流感病毒抑制剂及其应用.pdf

1、10申请公布号CN104193728A43申请公布日20141210CN104193728A21申请号201410424614222申请日20140826C07D401/12200601C07D215/233200601C07D215/36200601C07D215/44200601C07D211/54200601A61K31/4709200601A61P31/1620060171申请人北京大学深圳研究生院地址518055广东省深圳市南山区丽水路深圳大学城北大校区72发明人王国新74专利代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司44224代理人生启54发明名称流感病毒抑制剂及其应用57摘要本发明

2、公开了一种流感病毒抑制剂及其应用，流感病毒抑制剂包括化学式表示的化合物或其药学上可接受的盐，化学式如下所示其中，X为N或CH，Y为NH、NR2、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R1为H、F、CL、BR、I、C1C4的烷基或C1C4的烷氧基，R2为C1C6的烷基。这种流感病毒抑制剂具有上述化学式，不同于NAIS，同时根据具体实施例中的实验数据可以看出，这种流感病毒抑制剂具有抗流感病毒活性。这种新型流感病毒抑制剂不仅可能被有效的用于治疗对NAI产生耐药型的流感病毒，或者可以和NAIS一起的联合使用来有效地预防和治疗流感。51INTCL权利要求书2页说明书26页附图2页19中华人民共和国国

3、家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书26页附图2页10申请公布号CN104193728ACN104193728A1/2页21一种流感病毒抑制剂，包括化学式表示的化合物或其药学上可接受的盐，化学式如下所示其中，X为N或CH，Y为NH、NR2、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R1为H、F、CL、BR、I、C1C4的烷基或C1C4的烷氧基，R2为C1C6的烷基。2如权利要求1所述的流感病毒抑制剂，其特征在于，X为N，Y为NH、NR2、S或O，Z为N，W为O。3如权利要求1或2所述的流感病毒抑制剂，其特征在于，R1为H，R2为叔丁基。4一种流感病毒抑制剂组合物，其特征在于，包括化

4、学式表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体；化学式如下所示其中，X为N或CH，Y为NH、NR2、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R1为H、F、CL、BR、I、C1C4的烷基或C1C4的烷氧基，R2为C1C6的烷基。5如权利要求4所述的流感病毒抑制剂组合物，其特征在于，X为N，Y为NH、NR2、S或O，Z为N，W为O。6如权利要求4或5所述的流感病毒抑制剂组合物，其特征在于，R1为H，R2为叔丁基。7一种流感病毒抑制剂组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤将化学式表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，一起配制；化学式如下所示权利要求书CN104

5、193728A2/2页3其中，X为N或CH，Y为NH、NR2、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R1为H、F、CL、BR、I、C1C4的烷基或C1C4的烷氧基，R2为C1C6的烷基。权利要求书CN104193728A1/26页4流感病毒抑制剂及其应用【技术领域】0001本发明涉及流感病毒治疗领域，尤其涉及一种流感病毒抑制剂及其应用。【背景技术】0002早在2009猪流感病毒AH1N1的出现再一次给了一个警示流感病毒的新菌株可能在一个意想不到的时刻在全世界传播，12在2011被鸟类流感病毒感染的病人又在中国的香港和深圳被鉴定。3后来2013年三月，一种新型的禽流感病毒AH7N9类在中国被

6、发现。4因此流感病毒的预防和治疗对于保护公共健康具有重要意义。0003控制新发流感病毒株的最有效的方法是使用抗流感病毒的药物，因为安全有效的疫苗需要数月的时间才能被开发出来，这将导致疫苗滞后于流感病毒的传播。目前，市场上主流的治疗流感病毒感染的药物是神经氨酸苷酶抑制剂NAIS，例如奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦。59NAIS结合到神经氨酸苷酶的活性位点，这是A型和B型流感病毒的主要表面抗原，然后抑制新产生的流感病毒从感染细胞中释放。1011然而，神经氨酸苷酶活性位点发生突变可能削弱NAIS和神经氨酸酶的结合能力。其中一个突变相当频繁的位点是神经氨酸酶第274位的组氨酸。1215当第274位组氨酸

