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1、10申请公布号CN104160038A43申请公布日20141119CN104160038A21申请号201280067832422申请日2012112311306568420111125EP12306042820120831EPC12Q1/6820060171申请人国家健康科学研究所地址法国巴黎申请人英特盖根公司国家科学研究中心法国公立援助医院巴黎笛卡尔大学72发明人T里奥弗里奥P劳伦皮格S因班德74专利代理机构北京戈程知识产权代理有限公司11314代理人程伟程云54发明名称一种用于预测对采用EGFR抑制剂的治疗的响应性的方法57摘要本发明涉及一种用于预测患有癌症的患者是否会响应表皮生长因子。
2、受体EGFR抑制剂的方法，该方法包括确定所述患者样本中的HSAMIR313PMIRNA表达水平。本发明也涉及EGFR抑制剂在经预测对所述EGFR抑制剂有响应的患者中的治疗用途。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014072386PCT国际申请的申请数据PCT/EP2012/0735352012112387PCT国际申请的公布数据WO2013/076282EN2013053051INTCL权利要求书2页说明书20页序列表5页附图7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书20页序列表5页附图7页10申请公布号CN104160038ACN104160038。
3、A1/2页21一种用于预测患有癌症的患者是否可能响应表皮生长因子受体EGFR抑制剂的体外方法，该方法包括确定所述患者样本中HSAMIR313PSEQIDNO1MIRNA的表达水平。2根据权利要求1所述的方法，其中患者患有KRAS野生型癌症。3根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中患者患有选自如下的癌症结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、头颈癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌和脑癌。4根据权利要求3所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌，尤其是转移性结肠直肠癌。5根据权利要求3所述的方法，其中所述癌症是乳癌，尤其是三阴性乳癌。6根据权利要求3所述的方法，其中所述癌。
4、症是肺癌，尤其是非小细胞肺癌NSCLC。7根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述的EGFR抑制剂是抗EGFR抗体，尤其是西妥昔单抗或者帕尼单抗。8根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述的EGFR抑制剂是酪氨酸激酶EGFR抑制剂，尤其是厄洛替尼、吉非替尼或者拉帕替尼。9根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述的样本是肿瘤组织活检或者完整或部分的肿瘤外科切除。10根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述的MIRNA的表达水平由定量RTPCR来确定。11根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中所述MIRNA的表达水平越低，则患者越有可能响应EGFR抑制剂治疗。12根据权利要求1。
5、至11任一项所述的方法，还包括基于MIRNA表达水平确定预后分数，其中所述预后分数表明患者是否可能响应EGFR抑制剂。13根据权利要求12所述的方法，其中所述预后分数如下式预后分数AXB,其中X是所测患者样本中测量的HSAMIR313P表达水平的对数，A和B是基于参考样本池所预定的参数，以及如果患者的预后分数小于或等于阈值C，则预测他/她响应EGFR抑制剂；以及如果其预后分数大于阈值C，则预测他/她不响应EGFR抑制剂，其中所述C的值是基于相同的参考样本池所确定的。14根据权利要求13所述的方法，其中所述A、B和C优选在以下范围内A01；025，优选为017；021；B2；05，优选为18；0。
