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1、(10)授权公告号 CN 102119958 B (45)授权公告日 2014.10.29 CN 102119958 B (21)申请号 201010300175.6 (22)申请日 2010.01.11 A61K 36/481(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 31/4375(2006.01) A61K 33/36(2006.01) (73)专利权人 李红玉 地址 730000 甘肃省兰州市城关区天水路 222 号 (72)发明人 李红玉 刘东玲 支德娟 CN 1650996 A,2005.08.10, CN 1839880 A,2006.10.04, CN。
2、 101120950 A,2008.02.13, (54) 发明名称 一种含雄黄的药物组合物 (57) 摘要 本发明提供一种含雄黄的药物组合物， 具体 地讲该药物组合物含有雄黄微生物浸出液以及人 参提取物、 黄芪提取物和苦参素， 动物实验表明该 药物组合物对原癌基因 Ras 通路的过度激活具有 明显的下调作用， 且毒性低， 该药物组合物适于在 制备抗肿瘤药物中应用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 都薇 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 (10)授权公告号 CN 102119958 B CN。
3、 102119958 B 1/1 页 2 1. 一种含雄黄的药物组合物， 其特征在于该药物组合物含有雄黄溶解液， 人参提 取物， 黄芪提取物， 苦参素溶液， 以体积比计算， 雄黄溶解液 2.5 -40， 人参提取物 0.8 -20.0， 黄芪提取物 0.8 -20.0， 苦参素溶液 0.8 -20.0， 余量用药学上接受 的缓冲液补足 ； 砷在雄黄溶解液中不低于 32g/ml， 在人参提取物中， 人参提取物按生药 量计不低于 6.75mg/ml， 其中人参皂苷 Rg1 含量不少于 0.08， 人参皂苷 Re 的含量不少 于 0.67， 人参皂苷 Rb1 的含量不少于 0.90 ； 在黄芪提取物。
4、中， 黄芪提取物按生药量计 不低于 25mg/ml， 其中黄芪甲苷含量不少于 0.1 ； 苦参素在苦参素溶液中不低于 250g/ ml。 2. 根据权利要求 1 所述的含雄黄的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102119958 B 2 1/6 页 3 一种含雄黄的药物组合物 技术领域 0001 本发明提供一种含雄黄的药物组合物， 具体地讲该药物组合物含有雄黄溶解液， 人参提取物， 黄芪提取物和苦参素， 属抗肿瘤药物领域。 背景技术 0002 2000年9月美国FDA批准了将As2O3注射液用于治疗难治、 复发急性早幼粒细胞白 血病。 国内外研究表明， 砷剂不但对。
5、血液系统肿瘤有显著的效果， 而且还可应用于治疗其它 恶性实体瘤。 因而， 砷制剂治疗癌症引起人们更多的关注， 含砷制剂的开发和应用成为了一 个抗肿瘤药物研究的热点， 但无论是 As2O3注射液还是其它含砷制剂都存在毒性大的通病。 0003 作为含砷的矿物药雄黄， 其主要成分为 As2S2( 或 As4S4)， 在临床上已成功地用于 治疗慢性和急性早幼粒细胞白血病 (International Journal of Hematology 2002 ： 76 ： 316-318)， 因而， 雄黄的抗肿瘤作用备受国内外相关学者的关注。但是， 雄黄作为一种含砷 矿物药， 同样存在毒性高的问题， 同时由。
6、于雄黄又是一种极其难溶的矿物药， 还存在生物利 用度低等问题， 制约了它在临床上的应用。 0004 中国发明专利 2006102000675 记载了利用细菌对雄黄进行溶解的方法， 雄黄溶解 后可释放出可溶性的砷， 并含有 Zn、 Cu、 Mg、 Mn、 Fe、 Se 等与人体健康密切相关的微量元素， 相对于传统雄黄， 雄黄溶解液对肿瘤治疗具有生物利用度高、 用量少， 毒性降低， 疗效显著 的特性。 0005 但雄黄溶解液的药效仍有进一步提升的可能， 毒性也仍有进一步降低的空间。 0006 因此， 我们设计了含有雄黄溶解液的药物组合物， 以期达到对雄黄溶解液进行减 毒或增效作用。 发明内容 00。
