl₃):δ166.91,146.81,139.27,134.84,129.12,123.46,120.86,103.80,82.05,72.35,70.54,66.98,32.69.HRMS(ESI)：C₁₃H₁₄NO₂[M+H]⁺计算值为216.1025,实测值为216.1022。
化合物11j由4-氯喹啉(4-chloroquinoline)和四氢-2H-吡喃-4-醇(tetrahydro-2H-pyran-4-ol)制备得到，产率为95％，产物为黄色固体，产物熔点为87-91℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.97(b,1H,Ar-H),8.69(d,J＝6.3,1H,Ar-H),8.38(d,J＝6.3,1H,Ar-H),8.01(t,J＝6.0,1H,Ar-H),7.80(t,J＝5.7,1H,Ar-H),7.26-7.16(m,1H,Ar-H),5.12(b,1H,OCH),4.10-4.07(m,2H,CH₂OCH₂CH₂),3.77-3.72(m,2H,CH₂OCH₂CH₂),2.35-2.25(m,2H,CH₂OCH₂CH₂),2.06-2.04(m,2H,CH₂OCH₂CH₂).¹³C NMR(75.5MHz,CDCl₃):δ166.80,146.72,139.30,134.81,129.06,123.47,120.94,120.78,103.63,75.82,64.48,31.21.HRMS(ESI)：C₁₄H₁₆NO₂[M+H]⁺计算值为230.1181,实测值为230.1180。
细胞和病毒。
MDCK细胞(Madin-Darby canine kidney cell),HEK 293细胞和Hela细胞均从中国菌种保藏中心(China Center for Type Culture Collection)获得。
流感病毒A/udorn/72(H3N2),流感病毒A/PR/8/34(H1N1),流感病毒 A1/Jingfang 86-1(H1N1)和流感病毒A3/Lufang93-1(H3N2)均从中国菌种保藏中心(China Center for Type Culture Collection)获得。
流感病毒B/Shenzhen/747从深圳疾病预防控制中心(Shenzhen Centers for Disease Control and Prevention)获得。
基于MDCK细胞的抗流感病毒活性高通量活性筛选。
平底96孔板(板A)每个孔中添加110μL含有0.1％TCPK-胰酶和1％抗生素的DMEM培养基。1μL 5mM阳性对照(病毒唑)加入到12-A,B,C和D孔中，1μL 1μM阴性对照(F136)加入到12-E,F,G和H孔中。剩下的孔中加入1μL化合物(每孔化合物10μg/100μL溶解与1％DMSO溶液，来自Sigma-Aldrich公司的万级筛选库)。另一个96孔板(板B)中MDCK细胞单层生长，用PBS洗后感染100PFU的A/Udorn/72流感病毒，除了孔1-A,B,C和D不加病毒作为空白对照。细胞感染1小时后，板B用PBS洗，然后加入100μL和板A相同的含化合物培养基。培养板在37℃5％CO₂条件下培养48小时。然后板固定并用0.5％晶体紫罗兰溶液染色。空白对照和病毒唑对照的孔被染色为深紫色，而细胞病变的孔完全或者部分无色。病毒感染阳性抑制筛选的化合物鉴定为结果如病毒唑一致的样品。
抑制剂基于MDCK细胞的抗流感病毒活性测定(EC₅₀值测定)。
哌啶基衍生物的抗流感病毒活性测EC₅₀值。MDCK细胞(1.2x 10⁵细胞/孔inDMEM with10％FBS)接种到12孔组织培养平板在潮湿的含5％二氧化碳的孵育器中37℃孵育48h。在孵育器中的细胞用病毒(100PFU,Udorn-4)感染1h，然后吸附病毒，病毒悬浮液弃去，细胞用DMEM洗涤，细胞单层然后用含1％琼脂和连续化合物稀释度(六个梯度两倍连续稀释,每个浓度测2个孔)的DMEM培养基覆盖，培养基存在1‰TCPK-trypsinand1％抗生素。感染48h后，单层细胞固定并用0.5％的晶体紫罗兰溶液染色，病毒诱导的斑块的数量可以计数。
抑制剂的细胞毒性研究。
化合物11e的细胞毒性用MTT实验评估。5×10⁴个细胞/孔接种到一个平底的96孔组织培养板。37℃孵育18h让细胞吸附。然后弃去培养基再补充100微升DMEM含不同浓度的化合物11e从32微摩尔到10000微摩尔，在37℃5％二氧化碳空气中孵育24h。对于MTT实验，用来评估线粒体存活力。加20微升MTT溶液(5mg/mL)，平板再孵育4h。孵育过后，上清液小心地从孔中弃去，然后加150微升DMSO完全混匀。在570纳米和630纳米(背景)的光密度用ELISA阅读器检测。细胞活力表示为对照的吸光度，从一个适当的背景减去吸收后在未处理细胞中得到的百分比。最后得到50％细胞(MLD₅₀)死亡的最小致死剂量。
抑制剂的给药时间研究。
将MDCK细胞(1.2×10⁵个细胞/孔)接种到12孔组织培养平板孵育48h。孵育1h让病毒(100PFU)感染细胞。吸附病毒后，病毒悬浮液弃去，MDCK细胞用DMEM洗涤，然后补充新鲜的病毒培养基(DMEM含1％抗生素和1‰TPCK-trypsin)。加入含有测试的化合物测试培养基溶液在-2to0h(吸附),0-2,1-3,2-4,4-6,6-8和18-20 h的不同时期。每个孵育阶段后，单层用DMEM洗涤后和新鲜的病毒培养基孵育。24h后，收集上清测病毒产率。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。