6、6，优选为15；07；以及C011；001，优选为010；001。15根据权利要求1至11任一项所述的方法，还包括确定所述患者的BRAF状态，并考虑HSAMIR313P的表达水平和BRAF的状态计算出组合分数，其中所述组合分数表明患者是否可能响应EGFR抑制剂。16一种用于确定患有癌症的患者是否可能响应表皮生长因子受体EGFR抑制剂的试剂盒，其包含或由以下组成权利要求书CN104160038A2/2页3A用于确定所述患者样本中HSAMIR313PSEQIDNO1MIRNA表达水平的试剂，以及B用于确定患者BRAF状态的试剂。17一种EGFR抑制剂，其用于治疗患有癌症的患者，其中所述患者根据权利。
7、要求1至15任一项所述的方法被分类为可能有响应。18根据权利要求17所述的EGFR抑制剂，用于治疗患有结肠直肠癌的患者，更尤其是转移性结肠直肠癌。19根据权利要求17所述的EGFR抑制剂，用于治疗患有乳癌的患者，尤其是三阴性乳癌。20根据权利要求17所述的EGFR抑制剂，用于治疗患有肺癌的患者，尤其是非小细胞肺癌NSCLC。21根据权利要求17至20任一项所述的EGFR抑制剂，用于治疗患有癌症的患者，其中所述的EGFR抑制剂是抗EGFR抗体，尤其是西妥昔单抗或者帕尼单抗。22根据权利要求17至20任一项所述的EGFR抑制剂，用于治疗患有癌症的患者，其中所述的EGFR抑制剂是酪氨酸激酶EGFR抑。
8、制剂，尤其是厄洛替尼、吉非替尼、或者拉帕替尼。23一种用于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括I通过权利要求1至15任一项所述的方法，确定患者是否可能响应EGFR抑制剂，以及II如果确定所述患者可能响应EGFR抑制剂，则向所述患者施用EGFR抑制剂。24根据权利要求23所述的方法，如果确定患者难以响应EGFR抑制剂，则所述方法还包括对患者施用替代抗癌治疗的步骤III。25根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述患者患有结肠直肠癌，更尤其是转移性结肠直肠癌。26根据权利要求24所述的方法，其中所述患者患有结肠直肠癌，更尤其是转移性结肠直肠癌，以及对患者施用的替代抗癌治疗选自AVEGF。
9、抑制剂，有利地与FOLFOX或FOLFIRI化疗方法联用，或者B5FU，任选地与丝裂霉素B联用。27根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述患者患有乳癌，尤其是三阴性乳癌。28根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述患者患有肺癌，尤其是非小细胞肺癌NSCLC。29根据权利要求23至28任一项所述的方法，其中所述的EGFR抑制剂是抗EGFR抗体，尤其是西妥昔单抗或者帕尼单抗。30根据权利要求23至29任一项所述的方法，其中所述的EGFR抑制剂是酪氨酸激酶EGFR抑制剂，尤其是厄洛替尼、吉非替尼或者拉帕替尼。权利要求书CN104160038A1/20页4一种用于预测对采用EGF。
10、R抑制剂的治疗的响应性的方法技术领域0001本发明提供癌症治疗的个体化化疗的方法，尤其是在使用一种或者多种表皮生长因子受体EGFR抑制剂进行治疗之前，评价患者对这种药剂响应性的方法。背景技术0002蛋白酶体在调节由激活的细胞膜生长因子受体所诱导的转导蛋白周转TURNOVER中发挥关键的作用。表皮生长因子受体EGFR通路在人类上皮细胞癌的发生和发展中起到关键作用。在具有功能性EGFR依赖的自分泌生长通路的不同人类癌症细胞中，同EGFR抑制剂的联合治疗具有协同的生长抑制和促凋亡活性，从而更加高效和持续的抑制AKT。0003EGFR抑制剂已经在多种癌症治疗中被批准或者测试，包括非小细胞肺癌NSCLC。
11、、头颈癌、结肠直肠癌和HER2阳性的乳癌，同时也更多的被引入到标准的治疗中。EGFR抑制剂可以靶向EGFR靶标的胞内酪氨酸激酶结构域或者胞外的结构域，EGFR抑制剂的普遍困扰是人群响应率低，并导致化疗在许多病例中无效或者非最佳，以及不必要的药物毒性和费用。比如，据报道，西妥昔单抗一种靶向EGFR胞外结构域的嵌合型单克隆抗体在治疗结肠直肠癌时的临床响应率约为11CUNNINGHAM等人,NENGLMED2004；35133745，埃罗替尼对于NSCLC的临床响应率约为89SHEPHERDFA等人,NENGLJMED2005；353123132。0004尤其在KRAS突变的情况中，已经观察到了耐受。