7、07 本发明提供了一种雄黄药物组合物， 该药物组合物含有雄黄溶解液， 人参提取物， 黄芪提取物， 苦参素。 0008 该组合物含以下成分 ： 以体积比计算， 雄黄溶解液 2.5 -40.0， 人参提取物 0.8 -20.0， 黄芪提取物 0.8 -20.0， 苦参素 0.8 -20.0。此外， 可以在组方中加 入药学上可以接受的盐或缓冲， 这是同领域人员可以理解的。 0009 雄黄溶解液砷不低于 32g/ml， 人参提取物按生药量计不低于 6.75mg/ml， 其中 人参皂苷 Rg1 含量不少于 0.08， 人参皂苷 Re 的含量不少于 0.67， 人参皂苷 Rb1的含量 不少于 0.90 ；。
8、 黄芪提取物按生药量计不低于 25mg/ml， 其中黄芪甲苷含量不少于 0.1 ； 苦参素不低于 250g/ml。 0010 雄黄溶解液是按照中国发明专利申请 2006102000675 公开的细菌处理方法制备， 以电感耦合等离子体原子发射光谱测砷含量。 0011 人参提取物制备工艺流程 ： 0012 说 明 书 CN 102119958 B 3 2/6 页 4 0013 苦参素 ： 分子式为C15H24N2O2， 又称氧化苦参碱， 含量(按干燥品计算) ： 98.17， 购 于陕西旭煌植物科技发展有限公司。 0014 动物实验表明该药物组合物对原癌基因 Ras 通路的过度激活具有明显的下调作。
9、 用， 且毒性低， 该组合物适于在制备抗肿瘤药物中应用。 0015 本发明的有益效果在于提供了一种含雄黄的组合物， 其毒性较雄黄浸出液低， 或 者具有协同作用， 提高了雄黄浸出液的抗肿瘤效果。 具体实施方式 0016 实施例一药物各组分的制备及质量控制 0017 雄黄溶解液的制备 ： 按照中国发明专利申请号为 2006102000675 公开的细菌处理 方法制备。利用浸矿微生物氧化亚铁硫杆菌对雄黄矿粉进行生物法炮制， 雄黄在室温 30 左右， 粒度为 180-200 目， 矿浆浓度为 1， 初始 Fe2+浓度为 1.0g/L， 矿浆 pH 值为 2.2， 细菌 接种量为 20， 130rpm 。
10、摇瓶作用 30 天， 过滤， 滤液即为雄黄溶解液。溶解液以电感耦合等 离子体原子发射光谱 (ICP-AES) 法测定总砷含量为 1590g/ml。临用前稀释至 32g/ml， 待用。 0018 苦参素溶液制备 ： 取苦参素 50mg， 用蒸馏水 5ml 溶解， 使之成为 10mg/ml， 用 0.22m 的滤膜进行过滤。临用前稀释至 250g/ml， 待用。 0019 人参提取物制备 ： 取 13.5g 的人参， 加 8 倍量 90乙醇浸泡 14h 后， 回流提取两 次， 每次 3h， 合并滤液， 回收乙醇， 用蒸馏水定容至 50ml。即原液含生药量为 0.27g/ml， 过 0.22m 的滤。
11、膜。采用岛津 20A 高效液相色谱仪 ( 二极管阵列检测器 ) 测定的。色谱条 件 ： 用ZorbaxC18柱， 以水和乙腈为流动相， 梯度洗脱， 流速1ml/min， 柱温30， 检测波长为 203nm， 测其含量 Rg1含量为 0.08， 人参皂苷 Re 的含量为 0.67， 人参皂苷 Rb1的含量为 0.90。临用前稀释至 6.75mg/ml 待用。 0020 黄芪提取物制备 ： 取黄芪 50g， 加 8 倍量的水浸泡 1h， 煎煮 2h， 过滤， 滤渣加 8 倍量 的水煎煮 2h， 合并滤液， 滤液浓缩至 50ml。即原液为 1g/ml， 过 0.22m 的滤膜。采用岛津 20A 高效。
12、液相色谱仪 ( 蒸发光散射检测器 ) 测定的。色谱条件 ： 用 Cosmosil-C18柱， 以水和 甲醇为流动相， 梯度洗脱， 流速 0.8ml/min， 柱温 40， 检测波长为 254nm， 测其含量黄芪提 取物中黄芪甲苷含量为 0.1。临用前稀释至 25mg/ml 待用。 0021 阳性对照 As4SX 溶液制备 ： 称取过 200 目筛的雄黄粉溶于 0.1N 的氢氧化钠溶液 说 明 书 CN 102119958 B 4 3/6 页 5 中， 使之成为 0.5mM 的储备液， 放于 4冰箱保存 (PNAS 2008 ： 105 ： 4826-4831)。临用前用 0.22m 的滤膜进行。
13、过滤。临用前稀释 32g/ml 待用。 0022 实施例二雄黄溶解液对线虫 Let-60 的抑制作用 0023 材料 ： 秀丽隐杆线虫 ： Let-60(n1046)IV 0024 M液 ： 每升缓冲液中含15g Na2HPO4 12H2O， 3g KH2PO4， 5g NaCl， 0.25g MgSO4 7H2O。 0025 原理 ： 研究发现， 大约 30的人类肿瘤存在 Ras 基因的突变激活及 Ras 蛋白表达 水平增高的现象， (Signal-TransductionM.2005 ： 20-100)， Hara-and Han 采用与人类 Ras 同源的 let-60 秀丽隐杆线虫突变。
