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1、10申请公布号CN104151399A43申请公布日20141119CN104151399A21申请号201310176723222申请日20130514C07K7/08200601C07K16/08200601G01N33/6820060171申请人中国医学科学院病原生物学研究所地址100730北京市东城区东单三条9号72发明人王健伟郭丽王雅英G弗奈特74专利代理机构北京北翔知识产权代理有限公司11285代理人张广育姜建成54发明名称博卡病毒HBOV共有的特异性表位、其应用及其抗体57摘要本发明公开了博卡病毒HBOV共有的特异性表位肽、其应用及其抗体。具体地，所述特异性表位肽为MSDTDIQ。
2、DQQPDTVDAPQNT或EHAYPNASHPWDEDVMPDL。51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表4页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表4页附图3页10申请公布号CN104151399ACN104151399A1/1页21在HBOV14中通用的博卡病毒特异性抗原表位肽，其序列为SEQIDNO1或SEQIDNO2。2一种检测博卡病毒抗体的非诊断方法，包括1使样本与权利要求1的博卡病毒特异性抗原表位肽接触；2检测抗原抗体反应，结果为阳性说明存在博卡病毒抗体。3权利要求2的方法，其中所述样本是人血清。4权利要求2或3的方法，其中所述检。
3、测抗原抗体反应的过程为先加入辣根过氧化物酶山羊抗人IGM孵育，再加入TMB显色，最后检测吸光值。5权利要求4的方法，其中所述吸光值是OD450。6一种博卡病毒检测试剂盒，其包含权利要求1所述的博卡病毒特异性抗原表位肽。7权利要求6所述的试剂盒，还包含辣根过氧化物酶山羊抗人IGM和TMB。8权利要求1所述的博卡病毒特异性抗原表位肽用于检测博卡病毒抗体的非诊断用途。9针对权利要求1所述的特异性抗原表位肽的博卡病毒抗体。10权利要求9的博卡病毒抗体，其是通过将权利要求1所述的特异性抗原表位肽与KLH偶联再免疫小鼠而制备的。权利要求书CN104151399A1/8页3博卡病毒HBOV共有的特异性表位、。
4、其应用及其抗体技术领域0001本发明涉及博卡病毒，特别是可用于该病毒所致疾病诊断的表位，其应用及其抗体。背景技术0002人博卡病毒HUAMNBOCAVIRUS，HBOV是近年新发现的病毒，是目前已知的感染人类的第二种细小病毒。HBOV已发现四种基因型HBOV14，HBOV1于2005年在瑞典一位急性呼吸道感染儿童的鼻咽样本中发现。随后，又有三种博卡病毒HBOV24于20092010年在粪便样本中陆续被发现。0003人博卡病毒的感染呈世界性分布，病毒不仅可以在呼吸道、粪便样本中检出，而且在血清、扁桃体、唾液和尿液中均有检出。对呼吸道样本的PCR检测结果分析显示，根据国家、地区、检测方法和人群的不。
5、同，HBOV1的检出率约为219，其中在6个月2岁的婴幼儿中检出率最高，而在其他年龄组儿童和成人中检出率较低。因为HBOV1经常在上下呼吸道感染的样本中检出，被认为是与呼吸道感染有关的潜在的致病因子。与HBOV1不同，HBOV24经常在粪便标本中检出，极少会在呼吸道感染样本中检出，因此HBOV2和HBOV3可能与胃肠炎有关。在儿童肠道样本中，HBOV2检出率达26，其次是HBOV35和HBOV42。0004博卡病毒经常与其它病毒共检出，而且可以在鼻咽部持续存在，因此博卡病毒与疾病的关系一直受到争议。近年来，严重和致死性的博卡病毒感染陆续被报道。MITUI等在20092010年四例严重脑炎患者其。
6、中两例死亡的脑脊液和血清样本中检测到HBOV1和HBOV2的核酸，而在脑脊液中没有检测到其它任何病原体参见MITUIMT，TABIBSM，MATSUMOTOT，ETALDETECTIONOFHUMANBOCAVIRUSINTHECEREBROSPINALFLUIDOFCHILDRENWITHENCEPHALITISCLININFECTDIS，2012，549647；2010年，斯洛维尼亚一位20岁急性呼吸道感染患者发展为急性呼吸衰竭和气胸，在支气管抽吸物、鼻咽拭子和血浆样本中均检出高拷贝的HBOV1DNA，博卡病毒被证明为该患者唯一的病原体参见URSICT，STEYERA，KOPRIVAS，E。