12、性。0005在结肠直肠癌中，由于KRAS突变与抗EGFR抗体的耐受性有明确的相关性LIEVRE等人,CANCERRES200666839925，主要的挑战之一是在不带有KRAS突变的患者中鉴定能够预测对这种治疗缺乏响应的其它标记物。在其中，上述原癌基因的扩增或者激活突变、以及肿瘤抑制基因的失活突变作为候选，比如通过测量EGFR下游磷酸化蛋白的表达评价EGFR下游信号通路的激活水平。0006在肺癌中有三类患者一类患者带有EGFR突变的肿瘤，对于这类患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂EGFRTKI被证明是可以改善结果的，第二类患者带有KRAS突变的肿瘤，对于这类患者抗EGFR的治疗很可能不是好的选择。
13、，以及第三类既没有EGFR突变也没有KRAS突变的肿瘤，对于这类患者无法预测响应。在没有突变肿瘤的患者中，至今没有药物响应相关的标记物被证明是有价值的。0007因此，为了更好的对患者进行个性化治疗，在使用EGFR抑制剂治疗之前，需要预测患者对这种药剂的响应性。0008在现有技术中，有很多文献涉及将微小RNAMICRORNAMIRNA与多种抗癌症治疗的敏感性或者耐受性相联系。然而，在大多数情况下，研究是部分的、不完整的，并且实际上也不允许真正预测对治疗的临床响应或非响应。事实上，在很多情况下，研究只局限在体外、在对具体治疗敏感或耐受的细胞系中、或者在分离自患者肿瘤的肿瘤细胞中分析MIRNA的表达。
14、。此外，许多研究中虽然显示出两种细胞群或患者群之间表达水平上的差异，但并没说明书CN104160038A2/20页5有给出阈值或者分数以允许真正在新的患者中预测响应或非响应。这与许多研究缺乏获自临床环境SETTING的数据的第一缺点部分相关。此外，即使存在一些获自临床环境的数据时，这些数据大多时候仅仅是回顾性的，而通常缺少在新群体中进行预测方法验证的数据。0009作为一个实例，WO2010/121238描述了在对EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感或耐受的肺癌细胞系培养物中进行的体外MIRNA表达分析。没有显示获自临床环境的数据。0010WO2009/080437广泛要求了用于预测对抗癌治疗响应或非响。
15、应的方法。但是，WO2009/080437中显示的数据只局限于多种传统化疗治疗，并没有提供与EGFR抑制剂既没有抗EGFR的单克隆抗体，也没有EGFR酪氨酸激酶抑制剂相关的数据。此外，基于MIRNA在肿瘤细胞中的表达，获得针对其它化疗分子所显示的数据，其中所述肿瘤细胞分离自体外培养的患者肿瘤。没有显示获自临床环境的数据。0011类似的，尽管WO2011/135459广泛要求用于预测对抗癌治疗响应或非响应的方法，此文件中显示的数据仅限于体外预测癌细胞系对各种抗癌药物的敏感性或耐受性。此处也仍然没有显示获自临床环境的数据，因此没有表明MIRNA表达水平跟临床响应或者患者存活之间的相关性。0012R。
16、AGUSA等人2010RAGUSAM等人MOLCANCERTHER2010十二月；9123396409分析了在结肠直肠癌细胞系中用西妥昔单抗治疗之后MIRNA的表达水平，已知所述细胞系对西妥昔单抗治疗是敏感或耐受的。在KRAS野生型和KRAS突变的患者中显示有两个MIRNA的表达是有差异的。然而，KRAS野生型和KRAS突变的患者中的差异表达不允许在KRAS野生型患者中预测对EGFR抑制剂的响应。此外，跟许多其它研究一样，并没有显示获自临床环境的数据以表明这些MIRNA的表达水平在患者中独立预测对EGFR抑制剂响应的能力。0013HATAKEYAMA等人2010HATAKEYAMAH等人PLO。
17、SONE2010九月13；59E12702公开了两种细胞系在体外用西妥昔单抗处理后蛋白被激活的比较，这两种细胞系来源于头颈部的鳞状细胞癌，一种对西妥昔单抗敏感而另一种耐受。EGFR的配体HBEGF或者TGFA以较高量见于西妥昔单抗耐受的细胞系中。这种蛋白受MIR22所调控。在这个研究中也没有显示获自临床环境的数据以表明MIR22的表达水平在患者中预测对西妥昔单抗响应的能力。0014因此，许多研究缺乏临床数据来说明特定MIRNA的表达水平真正允许区分临床上响应治疗导致存活提高的患者和疾病进展且存活降低的患者。然而，在体外的细胞系或者肿瘤细胞上的数据可以被视为对用于在临床环境中预测响应或非响应的其。
18、它分析的支持，它显然不足以被视为提供了在患者中预测临床响应的真正方法。这尤其得到这一事实的证明，即上述文件中提到的体外发现的在敏感和耐受细胞系或肿瘤细胞中差异表达的MIRNA，在本申请分析的临床数据中没有发现与临床响应无进展存活或总体存活显著相关。0015因此，需要真正的经验证的用于在患者中预测对EGFR抑制剂的响应的方法，其中针对所述患者这种治疗只是多种选择之一。本发明针对这种需求给出了回应。发明内容说明书CN104160038A3/20页60016本发明提供了一种用于预测患有癌症的患者是否可能响应表皮生长因子受体EGFR抑制剂的体外方法，该方法包括确定所述患者样本中HSAMIR313P曾用。