7、突变为酪氨酸或者其他的氨基酸时，NAIS不再紧密结合到神经氨酸苷酶，所以突变的流感病毒产生耐药性。由于耐药性流感病毒的频繁出现，现有的NAI药物因为长期的使用而导致部分流感病毒对其产生耐药性，因此必须开发新型的流感病毒抑制剂来预防和治疗流感在人类中传播。0004涉及的文献资料如下00051、GJDSMITH,DVIJAYKRISHN,JBAHL,SJLYCETT,MWOROBEY,OGPYBUS,SKMA,CLCHEUNG,JRAGHWANI,SBHATT,JSMPEIRIS,YGUANANDARAMBAUT,NATURE2009,459,112200062、KNALLUSWAMI,ANAMB

8、IA,LPERRIANNE,MMOLL,JLUTEANDOSIMWALE,MMWR,MORBIDITYMORTALITYWKLYREP2011,60,121300073、GLOBALANIMALEPIDEMICSITUATIONREVIEWIN2011CHINAJOURNALOFANIMALQUARANTINE2011,2812,8200084、RGAO,BCAOANDYHU,NENGLJMED2013,368,188800095、FHAYDEN,CLININFECTDIS2009,48SUPPL1,S300106、IMLAGOJA,EDECLERCQ,MEDRESREV2008,28,100

9、117、MVONITZSTEIN,NATREVDRUGDISCOVERY2007,6,96700128、HPHSIEHANDJTHSU,CURRPHARMDES2007,13,353100139、EDECLERCQE,NATREVDRUGDISCOVERY2006,5,1015001410、PPALESEANDRWCOMPANS,THEJOURNALOFGENERALVIROLOGY1976,33,159001511、CLIU,MCEICHELBERGER,RWCOMPANSANDGMAIR,JOURNALOFVIROLOGY1995,69,1099说明书CN104193728A2/26页50

10、01612、LVGUBAREVA,LKAISER,MNMATROSOVICH,YSOOHOOANDFGHAYDEN,JINFECTDIS2001,183,523001713、AMOSCONA,NENGLJMED2009,360,953001814、FCARRATANDAFLAHAULT,VACCINE2007,25,6852001915、JTREANOR,NENGLJMED2004,350,218【发明内容】0020基于此，有必要提供一种不同于NAIS的流感病毒抑制剂及其应用。0021一种流感病毒抑制剂，包括化学式表示的化合物或其药学上可接受的盐，化学式如下所示00220023其中，X为N或C

11、H，Y为NH、NR2、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R1为H、F、CL、BR、I、C1C4的烷基或C1C4的烷氧基，R2为C1C6的烷基。0024在一个实施例中，X为N，Y为NH、NR2、S或O，Z为N，W为O。0025在一个实施例中，R1为H，R2为叔丁基。0026一种流感病毒抑制剂组合物，包括0027化学式表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及0028药学上可接受的载体；0029化学式如下所示00300031其中，X为N或CH，Y为NH、NR2、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R1为H、F、CL、BR、I、C1C4的烷基或C1C4的烷氧基，R2为C1C6的烷基。003

12、2在一个实施例中，X为N，Y为NH、NR2、S或O，Z为N，W为O。0033在一个实施例中，R1为H，R2为叔丁基。0034一种流感病毒抑制剂组合物的制备方法，包括如下步骤将化学式表示的化合说明书CN104193728A3/26页6物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，一起配制；0035化学式如下所示00360037其中，X为N或CH，Y为NH、NR2、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R1为H、F、CL、BR、I、C1C4的烷基或C1C4的烷氧基，R2为C1C6的烷基。0038这种流感病毒抑制剂具有上述化学式，不同于NAIS，同时根据具体实施例中的实验数据可以看出，这种流感

13、病毒抑制剂具有抗流感病毒活性。0039这种流感病毒抑制剂可能被有效的用于治疗NAI抗性流感病毒或者被包括到和NAIS一起的联合治疗中去降低药物抗性流感病毒出现的几率。【附图说明】0040图1为注入流感病毒和抑制剂的96孔板培养48小时后的照片；0041图2为对P114F5进行EC50值测定得到的EC50柱状图；0042图3为P114F5的结构优化图；0043图4为对化合物11E进行EC50值测定得到的EC50柱状图。【具体实施方式】0044由于目前的抗流感病毒的药物主要是神经氨酸苷酶抑制剂NAIS，而NAIS的效用可能因为流感病毒神经氨酸苷酶活性位点发生突变而被削弱，当流感病毒突变后会对现有N