7、TALHUMANBOCAVIRUSASTHECAUSEOFALIFETHREATENINGINFECTIONJCLINMICROBIOL，2011，49117981；2011年，德国一位严重呼吸道感染的婴儿也被证明为急性HBOV1的感染参见RW，M，VANKONINGSBRUGGENRIETSCHELS，ETALSEVEREHUMANBOCAVIRUSINFECTION，GERMANYEMERGINFECTDIS，2011，1723035。这些证据强烈支持博卡病毒可以单独作为致病因子。此外，荷兰的一项对从婴幼儿到青春期健康儿童的纵向研究也进一步证明HBOV1的感染与急性呼吸道疾病和耳炎具有高度。
8、相关性参见MERILUOTOM，HEDMANL，TANNERL，ETALASSOCIATIONOFHUMANBOCAVIRUS1INFECTIONWITHRESPIRATORYDISEASEINCHILDHOODFOLLOWUPSTUDY，FINLANDEMERGINFECTDIS2012，1826471。0005博卡病毒属线性单股DNA病毒，其基因组大小约为5KB，含有三个开放阅读框，分说明书CN104151399A2/8页4别编码非结构蛋白NS1、NP1和两个有重叠的衣壳蛋白VP1和VP2。NS1基因最早被转录、翻译，与病毒DNA的复制相关；VP1和VP2蛋白是病毒的结构蛋白，具有良好的抗。
9、原性，而非结构蛋白NP1的功能目前尚不清楚。VP2蛋白含有博卡病毒的主要抗原并可以形成病毒样颗粒VLP，博卡病毒VLP具有和病毒体相似的形态和抗原性，已经作为抗原成功地用于博卡病毒抗体的检测。0006对HBOV14的主要结构蛋白VP2的氨基酸序列比对结果显示，几种不同的博卡病毒VP2蛋白序列之间存在较高的同源性，例如，HBOV1VP2与HBOV24VP2的序列同源性约为7778，HBOV2VP2与HBOV34VP2的序列同源性约为8890，HBOV3VP2与HBOV4VP2的序列同源性约为907。近来的研究也证明HBOV14VP2VLPS之间存在血清学交叉反应参见KANTOLAK，HEDMAN。
10、L，ARTHURJ，ETALSEROEPIDEMIOLOGYOFHUMANBOCAVIRUSES14JINFECTDIS，2011，204140312；GUOL，WANGY，ZHOUH，ETALDIFFERENTIALSEROPREVALENCEOFHUMANBOCAVIRUSSPECIES14INBEIJING，CHINAPLOSONE，2012，7E39644。这说明在HBOV14VP2之间可能存在共同的抗原表位。0007目前，对博卡病毒的血清学诊断主要是利用VLP作为抗原进行ELISA分析，但是VLP的制备需要细胞培养过程，相对费力，而且耗时较长，制备不方便，不适合于大规模研究。而来源于。
11、博卡病毒主要结构蛋白VP2的抗原表位具有高度保守性和特异性。因此源于表位基础的ELISA方法可以对博卡病毒进行快速而简单的血清学诊断。然而，对于博卡病毒VP2蛋白的抗原表位研究没有相关报导。0008在本研究中，我们成功鉴定了两个在HBOV14中高度保守的特异性表位。在此基础上，我们建立了基于所述特异性表位的博卡病毒IGMELISA检测方法，该方法与基于VLP的博卡病毒IGMELISA检测方法具有良好的相关性。发明内容0009在本研究中，我们利用博卡病毒VP2基因片段噬菌体库对HBOV13VP2蛋白的抗体及博卡病毒阳性人血清进行筛选，获得四簇反应性较强的抗原表位，结合序列分析，合成2条优势抗原表。
12、位多肽，与KLH偶联后免疫小鼠，获得抗血清。通过酶联免疫吸附法和免疫印迹鉴定、序列比对等方法，确定了2条在HBOV14中通用的博卡病毒特异性抗原表位，并建立了基于所述特异性表位的博卡病毒IGM检测方法。0010本发明第一方面提供HBOV14中通用的博卡病毒特异性抗原表位肽，其序列为SEQIDNO1或SEQIDNO2。0011本发明第二方面提供一种检测博卡病毒抗体的非诊断方法，包括00121使样本与本发明第一方面所述的博卡病毒特异性抗原表位肽接触；00132检测抗原抗体反应，结果为阳性说明存在博卡病毒抗体。0014在一个实施方案中，所述样本是人血清。0015在另一个实施方案中，所述检测抗原抗体反。