19、名HSAMIR31，SEQIDNO1MIRNA的表达水平。0017优选患者患有KRAS野生型的癌症。0018癌症优选是结肠直肠癌，优选转移性结肠直肠癌。0019在最优选的实施方式中，本发明提供了一种用于预测患有转移性结肠直肠癌的患者是否可能响应表皮生长因子受体EGFR抑制剂如西妥昔单抗或者帕尼单抗的体外方法，该方法包括确定所述患者的肿瘤组织样本中HSAMIR313PSEQIDNO1MIRNA的表达水平。0020本发明还提供了一种用于确定患有癌症的患者是否可能响应表皮生长因子受体EGFR抑制剂的试剂盒，其包含或由以下组成用于确定所述患者样本中HSAMIR313PSEQIDNO1MIRNA表达水平。
20、的试剂，以及用于确定患者BRAF状态的试剂。0021本发明还涉及一种EGFR抑制剂，其用于治疗患有癌症的患者，其中所述患者根据本发明的方法被分类为可能有响应。0022本发明还涉及EGFR抑制剂用于制备预期用于在患者中治疗癌症的药物的用途，其中根据本发明的方法所述患者被分类为“响应者”。0023本发明还涉及一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括I通过权利要求1至15任一项所述的方法，确定患者是否可能响应EGFR抑制剂，以及II如果确定所述患者可能响应EGFR抑制剂，则向所述患者施用EGFR抑制剂。附图说明0024图1是显示通过阵列所定量的HSAMIR313P的表达水平的图N43；平均值SEM。。
21、分子量在图中显示。PTTT0059GLY13SERGGCAGC0060优选地，患者肿瘤中的KRAS基因也未呈现出以下任一突变BOSCANCERRES1989；4946824689；TAM等人CLINCANCERRES2006；1216471653；EDKINS等人CANCERBIOLTHER2006八月；58928932；DEMIRALAY等人SURGICALSCIENCE,2012,3,1111150061GLN61HISCAACAC0062GLN61HISCAACAT0063GLN61ARGCAACGA0064GLN61LEUCAACTA0065GLN61GLUCAAGAA0066GLN6。
22、1LYSCAAAAA0067GLN61PROCAACCA0068本领域内已知的任何方法均可被用来获知患者的KRAS状态。0069例如，肿瘤组织被显微切割，并从石蜡包埋的组织块中提取DNA。用聚合酶链式反应PCR对KRAS基因中覆盖第12、13和61位密码子的区域进行扩增。突变状态可以通过用PCR探针进行的等位基因分型LAURENTPUIGP，等人,JCLINONCOL2009,2735592430或通过任何其它方法，如焦磷酸测序OGINOS,等人JMOLDIAGN2008；741321来确定。0070“样本”可以为源自患者的任何生物样本，其中包含核酸。这种样本的实例包含生物液包含血液、血浆、唾。
23、液、尿液、精液、组织、细胞样本、器官、活检等。优选地，样本为肿瘤样本，优选为肿瘤组织活检或者完整或部分肿瘤外科切除。样本可以根据常规的技术进行收集，并直接用于诊断或贮存。肿瘤样本可以是新鲜的、冷冻的或者石蜡包埋的。通常地，可用的肿瘤样本是冷冻的或者石蜡包埋的，大多数时候是石蜡包埋的。本发明人已经证明冷冻的和石蜡包埋的肿瘤组织均是可用的。说明书CN104160038A7/20页100071“参考样本”是指对EGFR抑制剂治疗阳性或者阴性响应已知的患者的肿瘤样本尤其是肿瘤活检或者完整或部分的肿瘤外科切除。优选地，参考样本池包含至少一名优选地为数名，更优选地为至少5名，更优选地至少6名，至少7名，至。
24、少8名，至少9名，至少10名响应的患者和至少一名优选地为数名，更优选地至少6名，至少7名，至少8名，至少9名，至少10名无响应的患者。响应者也被称为“阳性”和无响应者也被称为“阴性”参考样本的数目越多，则根据本发明的预测方法的可靠性就越好。0072在本发明的上下文中，患者是“可能响应的”或是“响应者”指的是患者对抗EGFR抑制剂的治疗有响应，即他的至少一个症状得到缓解，或者是疾病的发展被终止或减慢。依据RECIST标准EISENHAUER等人，EUROPEANJOURNALOFCANCER,2009,45228247，完全响应者、部分响应者、或者稳定患者在本发明的上下文中均被认为是“可能响应的。