14、AIS药物产生耐药性，从而导致治疗流感失败。0045基于此，有必要提供一种不同于NAIS的流感病毒抑制剂。0046通过对含有10000个小分子化合物的商业化小分子化合物库MYRIASCREENLIBRARY，来自SIGMAALDRICH公司进行高通量抗流感病毒活性筛选，发现了一类哌啶基衍生物具有抗流感病毒活性。0047而此前并无此类化合物的抗流感病毒活性的任何记录，此类小分子化合物作为流感病毒抑制剂，具有广泛的应用前景。0048基于此，提供上述化合物作为流感病毒抑制剂，该化合物包括化学式表示的化合物或其药学上可接受的盐。0049化学式如下所示0050说明书CN104193728A4/26页70

15、051其中，X为N或CH，Y为NH、NR2、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R1为H、F、CL、BR、I、C1C4的烷基或C1C4的烷氧基，R2为C1C6的烷基。0052优选的，X为N，Y为NH、NR2、S或O，Z为N，W为O。0053优选的，R1为H，R2为叔丁基。0054特别的，结构如化学式所示的化合物，具有特别高的抗流感病毒活性。0055化学式如下所示00560057此外，还提供一种流感病毒抑制剂组合物，包括0058化学式表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及0059药学上可接受的载体；0060化学式如下所示00610062其中，X为N或CH，Y为NH、NR2、S或O，Z为N或

16、CH，W为O、NH或省略，R1为H、F、CL、BR、I、C1C4的烷基或C1C4的烷氧基，R2为C1C6的烷基。0063药学上可接受的载体，包括但不限于稀释剂和填充剂，选自赋形剂，例如碳酸钙、高岭土、碳酸氢钠、乳糖、D甘露醇、淀粉、结晶纤维素、滑石、精细研磨的糖和多孔物质；粘合剂，例如糊精、树胶、淀粉、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和茁霉多糖PULLULAN；增稠剂，例如天然树胶、纤维素衍生物、丙烯酸衍生物；崩解剂，例如羧甲说明书CN104193728A5/26页8基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代的羟丙基纤维素和部分预胶化淀粉；溶剂，例如注射用水、醇、丙二醇、聚

17、乙二醇、芝麻油和玉米油；分散剂，例如吐温80、HC060、聚乙二醇、羧甲基纤维素和海藻酸钠；增溶剂，例如聚乙二醇、丙二醇、D甘露醇、苯甲酸节基酯BENZOICACIDBENZYL、乙醇、三氨基甲烷、三乙醇胺、碳酸钠和柠檬酸钠；悬浮剂，例如硬脂基三乙醇胺、月桂基硫酸钠、苯扎氯铵、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素；安慰剂，例如苄醇；等渗剂，例如氯化钠和甘油；缓冲剂，例如磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐和柠檬酸盐；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、淀粉和苯甲酸钠；着色剂，例如焦油颜料、焦糖、氧化铁、二氧化钛和核黄素；矫味剂，例如甜味剂和香料；稳定剂，例如亚硫酸钠和抗坏血酸；以及防腐剂，例如对羟基苯甲

18、酸酯和山梨酸。0064优选的，X为N，Y为NH、NR2、S或O，Z为N，W为O。0065优选的，R1为H，R2为叔丁基。0066一实施方式的流感病毒抑制剂组合物的制备方法，包括如下步骤将化学式表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，一起配制；0067化学式如下所示00680069其中，X为N或CH，Y为NH、NR2、S或O，Z为N或CH，W为O、NH或省略，R1为H、F、CL、BR、I、C1C4的烷基或C1C4的烷氧基，R2为C1C6的烷基。0070优选的，X为N，Y为NH、NR2、S或O，Z为N，W为O。0071优选的，R1为H，R2为叔丁基。0072特别的，一种流感病毒抑

19、制剂组合物，包括化学式表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及0073药学上可接受的载体；0074化学式如下所示00750076上述流感病毒抑制剂组合物的制备方法，包括如下步骤将化学式表示的化说明书CN104193728A6/26页9合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，一起配制；0077化学式如下所示00780079以下为具体实施例部分。0080在具体实施例中，将详细描述本发明的具体筛选方案，以及筛选到的化合物的抗流感病毒活性试验。0081实施例10082先导化合物P114F5的筛选。0083为了筛选出新型流感病毒抑制剂，建立一种基于细胞水平的流感病毒抑制剂高通量筛选方法。0084