13、应的过程为先加入辣根过氧化物酶山羊抗人IGM孵育，再加入TMB显色，最后检测吸光值。0016在又一个实施方案中，上述要检测的吸光值是OD450。0017本发明第三方面提供一种博卡病毒检测试剂盒，其包含本发明第一方面所述的博卡病毒特异性抗原表位肽。说明书CN104151399A3/8页50018在一个实施方案中，所述试剂盒还包含辣根过氧化物酶山羊抗人IGM和TMB。0019本发明第四方面提供本发明第一方面所述的博卡病毒特异性抗原表位肽用于检测博卡病毒抗体的非诊断用途。0020本发明第五方面提供针对本发明第一方面所述的特异性抗原表位肽的博卡病毒抗体。0021在一个实施方案中，所述博卡病毒抗体是通过。
14、将本发明第一方面所述的特异性抗原表位肽与KLH偶联再免疫小鼠而制备的。附图说明0022图1为博卡病毒VP2蛋白免疫优势表位筛选图。其中图最上面所示543个氨基酸的序列是HBOV1111BJ07株GENBANK号JQ240469VP2蛋白的氨基酸序列。0023图2为合成肽抗血清ANTIP1、ANTIP2的滴度A及其与HBOV14、人细小病毒B19和PARV4的VLP的反应B。0024图3为表位P1和P2关键氨基酸分析。其中“肽抑制物”是指实施例3中所述的各合成短肽。具体实施方式0025下面结合优选实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注。
15、明具体的实验方法，通常按照常规实验条件和方法，如分子克隆实验室手册SAMBROOK，ETALNEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，1989中所述方法或试剂制造商提供的方法。0026实施例1博卡病毒VP2蛋白免疫优势表位的鉴定0027本文中所用的HBOV13VP2基因源自博卡病毒阳性腹泻粪便样本111BJ07，211BJ07和46BJ07GENBANK号分别为JQ240469，JQ240470和HM132056。依据文献公开的方法分别构建HBOV13VP2基因的随机噬菌体库，分别命名为库HBOV1VP2，HBOV2VP2和HBOV3VP2。然后分别利用申请。
16、人制备的鼠抗HBOV13VP2抗体和博卡病毒阳性人血清对HBOV13VP2基因随机噬菌体库进行亲和筛选随机噬菌体库制备方法及筛选方法参见KHURANAS，SUGUITANALJR，RIVERAY，ETALANTIGENICFINGERPRINTINGOFH5N1AVIANINFLUENZAUSINGCONVALESCENTSERAANDMONOCLONALANTIBODIESREVEALSPOTENTIALVACCINEANDDIAGNOSTICTARGETSPLOSMED，20096E1000049。图1所示为分别用鼠抗HBOV13VP2抗体和博卡病毒阳性人血清通过亲和筛选获得的阳性克隆的表。
17、位分布情况，筛选出的抗原表位可以进一步分为四个簇I，II，III，IV。由图中所示结果可以看出，在120AA和162180AA附近存在优势表位。0028实施例2免疫优势表位的免疫原性和抗原特征002921肽与KLH的偶联0030根据博卡病毒抗原表位分布情况和HBOV1VP2蛋白序列分析，合成P1和P2两条优势抗原表位肽序列分别如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示，并分别与KLH偶联以增加多肽的免疫原性表1，用于免疫小鼠。肽的合成及与KLH的偶联委托上海生物工程技术有限公司完成。说明书CN104151399A4/8页60031表1免疫所用肽KLH偶联物的序列0032名称位置序列P1KLH12。