25、”或是“响应者”。0073在实体肿瘤中，RECIST标准是基于出现至少一个可测量病变的国际标准。“完全响应”是指所有靶病变都消失；“部分响应”是指靶病变最长直径总和减少30，“进展性疾病”是指靶病变最长直径总和增加20，“稳定的疾病”是指不符合上述标准的变化。0074更优选地，“响应”患者被预测显示有良好的无进展存活PFS，即患者可能至少存活25周而没有疾病症状的加重，和/或该患者显示良好的总体存活OS，即患者可能至少存活14个月。0075术语“预测”或者“预后”是指患者对EGFR抑制剂治疗响应的概率或可能性。0076根据本发明，肿瘤细胞生长对EGFR抑制剂抑制的灵敏度是通过该肿瘤细胞是否表达。
26、HSAMIR313PMIRNA来预测的。0077术语“处理”或者“治疗”是指稳定、缓解、治愈或者减轻癌症的进展。0078“MIRNA”或者“微小RNAMICRORNA”是约21到24个核苷酸的单链分子，优选地长度为2123个，它们由转录自DNA的基因所编码，但不被翻译成蛋白非编码RNA；而是由被称为PRIMIRNA的初级转录物加工成被称为PREMIRNA的短的茎环结构，并最终加工成功能性MIRNA。在成熟的过程中，每一个PREMIRNA都产生两个高度互补的不同片段，一个源自编码该PRIMIRNA的基因的5臂，另一个源自3臂。成熟的MIRNA分子部分地与一个或者多个信使RNAMRNA分子互补，它。
27、们的主要功能是下调基因的表达。0079有一个MIRNA的国际命名方式见AMBROSV等人，RNA200393277279；GRIFTHSJONESSNAR200432数据库发布D109D111；GRIFTHSJONESS等人NAR200634数据库发布D140D144；GRIFTHSJONESS等人NAR200836数据库发布D154D158；以及KOZOMARAA等人NAR201139数据库发布D152D157，可以在MIRBASE数据库HTTP/WWWMIRBASEORG/中获取。每一个MIRNA都被以预定格式分派一个唯一名称，如下0080针对成熟MIRNASSSMIRXY，其中“0081。
28、SSS是用来表明MIRNA物种的三字母编码，“HAS”表示人类，0082MIR中的大写“R”表示它是成熟MIRNA。然而一些作者在文献中也滥用“MIR”来表示成熟MIRNA。在这种情况下，也可以通过“Y”的存在来识别它是成熟MIRNA，0083X是任意的唯一数字用来指定特定物种中MIRNA的序列，如果已知有多个高度同源的MIRNA，那么后面可以再加一个字母。如，“20A”和“20B”表示高度同源的MIRNA。说明书CN104160038A108/20页110084Y表示切割PREMIRNA得到的成熟MIRNA是对应于编码PRIMRNA的基因的5臂那么Y为“5P”还是3臂那么Y为“3P”。在前述。
29、的MIRNA国际命名中，没有出现“Y”。然后通过N后面“”符号的存在或缺失来区分获自编码PRIMRNA的基因的5臂或3臂的两个成熟MIRNA。带有“”符号表明该序列对应着较少检测到的MIRNA。由于这种分类方式已经发生改变，因此采用“3P”和“5P”编码的新命名已经得以实施。0085对于PRIMIRNASSSMIRX，其中0086SSS是用来表明MIRNA物种的三字母编码，“HAS”表示人类，0087MIR中的小写“R”表示它是PRIMIRNA而不是成熟的MIRNA，这可以通过不存在“Y”来确认，0088N是任意唯一数字用来指定特定物种中MIRNA的序列，如果已知有数个高度同源的MIRNA，后。
30、面可以加上一个字母。0089对每个MIRNA的序列也指定一个登陆号。0090本发明中所检测的MIRNA为HSAMIR313P曾被命名为HSAMIR31。在该命名中，“HSA”表示其为人MIRNA，“MIR”表示成熟的MIRNA，“31”是指该特定MIRNA所指定的任意编号，以及“3P”表示该成熟MIRNA获自编码PRIMRNA的基因的3臂。0091MIR313P为UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAUSEQIDNO10092HTTP/WWWMIRBASEORG中登陆号为MIMAT0004504。0093样本中MIRNA水平的检测方法0094MIRNA的表达水平可由本领域中任何技术人员所熟。
31、知的方法来确定，如MIRNA可被定量。尤其地，可以用实时定量RTPCRQRTPCR。0095还可以采用核酸分析或阵列来评价样本中MIRNA的水平。0096在一些实施方式中，可以制备或购买寡核苷酸阵列。阵列通常包括固态的支持物和至少一个与该支持物接触的寡核苷酸，其中寡核苷酸与MIRNA的至少部分相对应。0097样本中MIRNA的存在可以由任何合适的分析平台来确定。例如，分析的形式可以是膜、芯片、皿、测试条、滤器、微球、多孔板等。分析系统可具有附着有寡核苷酸的固态支持物，寡核苷酸与MIRNA相对应。固态支持物可以包含例如塑料、硅、金属、树脂或者玻璃。可以制备分析组成，并包装到一起构成用来检测MIR。