20、具体的实施方案是将从中国菌种保藏中心CHINACENTERFORTYPECULTURECOLLECTION获得的MDCK细胞用96孔板在37、5CO2条件下培养24个小时。当细胞密度达到90时，每个孔内注入300PDU的流感病毒A/UDORN/72H3N2。病毒感染48小时后，将细胞固定染色，得到图1。0085如图1所示，孔A1D1未感染作为细胞对阳性照组1，孔E1H1感染流感病毒接种液做为阴性对照组。病毒唑50M，1DMSO加在孔A12D12作为阳性对照2，以及膜融合抑制剂F136参考专利WO2011160024制备加在孔E12H12，选来做为阳性对照组3。0086F136的结构式为0087

21、在病毒接种到细胞1个小时后，化合物库的化合物加入到培养基至终浓度为100G/ML。利用这种高通量筛选方法，从10000种化合物中发现一种可能的哌啶衍生物，4喹啉4基硫代哌啶1甲酸叔丁酯ETHYL4QUINOLIN4YLTHIOPIPERIDINE1CARBOXYLATE，记为P114F5。0088P114F5的结构式为说明书CN104193728A7/26页100089对P114F5进行EC50值测定得到图2，图2显示P114F5的EC50数值为139M。文献检索没有检测到有文章报道这类药物可以作为抗病毒药剂。0090实施例20091先导化合物P114F5的结构优化。0092为了获得更多的P1

22、14F5作用机制信息，系统地改变了P114F5的化学结构来探索以P114F5作为结构基础时对抗流感活性的作用。0093为了研究P114F5的构效关系SAR，如图3所示，P114F5可以被分割为4个亚基亚基A喹啉组分，亚基BS组分，亚基C哌啶组分和亚基D氨基甲酸酯组分。0094为了测试亚基A喹啉组分对于抗病毒活性的影响，将P114F5中的喹啉组分进行替换，并且对替换得到的化合物分别进行EC50值测定，具体测试方法和病毒参照实施例1，测得EC50如下表1所示。0095说明书CN104193728A108/26页110096表1P114F5的亚基A进行替换得到的化合物的EC50测量结果。0097其中

23、，化合物1AI是通过亲核取代一个环化化合物为硫醇化合物对应于化合物说明书CN104193728A119/26页121AILSAVINI,AGAETA,CFATTORUSSO,BCATALANOTTI,GCAMPIANI,LCHIASSERINI,CPELLERANO,ENOVELLINO,DMCKISSICANDASAXENA,JMEDCHEM2003,46,1。0098特别的，化合物1AC和化合物1GI还可以直接来自商业化高产率4氢氯酸化合物通过在DMF中加略多于一倍氢化钠50处理获得。其中，乙基4硫醇基1羧酸叔丁酯ETHYL4MERCAPTOPIPERIDINE1CARBOXYLATE的制

24、备参照专利WO2007030366。0099此外，商用苯硫酚或者2萘硫醇衍生物与镇静剂化合物一起在氢化钠中处理也可以得到化合物1DF。其中，乙基4溴哌啶基1羧酸叔丁酯ETHYL4BROMOPIPERIDINE1CARBOXYLATE的制备参照专利WO2003062224。0100由表1可以看出，亚基A的改变对化合物的抗病毒活性影响是有很大差异的，如包含喹啉组分的化合物1AC和包含香豆素环组分的化合物1GI的抗病毒活性并没有得到显著的改善，它们的EC50值都在100微摩尔以上。而用苯环和萘环做为亚基A的化合物11DF的抗病毒活性和P114F5的活性相当。这些结果表明，改变亚基A并不能显著的改善化

25、合物的抗病毒活性，这也意味着亚基A的选择具有多样性。0101实施例30102先导化合物P114F5的结构优化，亚基BS组分的替换。0103为了测试亚基B对于抗病毒活性的影响，将P114F5中的S组分进行替换，并且对替换得到的化合物分别进行EC50值测定，具体测试方法和病毒参照实施例1，测得EC50如下表2所示。01040105表2P114F5的亚基B进行替换得到的化合物的EC50测量结果。0106乙基4氨基哌啶1甲酸叔丁酯ETHYL4AMINOPIPERIDINE1CARBOXYLATE的制备参照“BMIRIYALA,SBHATTACHARYYAANDJSWILLIAMSON,TETRAHED