18、0AKLHCMSDTDIQDQQPDTVDAPQNTP2KLH162180AKLHCEHAYPNASHPWDEDVMPDL0033A表示多肽在HBOV1111BJ07株GENBANK号JQ240469VP2蛋白序列如SEQIDNO3所示中的相应位置003422免疫方案0035用上述KLH偶联多肽对68周龄的雌性BALB/C小鼠进行免疫。免疫方案如下共进行3次免疫，每次间隔14天。首次免疫时，将等体积肽KLH偶联物与弗氏完全佐剂混合，每只小鼠皮下注射100G肽KLH偶联物。加强免疫时，将等体积肽KLH偶联物与弗氏不完全佐剂混合，每只小鼠皮下注射50G肽KLH偶联物。在最后一次免疫14天后眼球采血。
19、。分离血清置于20保存备用。003623免疫血清滴度测定0037分别将P1和P2用包被液PH96的碳酸盐缓冲液碳酸钠159G，碳酸氢钠293G，加水稀释至1000ML进行稀释终浓度1G/孔后包被酶标板COSTAR公司产品，置4过夜，加入封闭液1BSA/PBS置37孵育2小时，用01PBST缓冲液洗涤5次，甩干洗涤液。每孔加入100L系列稀释从12,500开始进行倍比稀释至1160,000的相应小鼠免疫血清，同时设立未免疫小鼠血清作为对照，置37孵育1小时，甩掉液体，用01PBST缓冲液洗涤5次。然后每孔加入100L140,000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IGGSIGMA公司产品，置37孵育。
20、1小时，甩掉液体，用01PBST缓冲液洗涤5次。每孔加入100L3，3，5，5四甲基联苯胺TMB底物避光显色15分钟，加入50L2MH2SO4终止反应，测定450NM处的吸光值。结果见图2A，显示P1和P2均诱导出较强的抗体，以免疫前小鼠血清OD450NM的21倍作为CUTOFF值，抗体滴度均达1160,000，提示P1和P2均具有较强的免疫原性。003824免疫血清与HBOV14的VLP反应性及反应的特异性0039按照文献公开的方法制备HBOV14、细小病毒B19和PARV4VLPS，并进行超离纯化参见GUOL，WANGY，ZHOUH，ETALDIFFERENTIALSEROPREVALEN。
21、CEOFHUMANBOCAVIRUSSPECIES14INBEIJING，CHINAPLOSONE2012；76E39644。0040将100NG超离纯化的HBOV14、细小病毒B19和PARV4VLP，以及细胞对照分别进行12SDSPAGE后转至硝酸纤维素膜PALL公司产品。用5脱脂奶室温封闭2小时，与11,000稀释的免疫小鼠血清孵育过夜。膜经01PBST洗涤5次，加入110,000稀释的FLUOR800标记的山羊抗小鼠IGG二抗LICOR公司。用01PBST充分洗膜后，用近红外成像系统LICOR公司扫膜，用ODYSSEY软件进行分析。结果见图2B，免疫小鼠血清在进行11000稀释时，P1。
22、和P2免疫小鼠血清与HBOV14VLP均进行特异性反应，而与细小病毒B19和PARV4VLP没有反应，这说明P1和P2是HBOV14中共有的、特异性的抗原表位。说明书CN104151399A5/8页70041实施例3P1和P2合成肽表位的精细定位0042为了进一步确定P1和P2肽中起关键作用的氨基酸残基，我们合成了一系列肽段，结果见表2和表3。0043表2用于P1肽精细定位的肽段00440045表3用于P2肽精细定位的肽段说明书CN104151399A6/8页800460047竞争ELISA检测分别将P1和P2用包被液PH96的碳酸盐缓冲液碳酸钠159G，碳酸氢钠293G，加水稀释至1000M。
23、L进行稀释1G/孔后包被酶标板COSTAR公司产品，置4过夜，加入封闭液1BSA/PBS置37孵育2小时，用01PBST缓冲液洗涤5次，甩干洗涤液。同时将不同浓度3010PMOL/孔，3110PMOL/孔，3210PMOL/孔，3310PMOL/孔，3410PMOL/孔，3510PMOL/孔，3610PMOL/孔，3710PMOL/孔的上述合成肽在竞争ELISA中作为全长肽的抑制物与11000稀释的P1、P2小鼠抗血清实施例2制备混合，并设立未加合成肽的P1、P2小鼠抗血清作为对照，置4孵育2小时。将孵育后的肽抗体混合物及对照以100L/孔的量加入上述包被好的酶标板中，37孵育1小时，甩掉液体。