32、NA的试剂盒。0098在一些实施方式中，QRTPCR可以被用来对靶标RNA进行检测和定量BUSTIN等人，2005，CLINSCI,109365379。通过QRTPCR得到的定量结果往往比定性的数据具有更大的信息量，并能简化标准分析流程和质量管理。因此，在一些实施方式中，基于QRTPCR的分析可以被用来在基于细胞的分析中测量MIRNA的水平。QRTPCR方法也可以被用来监测患者的治疗。基于QRTPCR方法的实例可以在如USPATNO7,101,663中找到。商品化可获得的基于QRTPRC的方法如TAQMEN阵列。也可以采用来自APPLIEDBIOSYSTEMS的人MIRNA盘。0099在另一实。
33、施方式中，MIRNA的定量可以通过测序来进行。0100患者分类0101HSAMIR313P的表达越低，对于患者来说就越好。因此，MIRNA的表达水平越低，患者对EGFR抑制剂治疗响应的可能性就越大。在一个实施方式中，当患者的HSAMIR313P的表达低于对照值时，其就被认为是“响应者”，或可能对EGFR抑制剂的治说明书CN104160038A119/20页12疗有响应。0102这种对照值可以基于如上所定义的参考样本池来确定。特别地，图1和图2A清晰地表明，基于参考样本池，可以定义HSAMIR313P表达水平的对照值HSAMIR313P表达水平的对数来允许预测对EGFR抑制剂的治疗响应或者不响应。
34、。0103然而，在一个优选的实施方式中，方法还包括基于MIRNA的表达水平来确定预后分数或指数，其中预后分数表明患者是否可能对EGFR抑制剂响应。尤其是，所述预后分数可表明患者是否可能对EGFR抑制剂响应取决于是否预后分数高于或低于预定的阈值二分的结果。在另一个实施方式中，可以从预后分数得到对EGFR抑制剂响应或者不响应的离散概率。0104如果对所述患者施用EGFR抑制剂的治疗，患者对EGFR抑制剂治疗响应的概率与患者的存活概率相关，而无论是否有疾病进展。0105因此，预后分数可以基于分析如上所定义的参考样本池的HSAMIR313P的表达水平与无进展存活PFS或总体存活OS的相关性来确定。于是。
35、，可以将PFS和/或OS分数作为预后分数来预测对EGFR抑制剂的响应，PFS和/或OS分数是关联PFS或OS与HSAMIR313P表达水平的函数。因为无病进展是对EGFR抑制剂治疗响应的明确指示，所以优选地采用PFS分数。0106在一个优选的实施方式中，预后分数为实施例部分所示的所确定的预后分数之一0107预后分数可以通过下式计算基于实施例1所公开的22个参考样本的池所确定0108PFS分数0203738X1453362，其中X是HSAMIR313P表达的对数。0109OS分数0190677X1360191，其中X是HSAMIR313P表达的对数。0110如果患者的预后分数小于或等于00980。
36、88PFS和/或00918OS，那么他/她就被预测为响应者。优选地，如果患者的预后分数小于或等于0098088PFS，那么他/她就被分类认为是响应者。0111在另一个实施方式中，预后分数可以通过下式计算基于实施例2所公开中的33个参考样本的池所确定0112PFS分数0178366X1363693，其中X是HSAMIR313P表达的对数。0113OS分数0102142X0780927，其中X是HSAMIR313P表达的对数。0114如果患者的预后分数小于或等于003123PFS和/或0017884OS，那么他/她就被预测为响应者。优选地，如果患者的预后分数小于或等于003123PFS，那么他/她。
37、就被分类认为是响应者。0115实验部分所确定的PSF和OS分数是基于23个和33个参考样本的池所得到的，这就解释了实施例1和2中所确定的PFS分数中PSF与HSAMIR313P表达水平对数相关性的线性函数的参数之间的微小偏差。尽管纳入更多参考样本可能在这些参数中带来一些其它微小偏差，但是本发明人所获得的结果证实了患者的存活PFS或者OS与肿瘤样本中HSAMIR313P表达对数之间存在线性相关性。因此，从本发明人获得的实验数据中可以得出结论，患者对EGFR抑制剂治疗响应的概率与HSAMIR313P表达水平的对数线性相关。在一个优选的实施方式中，所述预后分数于是可以采用下式表示说明书CN10416。