26、RON2004,60,1463”，其中的S分别被O和NH代替。0107化合物6AB的合成和化合物1AI类似，4氯代喹啉被氧或者氨基亲核取代到对应化合物中6AB。说明书CN104193728A1210/26页130108从表格2中可以看出，用O作为亚基B的化合物6A的抗病毒活性要比P114F5的活性提高6倍，而用NH作为亚基B的化合物6B的几乎没有任何抗病毒活性。这实验结果表明，用O作为亚基B是对于显著改善抑制剂的抗病毒活性是至关重要的。0109实施例40110先导化合物P114F5的结构优化，亚基C哌啶基组分的替换。0111为了测试亚基C对于抗病毒活性的影响，将P114F5中的哌啶基组分进行替

27、换，同时，也将P114F5中的亚基B进行替换，并且对替换得到的化合物分别进行EC50值测定，具体测试方法和病毒参照实施例1，测得EC50如下表3所示。0112说明书CN104193728A1311/26页140113表3P114F5的亚基B和亚基C进行替换得到的化合物的EC50测量结果。0114化合物8AF的合成与化合物1AI相似，通过亲核取代反应得到。0115由表格3可以看出，化合物8AF的活性差别很大。用苯基替代哌啶基组分将导致抑制活性的降低，无论是用S，NH或者O做为亚基B，例如化合物8AC。然而，环己烷组分替换哌啶组分的化合物表现了很好的抑制活性，EC50值从10M到36M，例如化合物

28、8DF。这些结果表明，用非刚性环系做为亚基C是非常重要的，可能的原因是抑制剂在和说明书CN104193728A1412/26页15受体相互作用时，非刚性的环系可以通过改变其构象来增加和受体的相互作用，从而展现抗病毒活性。0116实施例50117先导化合物P114F5的结构优化，亚基D氨基甲酸酯组分的替换。0118为了测试亚基D氨基甲酸酯组分对于抗病毒活性的影响，将P114F5中的氨基甲酸酯组分进行替换，并且对替换得到的化合物分别进行EC50值测定，具体测试方法和病毒参照实施例1，测得EC50如下表4所示。0119说明书CN104193728A1513/26页160120表4P114F5的亚基D

29、进行替换得到的化合物的EC50测量结果。0121化合物11AJ能够通过如下合成路线合成用4氯代喹啉和叔丁基4硫醇说明书CN104193728A1614/26页17基1甲酸乙酯TERTBUTYL4MERCAPTOPIPERIDINE1CARBOXYLATE或者叔丁基4羟基哌1甲酸乙酯TERTBUTYL4HYDROXYPIPERIDINE1CARBOXYLATE可以很容易获得化合物11BC，接着用TFA处理得到11GH，然后用N,NCARBONYLDIIMIDAZOLECDI处理，添加ROH得到11CF。012211IJ的合成是通过4氯代喹啉和四氢呋喃3醇TETRAHYDROFURAN3OL或者四

30、氢2H吡喃4醇TETRAHYDRO2HPYRAN4OL进行亲核取代反应获得的JKONG,CYCHEN,JBALSELLSPADROS,YCAO,RFDUNN,SJDOLMAN,JJANEY,HLIANDMJZACUTO,JORGCHEM2012,77,3820MEJUNG,GDENG,JORGCHEM2012,77,11002。0123表4可以看出，对于用S为亚基B的化合物11AC，和P114F5相比，改变亚基D氨基甲酸酯组分的烷基并不能显著改善它们的抗病毒活性。然而，对于用O为亚基B的化合物11DF，氨基甲酸酯组分上烷基的改变能够显著的改善化合物的抗病毒活性，它们的抗病毒活性在10M左右。特

31、别是用叔丁基为烷基的化合物11E，它的抗病毒活性是P114F5的100倍。而对于去掉氨基甲酸酯组分没有亚基D的化合物11GJ，它们的抗病毒活性显著下降，甚至失去抗病毒活性。这些研究结果清晰表明，用氨基甲酸酯组分作为亚基D对于化合物展现抗病毒活性是非常重要的。一个可能的原因是CARBAMATE能通过氢键作用和受体产生专一性的相互作用。而用空间位阻大的烷基，如叔丁基，作为在氨基甲酸酯的烷基可能在抑制剂与靶点作用时形成紧密结合。0124实施例60125抑制剂的细胞毒性研究。0126为了排除观察到的抗流感活性不是由于抑制剂的细胞毒性产生，抑制剂在三个细胞系中，如狗肾传代细胞细胞MDCK,人胚肾细胞HE