14、体， 研究了两种 Ras 法尼基转移酶抑制剂对 Ras 通路 的作用， 结果表明， 这两种 Ras 法尼基转移酶抑制剂可以下调 Ras 通路的过度激活， 多阴门 表型的 let-60 突变体线虫在药物的作用下变成野生型 (PNAS 1995 ： 92 ： 3333-3337.)。因 此， 目前秀丽隐杆线虫多阴门表型突变体已被普遍采用为抗癌基因 Ras 活性药物筛选的模 式生物 (CANCER-CELL 2005 ： 7 ： 325-336)。 0026 此外， Dengg 和 van Meel 的研究结果表明应用秀丽隐杆线虫测定的药物 LC50 对 药物毒性进行排序的结果同以小鼠测定的药物毒性。
15、排序的结果相一致 (J Pharma Toxicol Methods2004 ： 50 ： 209-214)， 因此， 目前秀丽隐杆线虫也已被普遍用于测定药物毒性的大 小。 0027 本发明采用秀丽隐杆线虫的 let-60 突变体作为模式生物对含雄黄药物组合物进 行了药效及毒性的测定。 0028 实验步骤 ： 将在培养皿中培养至成虫的秀丽隐杆线虫用 M 液冲洗下来， 用 6.4次 氯酸钠溶液和 1M NaOH 溶液 (1 1 比例混合 ) 进行同步化， 待卵孵出后， 将 L1 期幼体线虫 放入已铺有 OP50 的不同药物浓度的 NGM 板上， 每板 50 100 条， 每个药物处理设 3 个重。
16、 复。培养至成虫后， 用 M 溶液将线虫从板上冲洗下来， 在倒置显微镜下观察成虫总数及野生 型数目， 计算野生型比例。与空白对照相比， 野生型比率越高意味着药物作用更强。秀丽隐 杆线虫的培养及同步化具体方法参见 Brenner(Genetics 1974 ： 77 ： 71-94)。 0029 LC50实验步骤 ： 雄黄浸出液(640g/ml)稀释成160g/ml和As4S4溶液(150g/ ml) 作为母液， 分别把母液用 M 液按 1 0.8 稀释成 8 个浓度。每个浓度加 L1 期线虫 30-50 条， 每个浓度做 3 个平行。作用 16h 后， 观察并计算其死亡率， 实验结果如表 1 。
17、所示 ： 0030 表 1 雄黄溶解液和阳性对照 As4S4溶液对 Let-60 的作用 0031 组别 总砷含量 (g/mL) 野生型比例 ( ) LC50(g/ml) 空白对照组 M 液 25.04.3 阳性对照组 (As4S4溶液 ) 12.8 45.25.2* 25.1 阳性对照组 (As4S4溶液 ) 3.2 23.60.2 25.1 阳性对照组 (As4S4溶液 ) 0.8 22.43.9 25.1 雄黄溶解液 12.8 84.10.9* 34.0 说 明 书 CN 102119958 B 5 4/6 页 6 雄黄溶解液 3.2 69.71.6* 34.0 雄黄溶解液 0.8 34。
18、.63.8* 34.0 0032 注 ： 与空白组比较 *P 0.05 0033 实施例三雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 0034 实验步骤 ： 同实施例二 0035 LC50 实验步骤 ： 同实施例二 0036 雄黄溶解液组合物 ： 雄黄溶解液 40， 苦参素 0.8， 人参提取物 0.8， 黄芪提取 物 0.8， M 液补足至 100， 实验结果如表 2 所示 ： 0037 表 2 雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 0038 组别 总砷含量 (g/ml) 野生型比例 ( ) LC50(g/ml) 空白组 M 液 36.05.0 雄黄溶解液组合物 12.8 91.92.7*。
19、 49.8 0039 注 ： 与空白组比较 *P 0.05 0040 实施例四雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 0041 实验步骤 ： 同实施例二 0042 LC50 实验步骤 ： 同实施例二 0043 雄黄溶解液组合物 ： 雄黄溶解液 10， 苦参素 20， 人参提取物 4， 黄芪提取物 0.8， M 液补足至 100， 实验结果如表 3 所示 ： 0044 表 3 雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 0045 组别 总砷含量 (g/ml) 野生型比例 ( ) LC50(g/ml) 空白组 M 液 36.05.0 雄黄溶解液组合物 3.2 57.34.7* 55.0 0046 。