24、，用01PBST缓冲液洗涤5次。然后向每孔加入100L140,000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IGGSIGMA公司产品，置37孵育1小时，甩掉液体，用01PBST缓冲液洗涤5次。再向每孔加入100L3，3，5，5四甲基联苯胺TMB底物避光显色15分钟，再加入50L2MH2SO4终止反应，测定450NM处的吸光值。以不加合成短肽的孔对照在450NM处的吸光值为标准值100，得到不同浓度的各合成短肽的抗体结合百分比。0048根据不同肽段分别与P1、P2小鼠抗血清的ELISA反应结果图3，可以推断，P1的关键肽段为6IQDQQPDTVD15，关键氨基酸位点为Q7和P11；P2的关键肽段为161N。
25、ASHP171和176VMPDL180，关键氨基酸位点为N167，H170，P178，和L180。0049实施例4基于表位的博卡病毒IGM抗体检测方法的建立及与基于病毒样颗粒说明书CN104151399A7/8页9VLPIGM检测方法的比较0050分别将P1、P2、P1P2或博卡病毒VLP用包被液PH96的碳酸盐缓冲液碳酸钠159G，碳酸氢钠293G，加水稀释至1000ML进行稀释肽1G/孔，VLP50NG/孔后包被酶标板COSTAR公司产品，置4过夜，加入封闭液1BSA/PBS置37孵育2小时，用01PBST缓冲液洗涤5次。加入1200稀释的博卡病毒阳性人血清来自北京儿童医院，置37孵育1小。
26、时，甩掉液体，用01PBST缓冲液洗涤5次。然后每孔加入100L140,000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗人IGMSIGMA公司产品，置37孵育1小时，甩掉液体，用01PBST缓冲液洗涤5次。每孔加入100L3，3，5，5四甲基联苯胺TMB底物避光显色15分钟，加入50L2MH2SO4终止反应，测定450NM处的吸光值。0051根据文献报道的方法参见KAHNJS，KESEBIRD，COTMORESF，ETALSEROEPIDEMIOLOGYOFHUMANBOCAVIRUSDEFINEDUSINGRECOMBINANTVIRUSLIKEPARTICLESJINFECTDIS2008，1984150。
27、；HUSTEDTJW，CHRISTIEC，HUSTEDTMM，ETALSEROEPIDEMIOLOGYOFHUMANBOCAVIRUSINFECTIONINJAMAICAPLOSONE2012，7E38206确定CUTOFF值，首先以02作为假定的CUTOFF值，将所有低于02的吸光度值计算其均数和标准误，然后以均数3倍标准误作为CUTOFF值。对于基于病毒样颗粒的博卡病毒IGM检测方法，所述吸光值在018以上视为阳性，以下则视为阴性，对于基于表位的博卡病毒IGM抗体检测方法，所述吸光值在015以上视为阳性，以下则视为阴性。0052P1IGMELISA、P2IGMELISA、P1P2IGMEL。
28、ISA与VLPIGMELISA的比较见表4A，B，C，结果显示基于表位肽的IGM检测方法具有较好的敏感性和特异性，P1IGMELISA特异性和敏感性分别为974和727，P2IGMELISA特异性和敏感性分别为987和727，P1P2IGMELISA特异性和敏感性分别为974和909，统计学分析显示两种方法具有较好的相关性，且利用两条肽的检测效果优于单条肽的检测效果。0053表4合成肽IGM抗体检测方法与VLPIGM检测方法的比较A00540055敏感性727，特异性974；00562408，P001，两种方法具有相关性0057B00580059敏感性727，特异性987；说明书CN104151399A8/8页1000602466，P001，两种方法具有相关性0061C00620063敏感性909，特异性974；00642512，P001，两种方法具有相关性说明书CN104151399A101/4页1100010002序列表CN104151399A112/4页120003序列表CN104151399A123/4页130004序列表CN104151399A134/4页14序列表CN104151399A141/3页15图1说明书附图CN104151399A152/3页16图2说明书附图CN104151399A163/3页17图3说明书附图CN104151399A17。