32、K293CELLS和人类上皮癌细胞HELACELLS，用MTT实验验证了最有效的抑制剂化合物11EJAN,DCWLEE,AHYLAW,CLHYANG,LLMPOON,ASYLAUANDSJMJONES,JMEDCHEM2009,52,2667，结果如下表5所示。01270128表5化合物11E的MTT实验结果。0129由表5可以看出，化合物11E在任何细胞系中都不具有细胞毒性，甚至浓度上升到MM范围，选择指数值SIMLD50/EC50超过160,000。这些结果表明哌啶衍生物的极好的抗流感病毒活性并不是非特异性细胞毒素作用。0130实施例70131流感病毒抑制剂对不同流感病毒株的抗病毒活性研究

33、。0132一个好的抗流感药物应当对于不同流感病毒菌株都具有极好的抑制活性。在对于说明书CN104193728A1715/26页18流感病毒A/UDORN/72H3N2的抗性评估之后，检测了最优化合物11E对其他流感病毒株的抗病毒活性。为此，选择流感病毒A的4个病毒株两株H3N2和两株H1N1株和一株流感病毒B分别进行EC50值测定，以化合物P114F5为对照，具体测试方法测试参照实施例1，测得EC50如下表6所示。01330134表6化合物11E与不同流感病毒进行EC50值测定得到的EC50测量结果。0135由表6可以看出，化合物11E有效抑制所有检测的流感病毒株，化合物11E的EC50值可以

34、低到005M。0136这些结果表明化合物11E是一个潜在的广谱性抗流感病毒抑制剂。0137实施例80138抑制剂的给药时间实验研究。0139为了确定哌啶类抑制剂能够有效的抑制流感病毒感染的哪一步，需要先完成一个病毒单程生长曲线，以便确定在病毒生长周期哪个时间点加入抑制剂能够更有效的效果。在目前阶段，已经获得了活性得到显著改善的化合物11E，其EC50值达到了010M。为此，用DMSO溶解化合物11E，并用生长液稀释至终浓度为10M且含1的DMSO。把抑制剂加入到病毒液流感病毒A/UDORN/72，H3N2或者细胞生长液中，2小时意味着病毒液和抑制剂在接种到单层MDCK细胞之前先在37作用1小时

35、。在其他的时间点，抑制剂在感染后指定的时间内加入到生长液中并达到使用终浓度。同时设立病毒对照。病毒液在37，单层MDCK细胞上吸附1H。然后加入生长液，使病毒感染持续18H。在感染结束后，用蚀斑方法测定每个时间点的病毒滴度，并分析病毒生长曲线和抑制剂加入后的时间之间的关系JYYEH,MSCOUMAR,JTHORNG,HYSHIAO,FMKUO,HLLEE,ICCHEN,CWCHANG,WFTANG,SNTSENG,CJCHEN,SRSHIH,JTAHSU,CCLIAO,YSCHAOANDHPHSIEH,JMEDCHEM2010,53,1519，测试结果如图4所示。0140由图4可以看出，在感染

36、后6小时内，化合物11E都能显著的抑制病毒的增值。这一结果证明化合物11E在病毒感染的早期阶段能较好的抑制病毒增值。0141然而，化合物11E没有显示明显的流感病毒感染抑制性当和在感染之前接种的病毒孵育，相反这是用做对照的融合抑制剂。这项研究表明化合物11E可用于流感病毒复制周期的早期，包括进入或早期的复制阶段。0142综上所述，通过化学优化导致发现优化的化合物11E，具有更高的潜力抑制流感病毒复制，化合物11E具有优异的抑制能力EC50010M。说明书CN104193728A1816/26页190143化合物11E在体外能抑制流感病毒A型和B型菌株活性，并且它对不同的流感病毒株也表现出很好的

37、抗病毒活性，此外，这类化合物的细胞毒性也很低，选择性指数也超过160,000。这些结果表明这类哌啶类化合物可以作为新型流感病毒抑制剂进行进一步研发。0144化合物11E的初步研究机理表明这种类型的哌啶基衍生物干扰流感病毒复制的早期阶段，与化合物11E相互作用的精确靶标还有待发现。这里鉴定的优化先导化合物可以为抗流感药物研发开拓新的机遇。0145以下为附录。附录中对本申请中用到的各种检测方法以及筛选得到的部分化合物的合成方法进行简单介绍。0146化学合成部分。0147除非特别说明，本发明中提及的原材料都是从百灵威化学有限公司或者西格玛奥德里奇化学公司购买。无水THF和二恶烷由钠二苯甲酮蒸馏而来，