38、0038A1210/20页130116预后分数AXB，其中X是患者样本中所测量的HSAMIR313P表达水平的对数，A和B是按照上述定义的预先基于参考样本池所确定的参数。0117如果患者的预后分数小于或等于阈值C，那么他/她就可以被预测为对EGFR抑制剂响应，如果患者的预后分数大于阈值C，则对EGFR抑制剂不响应，其中C值也基于相同的参考样本池所确定。0118基于本发明人所进行的实验中可以确定，在该例中，A、B和C优选在以下范围0119A01；025，优选为017；021；0120B2；05，优选为18；06，优选为15；07；以及0121C011；001，优选为010；001。如果采用PFS。
39、分数，C优选在010；003的范围内；如果采用OS分数，C优选在01；0015的范围内。0122在另一实施方式中，对EGFR抑制剂响应或不响应的离散概率可以源自上面的预后分数AXB。预后分数越低，对EGFR抑制剂治疗的响应概率越高。预后分数与对EGFR抑制剂治疗的响应概率之间的精确相关性可以基于相同的参考样本组所确定。0123尽管对EGFR抑制剂的响应可以仅基于HSAMIR313P的表达水平来预测见实施例1和2，本发明人还确定如果综合考虑HSAMIR313P的表达水平和BRAF的状态见实施例2，甚至可以得到更加可信的预测。因此，在一个优选的实施方式中，本发明的方法进一步包含确定所述患者BRAF。
40、的状态，并通过考虑HSAMIR313P表达水平和BRAF的状态计算出组合分数，其中组合分数表明患者是否可能对EGFR抑制剂有响应。0124BRAF基因也被称为原致癌基因BRAF和VRAF小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物B1，而蛋白较正式地被称为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BRAF。该蛋白在调节MAP激酶/ERKS信号通路中发挥作用，从而影响细胞分裂、分化和分泌。该基因的突变与多种癌症相关，包括非霍奇金淋巴瘤、结肠直肠癌、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、非小细胞肺癌和肺的腺癌。0125与登陆号为NP_0043242SEQIDNO3限定的野生型BRAF蛋白序列相比，根据患者肿瘤中的BRAF蛋白包含或不包含V600E突。
41、变在600位密码子上的缬氨酸被谷氨酸的取代，可将“BRAF状态”定义为野生型或突变型。如果与蛋白序列NP_0043242相比，BRAF蛋白不包含V600E突变，则BRAF状态被认为是“BRAF野生型”。反之，如果与蛋白序列NP_0043242相比，患者肿瘤中的BRAF蛋白包含V600E突变，则BRAF状态被定义为“BRAF突变型”。0126可以在肿瘤样本上，优选在采用EGFR抑制剂处理之前，采用例如等位基因鉴别分析如LAURENTPUIGP，等人，JCLINONCOL2009,2735592430和LIVRE等人JCLINONCOL2008一月20；2633749中所述或者直接测序来确定BRA。
42、F状态。0127组合分数可以进一步包括与预测对EGFR抑制剂响应相关的附加参数。这样的附加参数可以包括例如年龄和性别。0128组合分数尤其可以基于列线图，其中对组合分数的每个变量建立点数等级。对于指定的患者，通过从每个变量的点数等级中选取相应的点数将点数分配给每个变量。对于离散的变量如HSAMIR313P的表达水平或者年龄，归属于变量的点数目与变量的值线性相关。对于二分的变量只有两种可能的值，如BRAF的突变状态或者性别，将两个不同的值归属于变量的两个可能的值中的每一个。0129然后，通过将每个变量所分配的点数相加来计算组合分数。在组合分数值的基础说明书CN104160038A1311/20页。
43、14上，根据组合分数是否小于或大于阈值二分的分数，然后对患者作出良好或者不良的响应预后，或给出对治疗响应或者不响应的概率。0130可以基于相同的参考样本池确定每个变量的分数等级，以及阈值或者组合分数与响应或不响应概率之间的相关性，其中在所述阈值之上/之下响应预后是良好或不良。0131实施例2中给出了这样的组合分数的具体实例同时参见图6B和图7B，具体实例对应于本发明的优选实施方式。0132EGFR抑制剂0133本发明使得能够在用一种或者多种表皮生长因子受体EGFR抑制剂进行治疗之前预测患者对这种药剂的响应性。0134EGFR抑制剂可以是EGFR酪氨酸激酶的抑制剂，或者可以靶向EGFR靶的胞外结。