20、注 ： 与空白组比较 *P 0.05 0047 实施例五雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 0048 实验步骤 ： 同实施例二 0049 LC50 实验步骤 ： 同实施例二 0050 雄黄溶解液组合物 ： 雄黄溶解液 10， 苦参素 4， 人参提取物 0.8， 黄芪提取物 20， M 液补足至 100， 实验结果如表 4 所示 ： 0051 表 4 雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 0052 说 明 书 CN 102119958 B 6 5/6 页 7 组别 总砷含量 (g/ml) 野生型比例 ( ) LC50(g/ml) 空白组 M 液 36.05.0 雄黄溶解液组合物 3.2。
21、 63.67.1* 43.3 0053 注 ： 与空白组比较 *P 0.05 0054 实施例六雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 0055 实验步骤 ： 同实施例二 0056 LC50 实验步骤 ： 同实施例二 0057 雄黄溶解液组合物 ： 雄黄溶解液 10， 苦参素 0.8， 人参提取物 20， 黄芪提取 物 4， M 液补足至 100， 实验结果如表 5 所示 ： 0058 表 5 雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 0059 组别 总砷含量 (g/ml) 野生型比例 ( ) LC50(g/ml) 空白组 M 液 36.05.0 雄黄溶解液组合物 3.2 77.17.4* 。
22、51.9 0060 注 ： 与空白组比较 *P 0.05 0061 实施例七雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 0062 实验步骤 ： 同实施例二 0063 LC50 实验步骤 ： 同实施例二 0064 雄黄溶解液组合物 ： 雄黄溶解液 2.5， 苦参素 20， 人参提取物 0.8， 黄芪提取 物 4， M 液补足至 100， 实验结果如表 6 所示 ： 0065 表 6 雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 0066 组别 总砷含量 (g/ml) 野生型比例 ( ) LC50(g/ml) 空白组 M 液 36.05.0 雄黄溶解液组合物 0.8 47.32.5* 55.3 0067。
23、 注 ： 与空白组比较 *P 0.05 0068 实施例八雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 0069 实验步骤 ： 同实施例二 0070 LC50 实验步骤 ： 同实施例二 0071 雄黄溶解液组合物 ： 雄黄溶解液 2.5， 苦参素 4， 人参提取物 20， 黄芪提取物 0.8， M 液补足至 100， 实验结果如表 7 所示 ： 0072 表 7 雄黄溶解液组合物对 Let-60 的作用 说 明 书 CN 102119958 B 7 6/6 页 8 0073 组别 总砷含量 (g/ml) 野生型比例 ( ) LC50(g/ml) 空白组 M 液 36.05.0 雄黄溶解液组合物 0。
24、.8 52.66.5* 42.3 0074 注 ： 与空白组比较 *P 0.05 0075 以上实施例动物实验结果表明， 本发明提供的含雄黄药物组合物毒性均较雄黄溶 解液的毒性低， 且对原癌基因 Ras 通路的过度激活具有明显的下调作用。由于本发明是以 秀丽隐杆线虫做为模式生物所获得的结果， 考虑到施用剂量的影响， 当将本发本明所提供 的含雄黄药物组合物用于制备抗肿瘤药物时， 可以将各组分的浓度按比例增加， 这是本领 域技术人员可以理解的。 因此， 特别指出雄黄溶解液砷含量不低于32g/ml， 人参提取物按 生药量计不低于 6.75mg/ml， 其中人参皂苷 Rg1含量不少于 0.08， 人参皂苷 Re 的含量不 少于 0.67， 人参皂苷 Rb1的含量不少于 0.90 ； 黄芪提取物按生药量计不低于 25mg/ml， 其中黄芪甲苷含量不少于 0.1 ； 苦参素不低于 250g/ml。 说 明 书 CN 102119958 B 8 。