38、二氯甲烷由氢化钙蒸馏而来。水是通过MILLIQ水系统MILLIPORE公司,贝德福德,马萨诸塞州蒸馏净化，所有反应都是在氮气氛围，无水的干燥剂条件下实施，除非有特别的备注。反应用薄层色谱法TCL检测，用025毫米的岛津硅胶板60F254，紫外灯作为显影剂，磷钼酸和高锰酸钾的乙醇溶液，加热为展开剂。岛津硅胶60,粒径大小00400063毫米被用做快速柱色谱法去纯化药物。收益率指色谱和光谱1HNMR均质材料，除非特别声明。熔点是用SGWX4B显微熔点仪测量的未修正。所有的化合物用布鲁克300MHZ核磁共振或者400MHZ的核磁共振波谱仪标记上1H和13C。化学位移以PPM被记录相对于在对应的谱的残

39、留溶剂峰。三氯甲烷726和775,二甲基亚砜D6254和395。耦合常数J用赫兹HZ记录其中,SSINGLET,BBROAD,DDOUBLET,DDDOUBLEDOUBLET,BDBROADDOUBLET,DDDDOUBLEDOUBLETOFDUBLET,TTRIPLET,DTDOUBLETRIPLET,QQUARTET,MMULTIPLET，并用ADCACD核磁共振数据处理软件分析。高分辨率质谱拍摄用布鲁克APEXIVRTMS的电喷雾离子化技ESI术。质谱值报告为M/Z。0148化合物1AC和化合物1GI的制备除气的4乙基1巯基哌啶羧化物227毫克,120毫摩尔溶液在5毫升无水DMF中0加入

40、氢化钠60在矿物油中，48毫克，120毫摩尔。这个悬浮液再在室温下搅拌15分钟。然后，商业化的4氯喹啉衍生物2AC或者其他芳香环的化合物2GI100毫摩尔溶液在5毫升无水DMF中加入上述的悬浮液，这种混合物再在50搅拌直到芳香环化合物消失。这个反应混合物再倒入冰水中并用乙酸乙酯萃取，硫酸镁干燥，然后浓缩。残渣再用快速色谱二氧化硅，乙酸乙酯/己烷作为洗脱液纯化得到的主要化合物1AE和化合物1GI有6085的产率。01491DF的准备除气的苯硫酚溶液或者1巯基萘衍生物120毫摩尔在5毫升除气的DMF中0加入氢化钠60在矿物油中，48毫克，120毫摩尔。这个悬浮液再在室温下搅拌15分钟。然后，商业化

41、的4乙基1溴哌啶羧化物4236毫克,100毫摩尔溶液在5毫升无水DMF中加入上述的悬浮液，这种混合物再在50搅拌5H直到4消失。这个反应混合物再倒入冰水中并用乙酸乙酯萃取，硫酸镁干燥，然后浓缩。残渣再用快速色谱二氧化硅，乙酸乙酯/己烷作为洗脱液纯化得到的主要化合物1DF有7590的产率。0150化合物1AI的制备流程如下，反应条件为NAH,DMF,50,5H,产率为60850151说明书CN104193728A1917/26页200152化合物1A由4氯2苯基喹啉4CHLORO2PHENYLQUINOLINE和叔丁基4硫醇基1甲酸乙酯TERTBUTYL4MERCAPTOPIPERIDINE1C

42、ARBOXYLATE制得，产率为65，产物为淡黄色固体，产物熔点为110112。1HNMR300MHZ,CDCL3822DD,J84,30,2H,ARH,811J84,18,2H,ARH,778S,1H,ARH,773T,J69,1H,ARH,756747M,4H,ARH,412Q,J60,2H,OCH2,409400M,2H,NCH2,366362M,1H,SCH,320311M,2H,NCH2,213210M,2H,NCH2CH2,178172M,2H,NCH2CH2,126T,J69,3H,OCH2CH313CNMR755MHZ,CDCL315648,15533,14796,14514,