44、构域。0135优选的，该EGFR抑制剂是抗EGFR的抗体，优选为单克隆抗体。0136在一些实施方式中，EGFR抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂，如厄洛替尼、吉非替尼、或拉帕替尼，或者是靶向EGFR胞外结构域的分子，如西妥昔单抗或帕尼单抗。0137靶向EGFR胞外结构域的分子包括主要被用来治疗结肠直肠癌或乳癌的抗EGFR单克隆抗体，如西妥昔单抗或帕尼单抗。因此，如果患者的癌症是结肠直肠癌尤其是转移性结肠直肠癌或者乳癌，那么根据本发明的方法优选用于预测对分子的响应，其中所述分子靶向EGFR胞外结构域，尤其是抗EGFR单克隆抗体，如西妥昔单抗或帕尼单抗。0138相反地，酪氨酸激酶EGFR抑制剂主要被用来治疗。
45、肺癌尤其是非小细胞肺癌，NSCLC，因此如果患者的癌症是肺癌尤其是非小细胞肺癌，NSCLC，那么根据本发明的方法优选用于预测对酪氨酸激酶EGFR抑制剂如厄洛替尼、吉非替尼、或拉帕替尼的响应。0139在胰腺癌或者头颈癌尤其是头颈部鳞状细胞癌SCCHN中，酪氨酸激酶EGFR抑制剂和抗EGFR单克隆抗体都被作为治疗进行了测试，因此，如果患者的癌症是胰腺癌或者头颈癌尤其是头颈部鳞状细胞癌SCCHN，那么根据本发明的方法用于预测对酪氨酸激酶EGFR抑制剂如厄洛替尼、吉非替尼、或拉帕替尼或者抗EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗或帕尼单抗的响应。0140西妥昔单抗和帕尼单抗是目前临床上应用最多的抗EGFR单克隆。
46、抗体。然而，更多的抗EGFR单克隆抗体也在开发中，如NIMOTUZUMAB无对应中译文THERACIMHR3、MATUZUMAB无对应中译文EMD72000和ZALUTUMUMAB无对应中译文HUMAXEGFR。根据本发明的方法也可以用来预测对这些抗EGFR单克隆抗体或者对任何其它可能被进一步开发出来的抗EGFR单克隆抗体包括其片段的响应，尤其是如果患者患有结肠直肠癌尤其是转移性的结肠直肠癌、乳癌、胰腺癌或者头颈癌尤其是头颈部鳞状细胞癌SCCHN。0141类似的，厄洛替尼、吉非替尼、和拉帕替尼是目前临床上应用最多的酪氨酸激酶EGFR抑制剂。然而，更多的酪氨酸激酶EGFR抑制剂也在开发中，如卡奈。
47、替尼CI1033、来那替尼HKI272、阿法替尼BIBW2992、DACOMITINIB无对应中译文PF299804，PF00299804、TAK285、AST1306、ARRY334543、AG1478TYRPHOSTINAG1478无对应中译文、AV412、OSI420DESMETHYLERLOTINIB无对应中译文、AZD8931、AEE788NVPAEE788、培利替尼EKB569、CUDC101、AG490、PD153035HCL、XL647和说明书CN104160038A1412/20页15BMS599626AC480。根据本发明的方法也可以用来预测对这些酪氨酸激酶EGFR抑制剂，。
48、或者任何其它可能被进一步开发出来的酪氨酸激酶EGFR抑制剂的响应，尤其是如果患者患有肺癌尤其是非小细胞肺癌，NSCLC、胰腺癌、或头颈癌尤其是头颈部鳞状细胞癌SCCHN。0142试剂盒0143本发明还涉及一种用于确定患有癌症的患者是否可能对表皮生长因子受体EGFR抑制剂响应的试剂盒，其包含或由如下组成0144A用于确定所述患者样本中HSAMIR313PSEQIDNO1MIRNA表达水平的试剂优选肿瘤样本，例如肿瘤活检，或者完整或部分肿瘤外科切除，以及0145B用于确定患者BRAF状态的试剂。0146用于确定所述患者的样本中HSAMIR313PSEQIDNO1MIRNA表达水平的试剂，尤其包括引。
49、物对正向引物和反向引物和/或特异于HSAMIR313PSEQIDNO1MIRNA的探针，或者包括特异于HSAMIR313PSEQIDNO1MIRNA的序列的MIRNA微阵列。0147用于确定患者BRAF状态的试剂可以包括用来在测序之前扩增全部或者部分BRAF基因的至少一对引物对，或者用于等位基因鉴别分析的在5端标记有荧光报告染料FAM和VIC的一组特异性探针，例如ABI7900HTSEQUENCEDETECTIONSYSTEMAPPLIEDBIOSYSTEMS,福斯特城,CA参见LAURENTPUIGP,等人,JCLINONCOL2009,2735592430以及LIVRE等人JCLINONCOL2008一月20；2633749。0148本发明的试剂盒进一步包含说明书，基于HSAMIR313PSEQIDNO1MIRNA的表达水平和BRAF的状态用于确定患者是否可能会对EGFR抑制剂有响应，以及任选地包含其它额外的参数。尤其，如图5B和6B所示，包括组合分数所含全部变量的点数等级的列线图、以及组合分数点数的总数与预测响应/非响应、或者响应或非响应的概率之间的相关性，可以包括在内。0149药物、治疗用途以及治疗方法0150本发明方法预测出的患者对EGFR抑制剂响应性的比例与临床所报道的对EGFR抑制。