43、13946,13026,13004,12944,12887,12752,12653,12636,12396,11774,6144,4297,4230,3190,1464HRMSESIC23H25N2O2SMH计算值为3931637,实测值为3931630。0153化合物1B由2,4二氯喹啉2,4DICHLOROQUINOLINE和乙基4硫醇基1羧酸叔丁酯ETHYL4MERCAPTOPIPERIDINE1CARBOXYLATE制得，产率为60，产物为类白色固体，产物熔点为98100。1HNMR300MHZ,CDCL3814DD,J75,30,1H,ARH,792D,J81,1H,ARH,773D

44、T,J69,15,1H,ARH,753DT,J81,12,1H,ARH,730S,1H,ARH,432426M,1H,SCH,415Q,J70,2H,OCH2,410390M,2H,NCH2,327318M,1H,NCH2,297289M,1H,NCH2CH2,220214M,1H,NCH2CH2,202196M,1H,NCH2CH2,180156M,1H,NCH2CH2,126T,J70,3H,OCH2CH313CNMR755MHZ,CDCL315892,15501,15497,14861,14141,13171,12843,12728,12418,12373,12094,6118,4347

45、,3633,3542,3175,2114,1496HRMSESIC17H19N2O2NASCLMNA计算值为3730753,实测值为3730746。0154化合物1C由4氯吡啶4CHLOROPYRIDINE和乙基4硫醇基1羧酸叔丁酯ETHYL4MERCAPTOPIPERIDINE1CARBOXYLATE制备得到，产率为85，产物为灰色固体，产物熔点为8890。1HNMR300MHZ,DMSOD6862D,J66,2H,ARH,790D,J66,2H,ARH,406399M,3H,OCH2ANDSCH,392387M,2H,NCH2,315307M,2H,NCH2,205200M,2H,NCH2

46、CH2,156151M,2H,NCH2CH2,117T,J69,3H,OCH2CH313CNMR755MHZ,DMSOD616139,15488,14032,12297,6122,4311,4073,3117,1498HRMSESIC13H19N2O2SMH计算值为2671167,实测值为说明书CN104193728A2018/26页212671161。0155化合物1D由4甲基苯硫4METHYLBENZENETHIOL和乙基4溴哌啶基1羧酸叔丁酯ETHYL4BROMOPIPERIDINE1CARBOXYLATE制备得到，产率为75，产物为淡黄色固体，产物熔点为8285。1HNMR300MHZ

47、,DMSOD6734D,J81,2H,ARH,712D,J81,2H,ARH,412Q,J72,2H,OCH2,403399M,2H,NCH2,315310M,1H,SCH,299290M,2H,NCH2,234S,3H,ARCH3,194188M,2H,NCH2CH2,158149M,2H,NCH2CH2,125T,J72,3H,OCH2CH313CNMR755MHZ,DMSOD615489,13715,13260,13007,6107,4359,4320,3214,2093,1485HRMSESIC15H22NO2SMH计算值为,实测值为2801367。0156化合物1E由4甲氧基苯4ME

48、THOXYBENZENETHIOL和乙基4溴哌啶基1羧酸叔丁酯ETHYL4BROMOPIPERIDINE1CARBOXYLATE制备得到，产率为80，产物为淡黄色固体，熔点为9092。1HNMR300MHZ,CDCL3739D,J90,2H,ARH,684D,J90,2H,ARH,410Q,J72,2H,OCH2,404395M,2H,NCH2,380S,3H,OCH3,305296M,1H,SCH,296286M,2H,NCH2,190184M,2H,NCH2CH2,153141M,2H,NCH2CH2,123T,J70,3H,OCH2CH313CNMR755MHZ,DMSOD615956,

49、15493,13567,12343,11504,6110,5555,4444,4325,3215,1489HRMSESIC15H22NO3SMH计算值为2961320，实测值为2961309。0157化合物1F由萘1硫醇NAPHTHALENE1THIOL和乙基4溴哌啶基1羧酸叔丁酯ETHYL4BROMOPIPERIDINE1CARBOXYLATE制备得到，产率为78，产物为淡黄色固体，产物熔点为9597。1HNMR300MHZ,CDCL3854DD,J69,12,1H,ARH,789782M,2H,ARH,775DD,J80,12,1H,ARH,742DD,J84,12,1H,ARH,412Q,J72,2H,OCH2,403399M,2H,NCH2,328321M,1H,SCH,298289M,2H,NCH2,193188M,2H,NCH2CH2,162158M,2H,NCH2CH2,126T,J72,3H,OCH2CH313CNMR755MHZ,DMSOD61